缺血预处理对大鼠急性肾缺血/再灌注损伤的保护作用及其对细胞凋亡的影响
Protective effect of ischemic preconditioning on rat with acute renal ischemia/reperfusion injury and its roles in cell apoptosis
TAN Hua, WANG HanMin, PAN Long, XU YueQing, HE BeiJun
1Department of Nephrology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China， 2Department of Nephrology, Affiliated Hospital, Shaanxi Traditional Chinese Medicine College, Xianyang 712000, China
【Abstract】 AIM: To investigate the protective effect of ischemic preconditioning (IPC) on rats with acute renal ischemia/reperfusion (I/R) injury, and its effects on cell apoptosis and expression of Bcl2 and Bax in the cells, and the possible mechanism of renal protection affected by IPC against I/R injury. METHODS: Fifty Wister rats of either sex were randomly divided into 5 groups: Group A (control group) in which sham operation was performed; group B (I/R group), in which ischemia was made by tying both renal arteries for 45 min, followed by 24hour reperfusion; group C (IPC1 group) in which both renal arteries were first tied for 10 min then untied for 10 min, then followed the procedures as in group B; group D (IPC2 group) in which both renal arteries were first tied for 10 min then untied for 10 min and the process was repeated 2 times before the procedures in group B; group E (IPC3 group) in which both renal arteries were first tied for 10 min then untied for 10 min and the process was repeated 3 times before the procedures in group B. Apoptosis was examined by means of terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The expression of Bcl2 and Bax protein was measured by immunohistochemical technique. RESULTS: Compared with those in the control group, the apoptotic index (3.1±2.3 vs 28.8±4.4, P<0.05) and the expression of Bax (183.0±12.8 vs 163.0±17.1, P<0.05) and Bcl2 (184.0±9.6 vs 179.0±13.0, P<0.05)were higher, and the Bcl2/Bax ratio decreased significantly(1.00±0.08 vs 1.10±0.07, P<0.05)in I/R group. Compared with those in the I/R group, the apoptotic index (28.8±4.4 vs 15.6±3.8, P<0.05) and the levels of expression of Bax decreased(163.0±17.1 vs 174.0±13.7, P<0.05), and the expression of Bcl2 (179.0±13.0 vs 170.0±15.1, P<0.05) and the Bcl2/Bax ratio increased (1.10±0.07 vs 0.98±0.11, P<0.05)in IPC3 group. CONCLUSION: IPC3 can protect kidneys from I/R injury, partly through the inhibition of apoptosis by regulating Bcl2 and Bax expression.
【Keywords】 ischemic preconditioning; renal ischemia; reperfusion injury; apoptosis; Bcl2; Bax
【摘要】 目的: 观察缺血预处理(IPC)对大鼠急性肾缺血/再灌注损伤的保护作用及其对细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl2和Bax表达的影响，探讨其作用的可能机制. 方法: 双肾动脉缺血45 min再灌注24 h制备成急性肾缺血/再灌注动物模型，50只Wister大鼠随机分为对照假手术组、缺血/再灌注组、缺血预处理组(IPC1，IPC2，IPC3). 原位末端标记法检测细胞凋亡指数，免疫组化法测定Bcl2和Bax表达. 结果: 与对照组比较，缺血/再灌注组凋亡指数增加(3.1±2.3 vs 28.8±4.4, P<0.05)，Bax(183.0±12.8 vs 163.0±17.1, P<0.05)表达明显增强，Bcl2增加(184.0±9.6 vs 179.0±13.0, P<0.05)，Bcl2/Bax比值明显降低(1.00±0.08 vs 1.10±0.07, P<0.05). 缺血/再灌注组比较，IPC3组肾小管凋亡指数明显下降(28.8±4.4 vs 15.6±3.8, P<0.05)，Bcl2表达增强(179.0±13.0 vs 170.0±15.1, P<0.05)，Bax表达减弱(163.0±17.1 vs 174.0±13.7, P<0.05)，Bcl2/Bax比值增高(1.10±0.07 vs 0.98±0.11, P<0.05). 结论: 缺血预处理(IPC3)具有抗肾脏缺血/再灌注损伤作用，其作用机制可能是通过调控Bcl2/Bax介导的肾脏缺血/再灌注细胞凋亡而实现.
【关键词】 缺血预处理; 肾脏缺血; 再灌注损伤; 细胞凋亡; Bcl2; Bax
0引言
缺血预处理(IPC)是指预先反复短暂的缺血/再灌注，诱导机体产生内源性保护机制，减轻脏器损伤[1,2]. 缺血预处理对肾脏是否有保护作用，目前意见尚不统一. 我们观察不同方式缺血预处理对大鼠急性肾缺血/再灌注损伤的保护作用及其对肾小管上皮细胞凋亡、凋亡相关蛋白Bcl2和Bax的影响，探讨其作用机制.
1材料和方法
1.1材料
健康成年Wister大鼠，雌雄不拘，体质量200~240 g，由第四军医大学实验动物中心提供. 原位细胞凋亡(TUNEL)试剂盒、Bcl2, Bax mAb、免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒，均由武汉博士德生物工程有限公司提供.
1.2方法
1.2.1动物模型及分组50只Wister大鼠，随机等分为5组，每组10只. A组：假手术对照组；B组：缺血再灌注(I/R)组；C组：1次缺血预处理(IPC1)组；D组：2次缺血预处理(IPC2)组；E组：3次缺血预处理(IPC3)组. 30 g/L戊巴比妥钠30~50 mg/kg腹腔注射麻醉，经腹正中切口暴露双侧肾脏，对照组仅游离双侧肾脏，暴露60 min后再缝合；I/R组同时阻断双侧肾动脉，45 min后实行再灌注；IPC1组夹闭双肾动脉10 min，再灌注10 min后操作同I/R组；IPC2组双肾缺血、再灌各10 min，反复2次后操作同I/R组；IPC3组双肾缺血、再灌注各10 min，反复3次后操作同I/R组. 24 h后戊巴比妥钠麻醉，活体摘取左肾并采血，肾组织用100 mL/L中性甲醛固定做原位凋亡及免疫组化检测.
1.2.2生化检测BUN和Cr用日立7179全自动生化分析仪测定.
1.2.3凋亡细胞的原位标记检测切片常规脱蜡入水，经30 mL/L H2O2室温10 min消除内源性过氧化酶，蛋白酶K消化，加入TDT和DigdUTP 37℃ 2 h，封闭后加生物素化地高辛抗体，洗涤，加SABC，DAB显色，光镜观察凋亡细胞，胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞. 于凋亡细胞分布区域，光镜200倍下每张切片随机选择5个视野，对凋亡阳性细胞计数，以肾小管上皮凋亡阳性细胞数占总肾小管细胞数的百分比作为肾小管细胞凋亡指数(apoptotic index，AI).
1.2.4免疫组织化学切片常规脱蜡入水，30 mL/L H2O2室温10 min消除内源性过氧化酶，微波进行抗原修复，加兔抗鼠Bcl2(1∶100稀释)、Bax抗体(1∶150稀释)4℃过夜，次日依次滴加羊抗兔IgG二抗和SABC，最后在显微镜下用DAB显色. 同时采用删除第一抗体的方法作为阴性对照. 胞质中有棕色颗粒者为阳性细胞. 光镜200倍下每张切片随机选择5个视野，用HPIAS1000图像分析系统计算A值作为半定量参数，测量Bcl2及Bax表达.
统计学处理：实验数据用x±s表示. 采用SPSS 10.0统计软件，多组间比较采用方差分析，P<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1各组BUN及Cr水平变化经方差分析可知，A，B，C，D和E 5组BUN及Cr总体均数不全相等，经多个样本均数间的多重比较可知，B组与A组比较，BUN及Cr水平显著增高(P<0.05). C组、D组与B组比较，BUN及Cr水平轻度下降，无显著性差异(P>0.05)；E组与B组比较，BUN及Cr水平显著下降(P<0.05). E组较C组、D组BUN及Cr水平明显下降(P<0.05，Tab 1).表1各组血BUN及Cr水平的比较(略)
2.2肾小管细胞凋亡指数变化经方差分析可知，A，B，C，D和E 5组AI总体均数不全相等，进一步分析可知，A组偶见凋亡细胞，B组较A组凋亡指数明显增高(P<0.05)，凋亡细胞多数是远端肾小管上皮细胞，少数为近曲肾小管上皮细胞和间质，肾小球未见凋亡细胞(Fig 1)；C组、D组AI较B组无显著差异(P>0.05)；E组AI较B组显著下降(P<0.05, Fig 2). E组AI较C组、D组AI明显下降(P<0.05, Tab 2).
2.3Bcl2和Bax蛋白表达的变化A值越小，表示阳性产物Bcl2和Bax蛋白表达越强烈；Bcl2 A/Bax A越高，表示Bcl2/Bax越低. 与A组比较，B组Bcl2表达增强(P<0.05)， Bax表达显著增强(P<0.05)， Bcl2/Bax比值显著下降(P<0.05)；C组、D组Bcl2和Bax表达及Bcl2/Bax比值较B组无显著差异(P>0.05)；E组较B组Bcl2表达显著增强(P<0.05)，Bax表达明显下降(P<0.05)，Bcl2/Bax比值增加(P<0.05). E组较C组、D组Bcl2表达显著增强(P<0.05)，Bax表达明显下降(P<0.05)，Bcl2/Bax比值增加(P<0.05, Tab 2).表2各组肾小管上皮细胞凋亡指数及Bcl2 A值、Bax A值、Bcl2 A/Bax A的比较(略)
3讨论
20世纪80年代Murry等首次提出缺血预处理的概念. 缺血预处理可使机体快速产生自身保护机制，这一现象存在于许多器官，而且器官之间有交叉缺血耐受现象[2]. 关于缺血预处理对肾脏的保护作用一直存在分歧，但仍有研究证明缺血预处理对肾脏有明显的保护作用[3]. 本结果显示，IPC3组BUN和Cr水平较缺血/再灌注组显著降低，而IPC1，IPC2组无明显差异，说明以连续3次缺血10 min、再灌注10 min的IPC3方式效果最好. IPC3可明显减轻肾脏缺血/再灌注损伤，改善肾功能，具有良好的肾脏保护作用.
缺血/再灌注损伤是缺血性急性肾功能衰竭的重要损伤环节，也是肾移植中影响移植肾早期功能恢复的主要因素. 大量的研究证实，细胞凋亡是缺血性急性肾衰肾小管上皮细胞死亡的重要形式[4]. 本结果显示，缺血/再灌注损伤组肾功能损伤明显，肾小管上皮细胞凋亡指数显著增高，而IPC3组肾功能损伤减轻，凋亡指数下降，表明IPC3可明显减少缺血/再灌注损伤所致肾小管上皮细胞凋亡，其肾脏保护作用与抑制肾小管上皮细胞凋亡密切相关.
缺血预处理效应的分子机制复杂，凋亡相关基因的变化是其机制之一. bcl2是主要的抑凋亡基因，它在线粒体上可直接调节膜上通透性转换孔来调节线粒体膜的通透性[5]，以阻止细胞色素C释放入胞质而抑制细胞凋亡. bax亦为bcl2家族基因，具有促凋亡的功能. Bcl2/Bax的比值是决定细胞命运的一个关键因素，Bcl2/Bax的比值增加，细胞趋于存活，比值下降，细胞趋于凋亡. 缺血预处理减少缺血/再灌注细胞凋亡机制，目前还不十分清楚. 可能与蛋白激酶C的激活和降低缺血期细胞内酸化有关. 蛋白激酶C能激活空泡质子ATP酶，从而增加细胞非NHE机制排H+，还能抑制Bax在缺血区的表达. 另外，缺血预处理时产生大量的氧自由基，激活Mr为38 000的丝裂素活化蛋白激酶(P38MAPK)和核因子κB，从而促进大量Bcl2的表达[6]. 本实验结果显示，IPC3可明显增强肾小管上皮细胞Bcl2蛋白表达，减弱Bax蛋白表达，使Bcl2/Bax比值升高. 表明Bcl2和Bax参与了IPC3的抗凋亡过程，IP3对缺血/再灌注肾小管上皮细胞凋亡的抑制作用可能与调节Bcl2/Bax途径有关.
综上所述，缺血预处理可通过调控Bcl2/Bax蛋白表达而抑制肾脏缺血/再灌注肾小管上皮细胞凋亡，从而改善肾功能. 对缺血预处理在肾脏缺血/再灌注损伤过程中细胞凋亡及凋亡相关蛋白的研究，对于寻找肾脏保护的有效治疗途径具有积极意义.
【参考文献】
[1] 熊利泽，路志红. 脑缺血预处理研究进展[J]. 第四军医大学学报，2002；23(15)：1347-1348.
Xiong LZ, Lu ZH. Investigation progress for cerebral ischemia pretreatment[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2002; 23(15):1347-1348.
[2] de Zeeuw S, Lameris TW, Duncker DJ, et al. Cardioprotection in pigs by exogenous norepinephrine but not by cerebral ischemiainduced release of endogenous norepinephrine[J]. Stroke, 2001; 32(3):767-774.
[3] Ogawa T, Mimura Y, Hiki N, et al. Ischemic preconditioning ameliorates functional disturbance and impaired renal perfusion in rat ischemiareperfused kidneys[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2000; 27(12):997-1001.
[4] Nogae S, Miyazaki M, Kobayashi N, et al. Induction of apoptosis in ischemiareperfusion model of mouse kidney: Possible involvement of Fas[J]. J Am Soc Nephrol, 1998; 9(4):620-631.
[5] Rajesh KG, Sasaguri S, Zhitian Z, et al. Second window of ischemic preconditioning regulates mitochondrial permeability transition pore by enhancing Bcl2 expression[J]. Cardiovasc Res, 2003; 59(2):297-307.
[6] Maulik N, Engelman RM, Rousou JA, et al. Ischemic preconditioning reduces apoptosis by upregulating antideath gene bcl2[J]. Circulation, 1999; 100(19 Suppl):Ⅱ369-Ⅱ375.
基金项目：陕西省教育厅2002年科研计划基金(02JK188)
通讯作者：王汉民. Tel.(029)83375197 Email.xijingsh@fmmu.edu.cn
作者简介：谭华(1968)，女(汉族)，四川省乐山市人. 本科，主治医师，2001级基金班学员(武警四川总队乐山医院肾内科)(导师王汉民). Tel.(0833)2446219Email.tanhua1968@sohu.com
(1第四军医大学西京医院肾内科，陕西 西安 710033，2陕西中医学院附属医院肾内科，陕西 咸阳 712000)
编辑袁天峰, http://www.100md.com(谭华，王汉民，潘龙，徐月清，贺琲珺)
TAN Hua, WANG HanMin, PAN Long, XU YueQing, HE BeiJun
1Department of Nephrology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China， 2Department of Nephrology, Affiliated Hospital, Shaanxi Traditional Chinese Medicine College, Xianyang 712000, China
【Abstract】 AIM: To investigate the protective effect of ischemic preconditioning (IPC) on rats with acute renal ischemia/reperfusion (I/R) injury, and its effects on cell apoptosis and expression of Bcl2 and Bax in the cells, and the possible mechanism of renal protection affected by IPC against I/R injury. METHODS: Fifty Wister rats of either sex were randomly divided into 5 groups: Group A (control group) in which sham operation was performed; group B (I/R group), in which ischemia was made by tying both renal arteries for 45 min, followed by 24hour reperfusion; group C (IPC1 group) in which both renal arteries were first tied for 10 min then untied for 10 min, then followed the procedures as in group B; group D (IPC2 group) in which both renal arteries were first tied for 10 min then untied for 10 min and the process was repeated 2 times before the procedures in group B; group E (IPC3 group) in which both renal arteries were first tied for 10 min then untied for 10 min and the process was repeated 3 times before the procedures in group B. Apoptosis was examined by means of terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The expression of Bcl2 and Bax protein was measured by immunohistochemical technique. RESULTS: Compared with those in the control group, the apoptotic index (3.1±2.3 vs 28.8±4.4, P<0.05) and the expression of Bax (183.0±12.8 vs 163.0±17.1, P<0.05) and Bcl2 (184.0±9.6 vs 179.0±13.0, P<0.05)were higher, and the Bcl2/Bax ratio decreased significantly(1.00±0.08 vs 1.10±0.07, P<0.05)in I/R group. Compared with those in the I/R group, the apoptotic index (28.8±4.4 vs 15.6±3.8, P<0.05) and the levels of expression of Bax decreased(163.0±17.1 vs 174.0±13.7, P<0.05), and the expression of Bcl2 (179.0±13.0 vs 170.0±15.1, P<0.05) and the Bcl2/Bax ratio increased (1.10±0.07 vs 0.98±0.11, P<0.05)in IPC3 group. CONCLUSION: IPC3 can protect kidneys from I/R injury, partly through the inhibition of apoptosis by regulating Bcl2 and Bax expression.
【Keywords】 ischemic preconditioning; renal ischemia; reperfusion injury; apoptosis; Bcl2; Bax
【摘要】 目的: 观察缺血预处理(IPC)对大鼠急性肾缺血/再灌注损伤的保护作用及其对细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl2和Bax表达的影响，探讨其作用的可能机制. 方法: 双肾动脉缺血45 min再灌注24 h制备成急性肾缺血/再灌注动物模型，50只Wister大鼠随机分为对照假手术组、缺血/再灌注组、缺血预处理组(IPC1，IPC2，IPC3). 原位末端标记法检测细胞凋亡指数，免疫组化法测定Bcl2和Bax表达. 结果: 与对照组比较，缺血/再灌注组凋亡指数增加(3.1±2.3 vs 28.8±4.4, P<0.05)，Bax(183.0±12.8 vs 163.0±17.1, P<0.05)表达明显增强，Bcl2增加(184.0±9.6 vs 179.0±13.0, P<0.05)，Bcl2/Bax比值明显降低(1.00±0.08 vs 1.10±0.07, P<0.05). 缺血/再灌注组比较，IPC3组肾小管凋亡指数明显下降(28.8±4.4 vs 15.6±3.8, P<0.05)，Bcl2表达增强(179.0±13.0 vs 170.0±15.1, P<0.05)，Bax表达减弱(163.0±17.1 vs 174.0±13.7, P<0.05)，Bcl2/Bax比值增高(1.10±0.07 vs 0.98±0.11, P<0.05). 结论: 缺血预处理(IPC3)具有抗肾脏缺血/再灌注损伤作用，其作用机制可能是通过调控Bcl2/Bax介导的肾脏缺血/再灌注细胞凋亡而实现.
【关键词】 缺血预处理; 肾脏缺血; 再灌注损伤; 细胞凋亡; Bcl2; Bax
0引言
缺血预处理(IPC)是指预先反复短暂的缺血/再灌注，诱导机体产生内源性保护机制，减轻脏器损伤[1,2]. 缺血预处理对肾脏是否有保护作用，目前意见尚不统一. 我们观察不同方式缺血预处理对大鼠急性肾缺血/再灌注损伤的保护作用及其对肾小管上皮细胞凋亡、凋亡相关蛋白Bcl2和Bax的影响，探讨其作用机制.
1材料和方法
1.1材料
健康成年Wister大鼠，雌雄不拘，体质量200~240 g，由第四军医大学实验动物中心提供. 原位细胞凋亡(TUNEL)试剂盒、Bcl2, Bax mAb、免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒，均由武汉博士德生物工程有限公司提供.
1.2方法
1.2.1动物模型及分组50只Wister大鼠，随机等分为5组，每组10只. A组：假手术对照组；B组：缺血再灌注(I/R)组；C组：1次缺血预处理(IPC1)组；D组：2次缺血预处理(IPC2)组；E组：3次缺血预处理(IPC3)组. 30 g/L戊巴比妥钠30~50 mg/kg腹腔注射麻醉，经腹正中切口暴露双侧肾脏，对照组仅游离双侧肾脏，暴露60 min后再缝合；I/R组同时阻断双侧肾动脉，45 min后实行再灌注；IPC1组夹闭双肾动脉10 min，再灌注10 min后操作同I/R组；IPC2组双肾缺血、再灌各10 min，反复2次后操作同I/R组；IPC3组双肾缺血、再灌注各10 min，反复3次后操作同I/R组. 24 h后戊巴比妥钠麻醉，活体摘取左肾并采血，肾组织用100 mL/L中性甲醛固定做原位凋亡及免疫组化检测.
1.2.2生化检测BUN和Cr用日立7179全自动生化分析仪测定.
1.2.3凋亡细胞的原位标记检测切片常规脱蜡入水，经30 mL/L H2O2室温10 min消除内源性过氧化酶，蛋白酶K消化，加入TDT和DigdUTP 37℃ 2 h，封闭后加生物素化地高辛抗体，洗涤，加SABC，DAB显色，光镜观察凋亡细胞，胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞. 于凋亡细胞分布区域，光镜200倍下每张切片随机选择5个视野，对凋亡阳性细胞计数，以肾小管上皮凋亡阳性细胞数占总肾小管细胞数的百分比作为肾小管细胞凋亡指数(apoptotic index，AI).
1.2.4免疫组织化学切片常规脱蜡入水，30 mL/L H2O2室温10 min消除内源性过氧化酶，微波进行抗原修复，加兔抗鼠Bcl2(1∶100稀释)、Bax抗体(1∶150稀释)4℃过夜，次日依次滴加羊抗兔IgG二抗和SABC，最后在显微镜下用DAB显色. 同时采用删除第一抗体的方法作为阴性对照. 胞质中有棕色颗粒者为阳性细胞. 光镜200倍下每张切片随机选择5个视野，用HPIAS1000图像分析系统计算A值作为半定量参数，测量Bcl2及Bax表达.
统计学处理：实验数据用x±s表示. 采用SPSS 10.0统计软件，多组间比较采用方差分析，P<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1各组BUN及Cr水平变化经方差分析可知，A，B，C，D和E 5组BUN及Cr总体均数不全相等，经多个样本均数间的多重比较可知，B组与A组比较，BUN及Cr水平显著增高(P<0.05). C组、D组与B组比较，BUN及Cr水平轻度下降，无显著性差异(P>0.05)；E组与B组比较，BUN及Cr水平显著下降(P<0.05). E组较C组、D组BUN及Cr水平明显下降(P<0.05，Tab 1).表1各组血BUN及Cr水平的比较(略)
2.2肾小管细胞凋亡指数变化经方差分析可知，A，B，C，D和E 5组AI总体均数不全相等，进一步分析可知，A组偶见凋亡细胞，B组较A组凋亡指数明显增高(P<0.05)，凋亡细胞多数是远端肾小管上皮细胞，少数为近曲肾小管上皮细胞和间质，肾小球未见凋亡细胞(Fig 1)；C组、D组AI较B组无显著差异(P>0.05)；E组AI较B组显著下降(P<0.05, Fig 2). E组AI较C组、D组AI明显下降(P<0.05, Tab 2).
2.3Bcl2和Bax蛋白表达的变化A值越小，表示阳性产物Bcl2和Bax蛋白表达越强烈；Bcl2 A/Bax A越高，表示Bcl2/Bax越低. 与A组比较，B组Bcl2表达增强(P<0.05)， Bax表达显著增强(P<0.05)， Bcl2/Bax比值显著下降(P<0.05)；C组、D组Bcl2和Bax表达及Bcl2/Bax比值较B组无显著差异(P>0.05)；E组较B组Bcl2表达显著增强(P<0.05)，Bax表达明显下降(P<0.05)，Bcl2/Bax比值增加(P<0.05). E组较C组、D组Bcl2表达显著增强(P<0.05)，Bax表达明显下降(P<0.05)，Bcl2/Bax比值增加(P<0.05, Tab 2).表2各组肾小管上皮细胞凋亡指数及Bcl2 A值、Bax A值、Bcl2 A/Bax A的比较(略)
3讨论
20世纪80年代Murry等首次提出缺血预处理的概念. 缺血预处理可使机体快速产生自身保护机制，这一现象存在于许多器官，而且器官之间有交叉缺血耐受现象[2]. 关于缺血预处理对肾脏的保护作用一直存在分歧，但仍有研究证明缺血预处理对肾脏有明显的保护作用[3]. 本结果显示，IPC3组BUN和Cr水平较缺血/再灌注组显著降低，而IPC1，IPC2组无明显差异，说明以连续3次缺血10 min、再灌注10 min的IPC3方式效果最好. IPC3可明显减轻肾脏缺血/再灌注损伤，改善肾功能，具有良好的肾脏保护作用.
缺血/再灌注损伤是缺血性急性肾功能衰竭的重要损伤环节，也是肾移植中影响移植肾早期功能恢复的主要因素. 大量的研究证实，细胞凋亡是缺血性急性肾衰肾小管上皮细胞死亡的重要形式[4]. 本结果显示，缺血/再灌注损伤组肾功能损伤明显，肾小管上皮细胞凋亡指数显著增高，而IPC3组肾功能损伤减轻，凋亡指数下降，表明IPC3可明显减少缺血/再灌注损伤所致肾小管上皮细胞凋亡，其肾脏保护作用与抑制肾小管上皮细胞凋亡密切相关.
缺血预处理效应的分子机制复杂，凋亡相关基因的变化是其机制之一. bcl2是主要的抑凋亡基因，它在线粒体上可直接调节膜上通透性转换孔来调节线粒体膜的通透性[5]，以阻止细胞色素C释放入胞质而抑制细胞凋亡. bax亦为bcl2家族基因，具有促凋亡的功能. Bcl2/Bax的比值是决定细胞命运的一个关键因素，Bcl2/Bax的比值增加，细胞趋于存活，比值下降，细胞趋于凋亡. 缺血预处理减少缺血/再灌注细胞凋亡机制，目前还不十分清楚. 可能与蛋白激酶C的激活和降低缺血期细胞内酸化有关. 蛋白激酶C能激活空泡质子ATP酶，从而增加细胞非NHE机制排H+，还能抑制Bax在缺血区的表达. 另外，缺血预处理时产生大量的氧自由基，激活Mr为38 000的丝裂素活化蛋白激酶(P38MAPK)和核因子κB，从而促进大量Bcl2的表达[6]. 本实验结果显示，IPC3可明显增强肾小管上皮细胞Bcl2蛋白表达，减弱Bax蛋白表达，使Bcl2/Bax比值升高. 表明Bcl2和Bax参与了IPC3的抗凋亡过程，IP3对缺血/再灌注肾小管上皮细胞凋亡的抑制作用可能与调节Bcl2/Bax途径有关.
综上所述，缺血预处理可通过调控Bcl2/Bax蛋白表达而抑制肾脏缺血/再灌注肾小管上皮细胞凋亡，从而改善肾功能. 对缺血预处理在肾脏缺血/再灌注损伤过程中细胞凋亡及凋亡相关蛋白的研究，对于寻找肾脏保护的有效治疗途径具有积极意义.
【参考文献】
[1] 熊利泽，路志红. 脑缺血预处理研究进展[J]. 第四军医大学学报，2002；23(15)：1347-1348.
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基金项目：陕西省教育厅2002年科研计划基金(02JK188)
通讯作者：王汉民. Tel.(029)83375197 Email.xijingsh@fmmu.edu.cn
作者简介：谭华(1968)，女(汉族)，四川省乐山市人. 本科，主治医师，2001级基金班学员(武警四川总队乐山医院肾内科)(导师王汉民). Tel.(0833)2446219Email.tanhua1968@sohu.com
(1第四军医大学西京医院肾内科，陕西 西安 710033，2陕西中医学院附属医院肾内科，陕西 咸阳 712000)
编辑袁天峰, http://www.100md.com(谭华，王汉民，潘龙，徐月清，贺琲珺)