L-精氨酸对大鼠胰腺移植缺血再灌注损伤的保护作用及其机制
【摘要】 目的 探讨L-精氨酸 (L-Arginine,L-Arg)对大鼠胰腺移植缺血再灌注(I/R)损伤的影响及其机制。方法 SD大鼠作为供、受体行胰腺移植术，给予不同方式处理：假手术组(Sham)：只行开腹术；对照组(Control)：只行胰腺移植术，不行预处理；缺血预处理组(IPC)：在供胰切取前阻断血供10min，然后再灌注10min；L-精氨酸组(L-Arg)：行胰腺移植术，再灌注前先经下腔静脉注射L-Arg 10mg/kg体重；L-硝基精氨酸甲酯组(L-NAME)：供胰切取时阻断血供10min，再灌注10min；然后行移植术，在再灌注前，先经下腔静脉缓慢注射L-NAME 10mg/kg体重。各组手术完成后，于再灌注6h检测血清淀粉酶、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)水平，胰腺细胞凋亡指数、胰腺细胞bcl-2蛋白表达情况和胰腺组织病理改变。结果 L-Arg和IPC都降低TNF-α水平(P<0.01)和细胞凋亡水平(P<0.01)，NO水平升高(P<0.01)。而L-NAME可阻断该保护效应。IPC和L-Arg均能激活bcl-2蛋白的表达。结论 L-Arg可以模拟IPC对大鼠胰腺移植I/R损伤的保护作用，其机制与合成NO，激活bcl-2基因的表达有关。
【关键词】 缺血；再灌注损伤；胰腺移植；一氧化氮
The protective effect and its mechanism of L-Arginine on ischemia reperfusion injury associated with rat pancreas transplantation
CHEN Hao, LI Shou-bai, CHENG Yun-feng, et al.
Clinical Center, National Institutes of Health,Bethesda, Maryland 20892,USA
【Abstract】 Objective To study the protective effect of L-Arginine on ischemia reperfusion (I/R) injury associated with rat pancreas transplantation and to define a possible mechanism.Methods On the model of pancreas transplantation, male SD rats were randomly assigned to five groups (20 rats in each group): Sham group(S): laparotomy only; Control group(C): pancreas transplantation only; IPC group: donor pancreas underwent ischemic preconditioning (IPC) procedure (10-min ischemia and 10-min reperfusion) before harvest and transplant；L-Arginine group: L-Arg (10mg/kg) was injected into recipient animal via inferior vena cava before transplant; L-NAME group: donor pancreas underwent (IPC) procedure (10-min ischemia and 10-min reperfusion) before harvest and L-NAME (10mg/kg) was injected into recipient animal via inferior vena cava before transplant. Serum amylase, tumor necrosis factor-α(TNF-α) and nitric oxide (NO) levels, apoptosis index of pancreas cells, bcl-2 protein and pancreatic pathological changes were determined 6 h after the operation was completed.Results The significantly decreased values of TNF-α and pancreas cells apoptosis levels but significantly increased NO content showed that L-arginine preconditioning can simulates the protective effects of IPC against I/R injury associated with pancreas transplantation, L-NAME can attenuate these protective effects. Both the IPC and L-arginine can decrease the apoptosis of pancreas cells by increasing bcl-2 gene expression.Conclusion L-arginine can simulate the protective effects of IPC against I/R injury associated with pancreas transplantation by producing NO and stimulating bcl-2 gene expression.
【Key words】 ischemia; reperfusion injury; pancreas transplantation; nitric oxide
缺血预处理(IPC)能有效预防组织器官的缺血再灌注(I/R)损伤，但其应用并不方便。预处理研究的重要进展之一，是从缺血预处理发展到药物预处理，即用药物代替缺血刺激，产生预处理样保护效应。
本实验在大鼠全胰十二指肠移植模型基础上，观察一氧化氮(NO)的前体物质L-精氨酸(L-Arginine,L-Arg)对I/R损伤的影响，并探讨其可能机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组和操作 雄性SD大鼠，体重250～300g，由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。将大鼠随机分为5组(n=20，供受体各10只)：假手术组(Sham组)：只行开腹术；对照组(Control组)：只行胰腺移植术，不行预处理；缺血预处理组(IPC组)：在供胰切取前作缺血预处理(阻断血供10min，然后再灌注10min)；L-精氨酸组(L-Arg组)：行胰腺移植术，在供胰再灌注前，先经下腔静脉注射L-Arg (Sigma公司)10mg/kg体重；L-硝基精氨酸甲酯组(L-NAME组)：供胰切取前作缺血预处理(阻断血供10 min，再灌注10 min)，然后行移植术，在供胰再灌注前，先经下腔静脉缓慢注射L-NAME (Sigma公司) 10mg/kg体重。 大鼠全胰十二指肠移植模型参照Lee等的方法[1]。大鼠于再灌注6h时，开腹取静脉血及胰腺组织送检。
1.2 观察指标及检测方法 (1)血清淀粉酶测定：由四川大学华西医院检验科日立2000型全身自动生化分析仪测定。(2)血NO水平，按一氧化氮合酶酶法试剂盒 (晶美生物工程有限公司)说明测定。(3)血TNF-α水平，按大鼠TNF-α ELISA试剂盒(晶美生物工程有限公司)说明测定。(4)胰腺bcl-2蛋白表达水平，按bcl-2免疫组化染色试剂盒(博士德生物工程有限公司)说明测定，结果判断：以细胞核膜、胞浆出现棕黄色颗粒为bcl-2基因蛋白表达阳性。根据细胞染色强度与阳性对照片(++)的比较分为强阳性(+++)，中等度阳性(++)，弱阳性(+)和阴性(-)；在同一切片中阳性细胞总数>30%判为阳性。如强阳性或(和)中等度阳性细胞总数>30%判为过表达。(5)胰腺细胞凋亡指数，由四川大学华西医院肿瘤中心流式细胞仪检测。 (6)胰腺病理，标本HE染色，送四川大学华西医院病理科。
1.3 统计学方法 所有数据均以均数±标准差(χ±s)表示，采用方差分析和q检验，计数资料用χ2检验，以P<0.05为差异有显著性标准。
2 结果
2.1 血清淀粉酶 各移植组水平明显高于Sham组(S组，P<0.01)；IPC组、L-Arg组水平略低于Control组(C组)和L-NAME组，但差异无统计学意义(P>0.05),见表1。
2.2 血NO水平 C组和L-NAME组明显低于S组(P<0.01)；L-Arg组明显高于S组(P<0.01)；IPC组和L-Arg组明显高于C组(P<0.01)；L-Arg组又高于IPC组(P<0.05)，见表2。
2.3 血TNF-α水平 各移植组水平均高于S组(P<0.01)；IPC组和L-Arg组明显低于C组(P<0.01)；L-NAME组高于IPC组(P<0.05),见表3。
2.4 bcl-2蛋白表达 bcl-2蛋白表达在IPC组和L-Arg组明显，C组和L-NAME组不明显(P<0.01),见表4。
表1 各组血清淀粉酶水平 (略)
注：与S组比较，*P<0.01
表2 各组血NO浓度(略)
注：与S组比较，*P<0.01；与C组比较，#P<0.01；与IPC组比较，△P<0.05
表3 各组血TNF-α水平(略)
注：与S组比较，*P<0.01；与C组比较，#P<0.01；与IPC组比较，△P<0.05
表4 各组bcl-2蛋白表达情况(略)
注：与S组比较，*P<0.01；与C组比较，#P<0.01
2.5 胰腺细胞凋亡指数 各移植组细胞凋亡水平明显高于S组(P<0.01)；IPC组和L-Arg组水平明显低于C组(P<0.01)；L-NAME组水平高于IPC组(P<0.05)，见表5。
表5 各组胰腺细胞凋亡水平(略)
注：与S组比较，*P<0.01；与C组比较，#P<0.01；与IPC组比较，△P<0.05
2.6 病理学检查结果 S组胰腺小叶腺泡组织分布均匀，间质无水肿、充血、无炎性细胞浸润;C组和L-NAME组胰腺充血明显，水肿中度，浸润的炎性细胞明显增多；IPC组和L-Arg处理组充血水肿及炎性细胞浸润程度有所改善。
3 讨论
胰腺移植术后由于胰腺的I/R损伤，胰腺炎的发生率为10%～30%，并导致局部和全身并发症，严重者引起移植物早期或晚期无功能甚至死亡[2]。本研究结果表明，在再灌注早期使用L-Arg，可以明显减轻供胰I/R损伤，其保护效果和IPC没有明显差异，表现为血清淀粉酶、TNF-α水平、细胞凋亡指数及病理检查较对照组改善。但使用NOS抑制剂L-NAME抑制内源性NO的合成后，IPC基本上失去了保护作用。说明L-Arg对胰腺的保护作用是通过NO生成而实现的。
通过细胞凋亡，可以防止因细胞坏死随之而来的炎症反应。然而，胰腺细胞凋亡的增加对再灌注后供腺功能的恢复显然是重要的障碍。细胞凋亡受基因调控，bcl-2基因是抑制凋亡的主要基因[3]。本实验发现bcl-2在IPC组和L-Arg组表达明显，相应地胰腺细胞凋亡程度较对照组为轻；而在L-NAME组表达不明显，同时L-NAME组胰腺细胞凋亡程度与对照组差异也无显著性。说明IPC和L-Arg通过刺激bcl-2基因的表达，从而减轻了细胞凋亡程度。
综上所述，外源性L-Arg可以改善大鼠胰腺移植时供胰的I/R损伤，其可能机制是通过提高NO水平，刺激bcl-2基因表达，抑制TNF-α的合成和胰腺细胞的凋亡，从而产生IPC样保护效应，但对其进一步的作用方式还有待探讨。
【参考文献】
1 Lee S, Tung KSK, Koopmans H, et al. Pancreaticoduodenal transplantation in the rat. Transplantation,1972,13: 421-424.
2 Grewal HP, Garland L, Novak K, et al. Risk factors of postimplantation pancreatitis and pancreatic thrombosis in pancreas transplant recipients. Transplantation,1992,56: 609-613.
3 Avao Y, Otsuki Y, Kataoka S, et al. Multiple subcellular localization of bcl-2 detection in nuclear outer membrane, endoplasmic reticulum membrane, and mitochondrial membrane. Cancer Res,1994,54: 2468-2471.
(编辑：丁剑辉)
作者单位： Clinical Center, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892, USA
130052 吉林长春，吉林省人民医院外科
National Heart, Lung and Blood Institute, NIH 20892, USA
610000 四川成都，四川大学华西医院外科, http://www.100md.com(陈浩，李寿柏，程韵枫，胡伟明，田伯乐，张肇达)
【关键词】 缺血；再灌注损伤；胰腺移植；一氧化氮
The protective effect and its mechanism of L-Arginine on ischemia reperfusion injury associated with rat pancreas transplantation
CHEN Hao, LI Shou-bai, CHENG Yun-feng, et al.
Clinical Center, National Institutes of Health,Bethesda, Maryland 20892,USA
【Abstract】 Objective To study the protective effect of L-Arginine on ischemia reperfusion (I/R) injury associated with rat pancreas transplantation and to define a possible mechanism.Methods On the model of pancreas transplantation, male SD rats were randomly assigned to five groups (20 rats in each group): Sham group(S): laparotomy only; Control group(C): pancreas transplantation only; IPC group: donor pancreas underwent ischemic preconditioning (IPC) procedure (10-min ischemia and 10-min reperfusion) before harvest and transplant；L-Arginine group: L-Arg (10mg/kg) was injected into recipient animal via inferior vena cava before transplant; L-NAME group: donor pancreas underwent (IPC) procedure (10-min ischemia and 10-min reperfusion) before harvest and L-NAME (10mg/kg) was injected into recipient animal via inferior vena cava before transplant. Serum amylase, tumor necrosis factor-α(TNF-α) and nitric oxide (NO) levels, apoptosis index of pancreas cells, bcl-2 protein and pancreatic pathological changes were determined 6 h after the operation was completed.Results The significantly decreased values of TNF-α and pancreas cells apoptosis levels but significantly increased NO content showed that L-arginine preconditioning can simulates the protective effects of IPC against I/R injury associated with pancreas transplantation, L-NAME can attenuate these protective effects. Both the IPC and L-arginine can decrease the apoptosis of pancreas cells by increasing bcl-2 gene expression.Conclusion L-arginine can simulate the protective effects of IPC against I/R injury associated with pancreas transplantation by producing NO and stimulating bcl-2 gene expression.
【Key words】 ischemia; reperfusion injury; pancreas transplantation; nitric oxide
缺血预处理(IPC)能有效预防组织器官的缺血再灌注(I/R)损伤，但其应用并不方便。预处理研究的重要进展之一，是从缺血预处理发展到药物预处理，即用药物代替缺血刺激，产生预处理样保护效应。
本实验在大鼠全胰十二指肠移植模型基础上，观察一氧化氮(NO)的前体物质L-精氨酸(L-Arginine,L-Arg)对I/R损伤的影响，并探讨其可能机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组和操作 雄性SD大鼠，体重250～300g，由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。将大鼠随机分为5组(n=20，供受体各10只)：假手术组(Sham组)：只行开腹术；对照组(Control组)：只行胰腺移植术，不行预处理；缺血预处理组(IPC组)：在供胰切取前作缺血预处理(阻断血供10min，然后再灌注10min)；L-精氨酸组(L-Arg组)：行胰腺移植术，在供胰再灌注前，先经下腔静脉注射L-Arg (Sigma公司)10mg/kg体重；L-硝基精氨酸甲酯组(L-NAME组)：供胰切取前作缺血预处理(阻断血供10 min，再灌注10 min)，然后行移植术，在供胰再灌注前，先经下腔静脉缓慢注射L-NAME (Sigma公司) 10mg/kg体重。 大鼠全胰十二指肠移植模型参照Lee等的方法[1]。大鼠于再灌注6h时，开腹取静脉血及胰腺组织送检。
1.2 观察指标及检测方法 (1)血清淀粉酶测定：由四川大学华西医院检验科日立2000型全身自动生化分析仪测定。(2)血NO水平，按一氧化氮合酶酶法试剂盒 (晶美生物工程有限公司)说明测定。(3)血TNF-α水平，按大鼠TNF-α ELISA试剂盒(晶美生物工程有限公司)说明测定。(4)胰腺bcl-2蛋白表达水平，按bcl-2免疫组化染色试剂盒(博士德生物工程有限公司)说明测定，结果判断：以细胞核膜、胞浆出现棕黄色颗粒为bcl-2基因蛋白表达阳性。根据细胞染色强度与阳性对照片(++)的比较分为强阳性(+++)，中等度阳性(++)，弱阳性(+)和阴性(-)；在同一切片中阳性细胞总数>30%判为阳性。如强阳性或(和)中等度阳性细胞总数>30%判为过表达。(5)胰腺细胞凋亡指数，由四川大学华西医院肿瘤中心流式细胞仪检测。 (6)胰腺病理，标本HE染色，送四川大学华西医院病理科。
1.3 统计学方法 所有数据均以均数±标准差(χ±s)表示，采用方差分析和q检验，计数资料用χ2检验，以P<0.05为差异有显著性标准。
2 结果
2.1 血清淀粉酶 各移植组水平明显高于Sham组(S组，P<0.01)；IPC组、L-Arg组水平略低于Control组(C组)和L-NAME组，但差异无统计学意义(P>0.05),见表1。
2.2 血NO水平 C组和L-NAME组明显低于S组(P<0.01)；L-Arg组明显高于S组(P<0.01)；IPC组和L-Arg组明显高于C组(P<0.01)；L-Arg组又高于IPC组(P<0.05)，见表2。
2.3 血TNF-α水平 各移植组水平均高于S组(P<0.01)；IPC组和L-Arg组明显低于C组(P<0.01)；L-NAME组高于IPC组(P<0.05),见表3。
2.4 bcl-2蛋白表达 bcl-2蛋白表达在IPC组和L-Arg组明显，C组和L-NAME组不明显(P<0.01),见表4。
表1 各组血清淀粉酶水平 (略)
注：与S组比较，*P<0.01
表2 各组血NO浓度(略)
注：与S组比较，*P<0.01；与C组比较，#P<0.01；与IPC组比较，△P<0.05
表3 各组血TNF-α水平(略)
注：与S组比较，*P<0.01；与C组比较，#P<0.01；与IPC组比较，△P<0.05
表4 各组bcl-2蛋白表达情况(略)
注：与S组比较，*P<0.01；与C组比较，#P<0.01
2.5 胰腺细胞凋亡指数 各移植组细胞凋亡水平明显高于S组(P<0.01)；IPC组和L-Arg组水平明显低于C组(P<0.01)；L-NAME组水平高于IPC组(P<0.05)，见表5。
表5 各组胰腺细胞凋亡水平(略)
注：与S组比较，*P<0.01；与C组比较，#P<0.01；与IPC组比较，△P<0.05
2.6 病理学检查结果 S组胰腺小叶腺泡组织分布均匀，间质无水肿、充血、无炎性细胞浸润;C组和L-NAME组胰腺充血明显，水肿中度，浸润的炎性细胞明显增多；IPC组和L-Arg处理组充血水肿及炎性细胞浸润程度有所改善。
3 讨论
胰腺移植术后由于胰腺的I/R损伤，胰腺炎的发生率为10%～30%，并导致局部和全身并发症，严重者引起移植物早期或晚期无功能甚至死亡[2]。本研究结果表明，在再灌注早期使用L-Arg，可以明显减轻供胰I/R损伤，其保护效果和IPC没有明显差异，表现为血清淀粉酶、TNF-α水平、细胞凋亡指数及病理检查较对照组改善。但使用NOS抑制剂L-NAME抑制内源性NO的合成后，IPC基本上失去了保护作用。说明L-Arg对胰腺的保护作用是通过NO生成而实现的。
通过细胞凋亡，可以防止因细胞坏死随之而来的炎症反应。然而，胰腺细胞凋亡的增加对再灌注后供腺功能的恢复显然是重要的障碍。细胞凋亡受基因调控，bcl-2基因是抑制凋亡的主要基因[3]。本实验发现bcl-2在IPC组和L-Arg组表达明显，相应地胰腺细胞凋亡程度较对照组为轻；而在L-NAME组表达不明显，同时L-NAME组胰腺细胞凋亡程度与对照组差异也无显著性。说明IPC和L-Arg通过刺激bcl-2基因的表达，从而减轻了细胞凋亡程度。
综上所述，外源性L-Arg可以改善大鼠胰腺移植时供胰的I/R损伤，其可能机制是通过提高NO水平，刺激bcl-2基因表达，抑制TNF-α的合成和胰腺细胞的凋亡，从而产生IPC样保护效应，但对其进一步的作用方式还有待探讨。
【参考文献】
1 Lee S, Tung KSK, Koopmans H, et al. Pancreaticoduodenal transplantation in the rat. Transplantation,1972,13: 421-424.
2 Grewal HP, Garland L, Novak K, et al. Risk factors of postimplantation pancreatitis and pancreatic thrombosis in pancreas transplant recipients. Transplantation,1992,56: 609-613.
3 Avao Y, Otsuki Y, Kataoka S, et al. Multiple subcellular localization of bcl-2 detection in nuclear outer membrane, endoplasmic reticulum membrane, and mitochondrial membrane. Cancer Res,1994,54: 2468-2471.
(编辑：丁剑辉)
作者单位： Clinical Center, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892, USA
130052 吉林长春，吉林省人民医院外科
National Heart, Lung and Blood Institute, NIH 20892, USA
610000 四川成都，四川大学华西医院外科, http://www.100md.com(陈浩，李寿柏，程韵枫，胡伟明，田伯乐，张肇达)