结核分枝杆菌Ag85BESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力
Immunity responses and protective efficacy induced by Mycobacterium tuberculosis Ag85BESAT6 fusion protein in mice
SHI ChangHong， FAN XiongLin， BAI YinLan， XUE Ying, ZHANG Hai， XU ZhiKai
Department of Microbiology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To evaluate humoral and cellmediated immune response by Ag85B and ESAT6 fusion proteins and to test their protective efficacy against Mycobacterium tuberculosis (MTB) challenge. METHODS: BALB/c mice were immunized three times at a 2week interval subcutaneously on the mouse back respectively with fusion protein Ag85BESAT6 and ESAT6Ag85B that were transferred to membrane beforehand. The spleen lymphocytes of the immunized mice stimulation index (SI) were measured by MTT method and the level of secreted IFNγwhich upon antigenspecific stimulation was detected by ELISA. The fusion proteins vaccinated BALB/c mice were intravenously infected with 105 CFU MTB H37Rv. Four weeks later the numbers of CFU in spleens were determined. RESULTS: The titer of sera specific antibody in BALB/c mice immunized with fused expression protein Ag85BESAT6 was 1∶1000 and that of ESAT6Ag85B was 1∶5000. The SI of fusion proteins immunized groups was significantly higher (which was 2.40±0.17 and 2.60±0.25 for Ag85BESAT6 and ESAT6Ag85B immunized groups respectively) than that of saline immunized group (0.90±0.21). The IFNγlevels in culture supernatant of spleen lymphocytes from the fusion proteins immunized mice were (3.51±0.30) μg/L and (4.05±0.41) μg/L for Ag85BESAT6 and ESAT6Ag85B immunized groups respectively, significant different from those of saline immunized group (0.50±0.25) μg/L, P<0.05, which were lower than that of Bacillus Calmette Guerin (BCG) immunized group (5.55±0.31) μg/L. Compared with the saline immunized mice(bacteria load was 6.31±0.13) dramatic reductions of MTB replication were observed in the spleen (bacteria load was 5.04±0.11 and 5.15±0.29 respectively, P<0.05) of BALB/c mice immunized with fusion proteins following a subsequent challenge, but the protection efficacy of the mice immunized with Ag85BESAT6 or ESAT6Ag85B was higher than that of BCG vaccination group. CONCLUSION: Ag85B and ESAT6 fusion protein can be used as novel components of the new TB vaccine.
【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis ; vaccines； Ag85B； ESAT6； recombinant fusion proteins
【摘要】 目的： 研究Ag85B与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护力. 方法： 采用皮下包埋的方法，将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠3次，每次间隔2 wk，用MTB培养上清滤液蛋白(culture filtrate proteins, CFP)作为抗原，ELASA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度. 为了检测融合蛋白免疫小鼠引起的细胞免疫应答，最后一次免疫完成后4 wk，取一部分免疫小鼠分离脾淋巴细胞，体外用抗原刺激，MTT法检测淋巴细胞刺激反应，ELISA检测悬液中IFNγ水平. 另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv，4 wk后计数脾脏细菌负荷数. 结果： Ag85BESAT6 蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶1000，ESAT6Ag85B 蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶5000. 融合蛋白Ag85BESAT6和ESAT6Ag85B免疫组淋巴细胞刺增殖指数分别为2.40±0.17 和2.60±0.25，而生理盐水组只有0.90±0.21；相对应的IFNγ含量分别为(3.51±0.30) μg/L和(4.05±0.41) μg/L，显著高与生理盐水对照组(0.50±0.25) μg/L， P<0.05，但不及BCG免疫组(5.55±0.31) μg/L. 与生理盐水免疫组(细菌负荷6.31±0.13)相比较，融合蛋白免疫的BALB/c小鼠，对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷分别为5.04±0.11和5.15±0.29, P<0.05)，但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微. 结论： Ag85B与ESAT6融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.
【关键词】 分支杆菌，结核；疫苗；抗原85B；ESAT6；重组融合蛋白质类
0引言
包含免疫优势蛋白Ag85B和早期分泌蛋白ESAT6的重组亚单位疫苗所提供的保护效力与曾经接触过环境分枝杆菌无关，这个发现证实亚单位疫苗不受致敏作用的影响而能刺激保护性T细胞应答，从而使得这种疫苗可能在BCG免疫无效的地区应用[1]. 亚单位疫苗在小鼠中证实有效，可产生与BCG相同的免疫效果. 为了全面评估我们表达的Ag85B与ESAT6融合蛋白的免疫学特性[2]，我们研究了两种融合蛋白Ag85BESAT6 和ESAT6Ag85B在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答水平，同时测定免疫小鼠对MTB毒株H37Rv攻击的保护力.
1材料和方法
1.1材料
MTB H37Rv毒株： 由陕西省结核病防治研究所王瑞副主任技师惠赠. BCG疫苗株： 陕西省生物制品研究所出品. 鼠IFNγELISA检测试剂盒(GENEZYME公司)，潮霉素(GIBCO BRL公司). 7H9液体培养基，BCG培养增强剂(albumindextrosecatalase, ADC)和RPMI1640培养基均购自GIBCO公司. MTB的CFP由本室制备. 羊抗鼠IgGHRP购自华美生物公司. 6~8周龄BALB/c小鼠，雌性，由第四军医大学实验动物中心提供，饲养于该中心P3级感染实验室.
1.2方法
1.2.1MTB毒株H37Rv的培养和定量取罗氏培养基中保存的MTB毒株H37Rv接种到7H9培养基(含100 g/L ADC和0.5 g/L Tween80)，37℃振摇培养3 wk，5000 r/min离心10 min，收集细菌，保存于-20℃备用. 用7H9液体培养基系列稀释浓缩液，接种于罗氏培养基37℃培养2 wk，计数浓缩液细菌的CFU.
1.2.2BCG的培养和定量取BCG疫苗株接种到7H9液体培养基(含100 g/L ADC和0.5 g/L Tween 80)，相同方法培养、收集BCG，并计数细菌的CFU.
1.2.3融合蛋白的大量制备和转膜取AZpProEX HTEF和EZpProEX HTAF阳性克隆[2]，活化后分别接种到1000 mL LB培养液中，37℃振摇培养至对数生长期，IPTG诱导，集菌，先进行SDSPAGE，然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，剪下表达位置的条带.
1.2.4免疫动物分组实验共分4组，每组10只小鼠. 一组用Ag85BESAT6融合蛋白转膜条带免疫BALB/c小鼠；一组用ESAT6Ag85B融合蛋白免疫BALB/c小鼠. 两组免疫剂量均为10份条带/只，包埋于小鼠腹股沟处皮下，共免疫3次，每次间隔2 wk，收集小鼠血清，用CFP作为抗原，ELASA测定免疫小鼠血清特异性抗体滴度,同时设BCG和生理盐水对照组. 最后一次免疫结束后4 wk，进行以下实验： 每组取5只小鼠，用于测定淋巴细胞SI和IFNγ水平；其余5只用于毒株攻击实验.
1.2.5脾脏淋巴细胞的分离与制备将免疫的小鼠断颈处死，无菌取脾脏，置于平皿内200目的钢网上，用注射器针芯研磨，并加入RPMI1640培养液冲洗. 将上述细胞悬液转入2倍体积的淋巴细胞分离液，1000 r/min离心20 min. 吸取中间单核细胞层，用RPIM1640液洗涤两次后计数.
1.2.6特异性淋巴细胞增殖实验将分离的淋巴细胞浓度调整至5×108/ L，在96孔板中用100 mL/L FCS的RPMI1640完全培养液培养，200 μL/孔，同时实验组每孔加入25 μL MTB CFP(25 mg/L溶于PBS，本室制备)，对照组不加CFP，调零孔不加脾细胞，37℃ 50 mL/L CO2孵箱培养68 h后，每孔加20 μL MTT(5 g/L，溶于PBS，pH 7.2，过滤除菌)，继续培养4 h后弃上清，加DMSO 150 μL/孔，振荡10 min，测定A490 nm值. 结果用刺激指数SI=A(实验组)/A(对照组)表示.
1.2.7IFNγ的诱生及含量的测定5×109/ L脾细胞在24孔板用含10 mL/L FCS的 RPMI1640完全培养液中培养，800 μL/孔，同时加入MTB CFP 100 μL/孔，37℃ 50 mL/L CO2孵箱培养72 h，收集培养液，5000 r/min离心5 min，取上清，-20℃冻存备检. 参照试剂盒说明(夹心ELISA法)测定各标本所含IFNγ浓度.
1.2.8MTBH37Rv毒株的攻击实验最后一次免疫完成后4 wk，用MTB毒株H37Rv经尾静脉感染小鼠，剂量为105 CFU/只，4 wk后，断颈处死小鼠，脾脏匀浆，计数细菌CFU.
统计学处理： 实验数据以x±s表示,统计分析采用单因素方差分析，两两比较采用LSDt检验, P<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1小鼠体内特异性抗体滴度Ag85BESAT6 融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶1000，ESAT6Ag85B融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度达1∶5000.
2.2抗原特异性脾脏淋巴细胞增殖实验分离免疫小鼠的脾脏淋巴细胞，在体外用CFP抗原刺激，测定了淋巴细胞的增殖反应，与生理盐水对照组(SI为0.90±0.21)相比较两种融合蛋白Ag85BESAT6和ESAT6Ag85B免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖明显，SI分别为2.40±0.17和2.60±0.25(P<0.05)，BCG免疫组SI为3.70±0.28，高于两种融合蛋白免疫组(P<0.05, Fig 1).
2.3脾脏淋巴细胞中诱生的IFNγ水平Ag85BESAT6和ESAT6Ag85B两种蛋白免疫的小鼠的脾淋巴细胞悬液，体外用CFP刺激，其悬液IFNγ含量分别为(3.51±0.30)μg/L和(4.05±0.41)μg/L，与生理盐水对照组(0.50±0.25)μg/L相比较有明显增加(P<0.05)，但不及BCG免疫组[(5.55±0.31)μg/L, P<0.05, Fig 2].
2.4免疫小鼠对MTB毒株攻击时的抵抗作用免疫完成后4 wk，H37Rv经尾静脉感染BALB/c小鼠，4 wk后计数脾脏细菌负荷数，与生理盐水免疫组(细菌负荷数6.31±0.13)相比较，融合蛋白Ag85BESAT6和ESAT6Ag85B免疫的BALB/c小鼠，对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷数分别为5.04±0.11和5.15±0.29, n=5, P<0.05)，但与BCG免疫组(细菌负荷数为4.09±0.29)相比较脾脏细菌负荷减少甚微.
3讨论
MTB的CFP可诱导产生T细胞免疫反应，从培养上清液中所得到的单个蛋白、蛋白混合物以及构成这些蛋白T细胞表位的基因工程肽具有同样的功能. 这些免疫反应成分Mr主要集中在4000~11 000和26 000~35 000范围内，已知的有早期分泌蛋白Ag85B复合物、ESAT6和MPT64[3]，由于集中针对那些在免疫保护效应中发挥关键作用的蛋白，因此避免了无关抗原对免疫应答干扰. 选择几种抗原制备的亚单位疫苗可诱导强烈的特异性免疫应答，并不受先前接触分枝杆菌的影响[1].
机体对结核病(tuberculosis, TB)的免疫保护需要多种类型的T细胞参与，而单个蛋白构成的亚单位疫苗产生的特异性体液和细胞免疫应答是针对每一组分抗原的，难于达到上述目的，因此新型TB疫苗着重于融合多个免疫表位[4]. 我们采用两种纯化的Ag85B与ESAT6融合蛋白，分别免疫小鼠，特异性抗体滴度分别达到1∶1000和1∶5000，显著高于文献[5]中抗体的滴度. 夹心ELASA的方法确定了Ag85B与ESAT6融合表达产物的滴度存在着差异，说明Ag85B和ESAT6的不同连接方式影响表达产物的免疫学特性，有可能大分子量的Ag85B影响了ESAT6的表达，或者说小分子量的ESAT6更有利于启动转录和翻译，这在亚单位疫苗的应用和动物实验中需作进一步的研究. 融合蛋白免疫三次后，小鼠特异性淋巴细胞增殖指数显著升高，说明淋巴细胞被有效活化，融合蛋白Ag85BESAT6和ESAT6Ag85B免疫小鼠诱生的IFNγ水平显著高于生理盐水对照组(P<0.05)，提示这两种融合基因可能是TB疫苗中理想的候选基因. MTB毒株攻击实验中，与生理盐水组相比较，Ag85BESAT6免疫组使得细菌数由6.31±0.13降为5.04±0.11，而ESAT6Ag85B免疫组降为5.15±0.29，有效控制了MTB的感染，但与BCG免疫组相比免疫保护力还是有一定差距.
研究发现，单独使用结核杆菌短期在培养液中分离纯化的分泌型蛋白免疫动物，只会产生很弱的免疫应答，亚单位疫苗必须配以适宜的佐剂多次接种才能达到效果[6]. 本研究中，使用蛋白电泳分离的目的条带免疫动物也是常用的免疫方法，一方面可得到大量纯化的蛋白，另一方面硝酸纤维素膜作为载体和佐剂具有良好的免疫效果，具有很强的免疫调节作用，可刺激产生IL2, IFNγ和IL12，是本室较常用的一种免疫策略. 两种融合蛋白诱导的保护力有限，分析原因，可能是因为保护性抗原种类不多，难以诱导产生广泛而全面的细胞免疫应答；同时蛋白质在体内的滞留时间短并且其产生的免疫应答的持续时间也较短，需选择合适的剂量[7]，多次免疫才能达到有效的保护水平.
【参考文献】
[1]Doherty TM, Andersen P. Tuberculosis vaccine development [J]. Curr Opin Pulm Med, 2002;8(3):183-187.
[2]师长宏,范雄林,徐志凯,等. 结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85BESAT6的融合表达及纯化[J]. 中华结核和呼吸杂志,2004;27(2): 89-92.
Shi CH， Fan XL， Xu ZK， et al. Mycobacterium tuberculosis secreting protein Ag85B and ESAT6 fused expression and purifed [J]. Chin J Tuber Respir Dis, 2004;27(2): 89-92.
[3]Amoudy M, Abal W, Oftung R, et al.Comparison of antigenspecific TCell responses of tuberculosis patients using complex or single antigens of Mycobacterium tuberculosis [J]. Scand J Immunol,1998;48(5):1365-3083.
[4]Warwick JB, Umaimathan P. Improving vaccines against tuberculosis[J]. Immunol Cell Biol, 2003; 81:34-45.
[5]薛莹,李元,史皆然,等. 结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性[J]. 第四军医大学学报, 2002;23(13):1203-1205.
Xue Y, Li Y, Shi JR, et al. Immunobiological properties of secretory protein Ag85B from Mycobacterium tuberculosis[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2002;23(13): 1203-1205.
[6]Sinha RK, Khuller GK.The protective efficacy of a liposomal encapsulated 30 kDa secretory protein of Mycobacterium tuberculosis H37Rv against tuberculosis in mice [J]. Immunol Cell Biol, 1997;75:461-466.
[7]Elhay, Martin J, Ersen P, et al. Immunological requirements for a subunit vaccine against tuberculosis [J]. Immunol Cell Biol, 1997; 75(6): 595-603.
基金项目：国家863课题资助项目(2001AA215201); 国家自然科学基金资助项目(30170855)
通讯作者：徐志凯. Tel. (029)83374523Email. Zhikaixu@fmmu.edu.cn
作者简介：师长宏(1973),男(汉族),陕西省眉县人.博士生(导师徐志凯)，讲师. Tel. (029)83374527Email.changhong@fmmu.edu.cn
(第四军医大学基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033)
编辑甄志强, 百拇医药(师长宏，范雄林，柏银兰，薛莹，张海，徐志凯)
SHI ChangHong， FAN XiongLin， BAI YinLan， XUE Ying, ZHANG Hai， XU ZhiKai
Department of Microbiology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To evaluate humoral and cellmediated immune response by Ag85B and ESAT6 fusion proteins and to test their protective efficacy against Mycobacterium tuberculosis (MTB) challenge. METHODS: BALB/c mice were immunized three times at a 2week interval subcutaneously on the mouse back respectively with fusion protein Ag85BESAT6 and ESAT6Ag85B that were transferred to membrane beforehand. The spleen lymphocytes of the immunized mice stimulation index (SI) were measured by MTT method and the level of secreted IFNγwhich upon antigenspecific stimulation was detected by ELISA. The fusion proteins vaccinated BALB/c mice were intravenously infected with 105 CFU MTB H37Rv. Four weeks later the numbers of CFU in spleens were determined. RESULTS: The titer of sera specific antibody in BALB/c mice immunized with fused expression protein Ag85BESAT6 was 1∶1000 and that of ESAT6Ag85B was 1∶5000. The SI of fusion proteins immunized groups was significantly higher (which was 2.40±0.17 and 2.60±0.25 for Ag85BESAT6 and ESAT6Ag85B immunized groups respectively) than that of saline immunized group (0.90±0.21). The IFNγlevels in culture supernatant of spleen lymphocytes from the fusion proteins immunized mice were (3.51±0.30) μg/L and (4.05±0.41) μg/L for Ag85BESAT6 and ESAT6Ag85B immunized groups respectively, significant different from those of saline immunized group (0.50±0.25) μg/L, P<0.05, which were lower than that of Bacillus Calmette Guerin (BCG) immunized group (5.55±0.31) μg/L. Compared with the saline immunized mice(bacteria load was 6.31±0.13) dramatic reductions of MTB replication were observed in the spleen (bacteria load was 5.04±0.11 and 5.15±0.29 respectively, P<0.05) of BALB/c mice immunized with fusion proteins following a subsequent challenge, but the protection efficacy of the mice immunized with Ag85BESAT6 or ESAT6Ag85B was higher than that of BCG vaccination group. CONCLUSION: Ag85B and ESAT6 fusion protein can be used as novel components of the new TB vaccine.
【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis ; vaccines； Ag85B； ESAT6； recombinant fusion proteins
【摘要】 目的： 研究Ag85B与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护力. 方法： 采用皮下包埋的方法，将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠3次，每次间隔2 wk，用MTB培养上清滤液蛋白(culture filtrate proteins, CFP)作为抗原，ELASA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度. 为了检测融合蛋白免疫小鼠引起的细胞免疫应答，最后一次免疫完成后4 wk，取一部分免疫小鼠分离脾淋巴细胞，体外用抗原刺激，MTT法检测淋巴细胞刺激反应，ELISA检测悬液中IFNγ水平. 另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv，4 wk后计数脾脏细菌负荷数. 结果： Ag85BESAT6 蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶1000，ESAT6Ag85B 蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶5000. 融合蛋白Ag85BESAT6和ESAT6Ag85B免疫组淋巴细胞刺增殖指数分别为2.40±0.17 和2.60±0.25，而生理盐水组只有0.90±0.21；相对应的IFNγ含量分别为(3.51±0.30) μg/L和(4.05±0.41) μg/L，显著高与生理盐水对照组(0.50±0.25) μg/L， P<0.05，但不及BCG免疫组(5.55±0.31) μg/L. 与生理盐水免疫组(细菌负荷6.31±0.13)相比较，融合蛋白免疫的BALB/c小鼠，对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷分别为5.04±0.11和5.15±0.29, P<0.05)，但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微. 结论： Ag85B与ESAT6融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.
【关键词】 分支杆菌，结核；疫苗；抗原85B；ESAT6；重组融合蛋白质类
0引言
包含免疫优势蛋白Ag85B和早期分泌蛋白ESAT6的重组亚单位疫苗所提供的保护效力与曾经接触过环境分枝杆菌无关，这个发现证实亚单位疫苗不受致敏作用的影响而能刺激保护性T细胞应答，从而使得这种疫苗可能在BCG免疫无效的地区应用[1]. 亚单位疫苗在小鼠中证实有效，可产生与BCG相同的免疫效果. 为了全面评估我们表达的Ag85B与ESAT6融合蛋白的免疫学特性[2]，我们研究了两种融合蛋白Ag85BESAT6 和ESAT6Ag85B在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答水平，同时测定免疫小鼠对MTB毒株H37Rv攻击的保护力.
1材料和方法
1.1材料
MTB H37Rv毒株： 由陕西省结核病防治研究所王瑞副主任技师惠赠. BCG疫苗株： 陕西省生物制品研究所出品. 鼠IFNγELISA检测试剂盒(GENEZYME公司)，潮霉素(GIBCO BRL公司). 7H9液体培养基，BCG培养增强剂(albumindextrosecatalase, ADC)和RPMI1640培养基均购自GIBCO公司. MTB的CFP由本室制备. 羊抗鼠IgGHRP购自华美生物公司. 6~8周龄BALB/c小鼠，雌性，由第四军医大学实验动物中心提供，饲养于该中心P3级感染实验室.
1.2方法
1.2.1MTB毒株H37Rv的培养和定量取罗氏培养基中保存的MTB毒株H37Rv接种到7H9培养基(含100 g/L ADC和0.5 g/L Tween80)，37℃振摇培养3 wk，5000 r/min离心10 min，收集细菌，保存于-20℃备用. 用7H9液体培养基系列稀释浓缩液，接种于罗氏培养基37℃培养2 wk，计数浓缩液细菌的CFU.
1.2.2BCG的培养和定量取BCG疫苗株接种到7H9液体培养基(含100 g/L ADC和0.5 g/L Tween 80)，相同方法培养、收集BCG，并计数细菌的CFU.
1.2.3融合蛋白的大量制备和转膜取AZpProEX HTEF和EZpProEX HTAF阳性克隆[2]，活化后分别接种到1000 mL LB培养液中，37℃振摇培养至对数生长期，IPTG诱导，集菌，先进行SDSPAGE，然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，剪下表达位置的条带.
1.2.4免疫动物分组实验共分4组，每组10只小鼠. 一组用Ag85BESAT6融合蛋白转膜条带免疫BALB/c小鼠；一组用ESAT6Ag85B融合蛋白免疫BALB/c小鼠. 两组免疫剂量均为10份条带/只，包埋于小鼠腹股沟处皮下，共免疫3次，每次间隔2 wk，收集小鼠血清，用CFP作为抗原，ELASA测定免疫小鼠血清特异性抗体滴度,同时设BCG和生理盐水对照组. 最后一次免疫结束后4 wk，进行以下实验： 每组取5只小鼠，用于测定淋巴细胞SI和IFNγ水平；其余5只用于毒株攻击实验.
1.2.5脾脏淋巴细胞的分离与制备将免疫的小鼠断颈处死，无菌取脾脏，置于平皿内200目的钢网上，用注射器针芯研磨，并加入RPMI1640培养液冲洗. 将上述细胞悬液转入2倍体积的淋巴细胞分离液，1000 r/min离心20 min. 吸取中间单核细胞层，用RPIM1640液洗涤两次后计数.
1.2.6特异性淋巴细胞增殖实验将分离的淋巴细胞浓度调整至5×108/ L，在96孔板中用100 mL/L FCS的RPMI1640完全培养液培养，200 μL/孔，同时实验组每孔加入25 μL MTB CFP(25 mg/L溶于PBS，本室制备)，对照组不加CFP，调零孔不加脾细胞，37℃ 50 mL/L CO2孵箱培养68 h后，每孔加20 μL MTT(5 g/L，溶于PBS，pH 7.2，过滤除菌)，继续培养4 h后弃上清，加DMSO 150 μL/孔，振荡10 min，测定A490 nm值. 结果用刺激指数SI=A(实验组)/A(对照组)表示.
1.2.7IFNγ的诱生及含量的测定5×109/ L脾细胞在24孔板用含10 mL/L FCS的 RPMI1640完全培养液中培养，800 μL/孔，同时加入MTB CFP 100 μL/孔，37℃ 50 mL/L CO2孵箱培养72 h，收集培养液，5000 r/min离心5 min，取上清，-20℃冻存备检. 参照试剂盒说明(夹心ELISA法)测定各标本所含IFNγ浓度.
1.2.8MTBH37Rv毒株的攻击实验最后一次免疫完成后4 wk，用MTB毒株H37Rv经尾静脉感染小鼠，剂量为105 CFU/只，4 wk后，断颈处死小鼠，脾脏匀浆，计数细菌CFU.
统计学处理： 实验数据以x±s表示,统计分析采用单因素方差分析，两两比较采用LSDt检验, P<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1小鼠体内特异性抗体滴度Ag85BESAT6 融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶1000，ESAT6Ag85B融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度达1∶5000.
2.2抗原特异性脾脏淋巴细胞增殖实验分离免疫小鼠的脾脏淋巴细胞，在体外用CFP抗原刺激，测定了淋巴细胞的增殖反应，与生理盐水对照组(SI为0.90±0.21)相比较两种融合蛋白Ag85BESAT6和ESAT6Ag85B免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖明显，SI分别为2.40±0.17和2.60±0.25(P<0.05)，BCG免疫组SI为3.70±0.28，高于两种融合蛋白免疫组(P<0.05, Fig 1).
2.3脾脏淋巴细胞中诱生的IFNγ水平Ag85BESAT6和ESAT6Ag85B两种蛋白免疫的小鼠的脾淋巴细胞悬液，体外用CFP刺激，其悬液IFNγ含量分别为(3.51±0.30)μg/L和(4.05±0.41)μg/L，与生理盐水对照组(0.50±0.25)μg/L相比较有明显增加(P<0.05)，但不及BCG免疫组[(5.55±0.31)μg/L, P<0.05, Fig 2].
2.4免疫小鼠对MTB毒株攻击时的抵抗作用免疫完成后4 wk，H37Rv经尾静脉感染BALB/c小鼠，4 wk后计数脾脏细菌负荷数，与生理盐水免疫组(细菌负荷数6.31±0.13)相比较，融合蛋白Ag85BESAT6和ESAT6Ag85B免疫的BALB/c小鼠，对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷数分别为5.04±0.11和5.15±0.29, n=5, P<0.05)，但与BCG免疫组(细菌负荷数为4.09±0.29)相比较脾脏细菌负荷减少甚微.
3讨论
MTB的CFP可诱导产生T细胞免疫反应，从培养上清液中所得到的单个蛋白、蛋白混合物以及构成这些蛋白T细胞表位的基因工程肽具有同样的功能. 这些免疫反应成分Mr主要集中在4000~11 000和26 000~35 000范围内，已知的有早期分泌蛋白Ag85B复合物、ESAT6和MPT64[3]，由于集中针对那些在免疫保护效应中发挥关键作用的蛋白，因此避免了无关抗原对免疫应答干扰. 选择几种抗原制备的亚单位疫苗可诱导强烈的特异性免疫应答，并不受先前接触分枝杆菌的影响[1].
机体对结核病(tuberculosis, TB)的免疫保护需要多种类型的T细胞参与，而单个蛋白构成的亚单位疫苗产生的特异性体液和细胞免疫应答是针对每一组分抗原的，难于达到上述目的，因此新型TB疫苗着重于融合多个免疫表位[4]. 我们采用两种纯化的Ag85B与ESAT6融合蛋白，分别免疫小鼠，特异性抗体滴度分别达到1∶1000和1∶5000，显著高于文献[5]中抗体的滴度. 夹心ELASA的方法确定了Ag85B与ESAT6融合表达产物的滴度存在着差异，说明Ag85B和ESAT6的不同连接方式影响表达产物的免疫学特性，有可能大分子量的Ag85B影响了ESAT6的表达，或者说小分子量的ESAT6更有利于启动转录和翻译，这在亚单位疫苗的应用和动物实验中需作进一步的研究. 融合蛋白免疫三次后，小鼠特异性淋巴细胞增殖指数显著升高，说明淋巴细胞被有效活化，融合蛋白Ag85BESAT6和ESAT6Ag85B免疫小鼠诱生的IFNγ水平显著高于生理盐水对照组(P<0.05)，提示这两种融合基因可能是TB疫苗中理想的候选基因. MTB毒株攻击实验中，与生理盐水组相比较，Ag85BESAT6免疫组使得细菌数由6.31±0.13降为5.04±0.11，而ESAT6Ag85B免疫组降为5.15±0.29，有效控制了MTB的感染，但与BCG免疫组相比免疫保护力还是有一定差距.
研究发现，单独使用结核杆菌短期在培养液中分离纯化的分泌型蛋白免疫动物，只会产生很弱的免疫应答，亚单位疫苗必须配以适宜的佐剂多次接种才能达到效果[6]. 本研究中，使用蛋白电泳分离的目的条带免疫动物也是常用的免疫方法，一方面可得到大量纯化的蛋白，另一方面硝酸纤维素膜作为载体和佐剂具有良好的免疫效果，具有很强的免疫调节作用，可刺激产生IL2, IFNγ和IL12，是本室较常用的一种免疫策略. 两种融合蛋白诱导的保护力有限，分析原因，可能是因为保护性抗原种类不多，难以诱导产生广泛而全面的细胞免疫应答；同时蛋白质在体内的滞留时间短并且其产生的免疫应答的持续时间也较短，需选择合适的剂量[7]，多次免疫才能达到有效的保护水平.
【参考文献】
[1]Doherty TM, Andersen P. Tuberculosis vaccine development [J]. Curr Opin Pulm Med, 2002;8(3):183-187.
[2]师长宏,范雄林,徐志凯,等. 结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85BESAT6的融合表达及纯化[J]. 中华结核和呼吸杂志,2004;27(2): 89-92.
Shi CH， Fan XL， Xu ZK， et al. Mycobacterium tuberculosis secreting protein Ag85B and ESAT6 fused expression and purifed [J]. Chin J Tuber Respir Dis, 2004;27(2): 89-92.
[3]Amoudy M, Abal W, Oftung R, et al.Comparison of antigenspecific TCell responses of tuberculosis patients using complex or single antigens of Mycobacterium tuberculosis [J]. Scand J Immunol,1998;48(5):1365-3083.
[4]Warwick JB, Umaimathan P. Improving vaccines against tuberculosis[J]. Immunol Cell Biol, 2003; 81:34-45.
[5]薛莹,李元,史皆然,等. 结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性[J]. 第四军医大学学报, 2002;23(13):1203-1205.
Xue Y, Li Y, Shi JR, et al. Immunobiological properties of secretory protein Ag85B from Mycobacterium tuberculosis[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2002;23(13): 1203-1205.
[6]Sinha RK, Khuller GK.The protective efficacy of a liposomal encapsulated 30 kDa secretory protein of Mycobacterium tuberculosis H37Rv against tuberculosis in mice [J]. Immunol Cell Biol, 1997;75:461-466.
[7]Elhay, Martin J, Ersen P, et al. Immunological requirements for a subunit vaccine against tuberculosis [J]. Immunol Cell Biol, 1997; 75(6): 595-603.
基金项目：国家863课题资助项目(2001AA215201); 国家自然科学基金资助项目(30170855)
通讯作者：徐志凯. Tel. (029)83374523Email. Zhikaixu@fmmu.edu.cn
作者简介：师长宏(1973),男(汉族),陕西省眉县人.博士生(导师徐志凯)，讲师. Tel. (029)83374527Email.changhong@fmmu.edu.cn
(第四军医大学基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033)
编辑甄志强, 百拇医药(师长宏，范雄林，柏银兰，薛莹，张海，徐志凯)