大鼠实验性肾缺血/再灌注引起肾小管上皮细胞凋亡及其与Bcl2，Fas/FasL表达变化的关系
( 第四军医大学：西京医院泌尿外科，基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)
Relationship between apoptosis of renal tubular epithelial cells and the change of expression of Bcl2 and Fas/FasL proteins in rats after renal ischemia/reperfusion injury
YU Xin Lu, WANG He, ZHANG Bo, ZHANG Geng, WU Guo Jun, GAO Juan, CUI ChongWei
Department of Urology，Xijing Hospital, Department of Pathology, Faculty of Preclinical Medicine, Fourth Military Medical University, Xian 710033，China
【Abstract】 AIM: To investigate the changes of the expression of Bcl2 and Fas/FasL proteins and apoptosis in rat kidneys after ischemia/reperfusion and their relations to renal injury. METHODS: Renal ischemia/reperfusion injury models of rat were established and SABC immunohistochemical methods were used to detect the changes of expression of Bcl2 and Fas/FasL proteins. Pathomorphological changes of renal ischemia/reperfusion injury were also observed and the occurrence of apoptosis was detected by TUNEL method. RESULTS: The pathological changes mainly occurred in the tubular epithelial cells of rat kidneys. The apoptosis index and the expression of Bcl2 proteins increased in the kidneys of ischemia/reperfusion group, gradually upregulated with the duration of ischemia/reperfusion and peaked at 48 h of reperfusion (P<0.05). Bcl2 mainly expressed in renal distal convoluted tubules and the expression was weak positive in control group. Fas/FasL peaked at 72 h of reperfusion (P<0.05) and was negatively expressed in the control group. Local necrosis and inflammatory cell infiltration surrounding the infracted area of ischemia/reperfusion groups were found by HE stain. The necrosis mainly occurred around the proximal convoluted tubules. CONCLUSION: These results suggest that ischemia/reperfusion injury can induce apoptosis in rat kidneys and Bcl2 and Fas/FasL proteins may be involved in the process of renal ischemia/reperfusion injury.
【Keywords】ischemia;kidney reperfusion Injury; apoptosis; Genes, Bcl2 ;Fas/FasL
【摘 要】 目的： 探讨大鼠实验性肾缺血再灌注引起肾脏损伤、肾小管上皮细胞凋亡情况及其与Bcl2，Fas/FasL表达变化的关系.方法： 建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，在不同时间点处死动物取肾组织石蜡包埋切片，HE染色分析肾组织病理损伤程度，用TUNEL法标记检测肾小管上皮细胞凋亡的变化，SABC免疫组化方法检测Bcl2，Fas与FasL蛋白表达的变化. 结果： 缺血再灌注后肾组织的病理损伤主要发生在肾小管，肾小管上皮细胞凋亡指数增加，且随缺血再灌注时间延长而进一步上升，48 h达高峰 (P<005).Bcl2蛋白在对照组呈弱阳性表达，缺血30 min，60 min后再灌注0 h有少量表达，再灌注24 ，48及72 h呈阳性表达，48 h达高峰 (P<005) ，并以远曲小管为主.Fas，FasL蛋白在对照组呈阴性表达，缺血30，60 min后再灌注0 h有少量表达，再灌注24，48及72 h呈阳性表达，以72 h时达高峰 (P<005) ，多表达在远曲小管.HE染色可见肾缺血再灌注后各组均有不同程度的肾小管上皮组织片状坏死灶，以近曲小管为主，坏死灶周围有炎性细胞浸润. 结论： 肾缺血再灌注可诱导肾小管上皮细胞凋亡，Bcl2，Fas/FasL系统可能在肾小管上皮细胞凋亡过程中发生着重要的调控作用.
【关键词】 局部缺血；肾；再灌注损伤；脱噬作用 ；基因，Bcl2；Fas/FasL
0 引言
肾缺血再灌注损伤常常引起严重的急性肾功能衰竭，肾小管上皮细胞死亡是其组织病理学改变的主要特征，肾缺血再灌注介导的肾小管上皮细胞死亡有坏死和凋亡两种形式，细胞凋亡的确切机制尚不十分清楚，近年研究认为与某些凋亡调控基因的表达有关.我们通过建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，观察肾小管上皮细胞凋亡情况，并探讨Bcl2，Fas/FasL表达变化与细胞凋亡及肾脏损伤的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 选用雄性SD大鼠45只(第四军医大学实验动物中心提供)，体质量270~280 g，随机分为对照组、缺血30 min组、缺血60 min组，缺血组又分别分为再灌注0，24，48，72 h组，每组5只.用速眠灵(0.8 mL·kg-1体质量) im麻醉，取腹正中切口，切除右肾，游离左肾蒂，以无损伤动脉夹夹闭左肾动脉分别为30 min，60 min后松开动脉夹，若左肾灌注后由暗黑转为红润，表示灌注成功，关闭切口.对照组仅游离左肾蒂，不钳夹动脉.分别于缺血终点(即再灌注0 h)、再灌注24，48和72 h后切取左肾，留取组织标本.
1.2 方法
1.2.1 HE染色的组织学检查 取上述动物模型肾组织标本经40 g·L-1多聚甲醛固定，石蜡包埋，制作石蜡切片，经HE染色后光镜观察各组肾组织病理学变化情况，分析各组肾脏损伤程度.
1.2.2 肾小管上皮细胞凋亡的检测 采用原位末端标记法(TUNEL)，将留取的大鼠肾脏沿长轴于中部开始，每隔4 μm横断面切取数张石蜡切片，每只鼠取5张不同部位的切片进行染色，方法按说明书.每张切片于分析仪(Noesis S.A.Frence)200倍光镜下随机选择10个无重叠视野，测定阳性染色平均光密度(MOD)及阳性染色面积率(视野中阳性核总面积占所有细胞核总面积的百分比)，计算细胞凋亡指数(apoptotic index，AI)：AI(%)=阳性染色平均光密度×阳性表达面积率×100%.
1.2.3 肾脏组织Bcl2，Fas/FasL蛋白水平的检测及半定量分析 取上述石蜡切片脱蜡置水，入 1 g·L-1 TBS中行微波修复抗原10 min,滴加抗原修复液15 min，30 mL·L-1H2O2 15 min，灭活内源性酶，0.01 mol·L-1的PBS冲洗后，每片分别各滴加Bcl2，Fas及FasL抗体(即用型，Santacruse公司)50 μL,4 ℃下孵育24 h.按SABC试剂盒说明(博士德公司)操作，DAB显色，封片，观察.每张切片于阳性表达区域选择10个无重叠视野.分析肾脏组织Bcl2，Fas与FasL蛋白阳性染色指数(Positive index，PI).PI(%)=阳性细胞数/视野所有细胞总数×100%.
统计学处理：数据以x±s表示，用SPSS10.0软件进行Kruskalwallis以及MannWhitney检验.
2 结果
2.1 HE染色肾组织切片的光镜检查 各组缺血时间的不同造成的病理损伤并不明显，而随再灌注时间的延长，肾脏组织发生不同的病理改变.
0 h组：肾小球和肾小管均未见明显病变.
24 h组： 肾皮、髓交界处的肾小管上皮细胞核固缩碎裂、细胞质浓缩，嗜酸性增强，结构消失并分散成多块；但周围无炎症反应，肾小管轮廓清晰，基底膜仅剩轮廓，部分肾小管中可见死亡细胞的胞质残留物质(Fig 1A).病变的肾小管面积占皮、髓交界处的肾小管总面积的593%以上.病变较轻的肾小管上皮出现颗粒变性或水样变性.皮质部肾小管病变程度较皮、髓交界处肾小管轻，病变的肾小管面积占该区肾小管总面积的366%，髓质部肾小管病变不明显，仅见散在的肾小管上皮细胞发生上述的病变，占该区肾小管总面积的108%.
48 h组：部分病变的肾小管已开始出现修复现象，靠近基底膜的再生肾小管上皮细胞表现为核大，核深染，核仁变大，可见核分裂像.胞质呈较明显的颗粒变性或水样变性，再生的上皮细胞不断增多，将原肾小管中的死亡细胞残留物推向管腔中央，并逐渐排出(Fig 1B).此时，死亡细胞残留物中固缩、碎裂的核物质大部分已被降解，因此不易见到，仅见嗜伊红染色的浓缩、块状胞质残留物.
72 h组：肾小管上皮细胞大量增生，核分裂多见，大部分肾小管结构已基本恢复，管腔内容物已基本清除，但肾小管上皮细胞仍有颗粒变性、水样变性或无核物质的胞质碎片存在现象.
各组染色后肾小球均未见明显的病理改变，病变区域及周围组织均未见炎症反应(无炎性细胞浸润、无纤维组织增生).
2.2 TUNEL结果 对照组仅见极少数散在的凋亡细胞；肾缺血/再灌注后凋亡细胞明显增加，凋亡细胞多位于外髓区远曲小管，较皮质及近曲小管明显(Fig 2)，肾缺血时间相同但再灌注时间延长以及再灌注时间相同而缺血时间延长均可导致肾小管上皮凋亡细胞明显增加(Tab 1).实验组与正常对照组的结果见Tab 1.
2.3 肾缺血再灌注后各时段肾小管上皮细胞Bcl2，Fas，FasL的表达 对照组Bcl2在肾远曲小管上皮细胞有少量表达，在近曲小管上皮细胞无表达，Fas，FasL在远曲小管上皮细胞无表达，在近曲小管上皮细胞少量表达.在实验组，Bcl2在远曲小管上皮细胞的表达随再灌注时间的延长明显增加，48 h达高峰(Fig 3)；在缺血再灌注24 h近曲小管仅有少量表达，再灌注48 h，72 h均呈中度表达.Fas，FasL在缺血再灌注24 h，48 h近曲小管中呈中度表达，72 h表达增加；而在缺血再灌注后远曲小管表达明显增加，72 h达高峰(Fig 4).Tab2显示不同时相肾缺血再灌注后大鼠肾小管上皮细胞Bcl2，Fas，FasL蛋白阳性染色细胞指数的变化.
表1 TUNEL法测定肾缺血再灌注后大鼠肾小管上皮细胞凋亡结果(略)
Tab 1 Results of renal tubular epithelial cells apoptosis after ischemia/reperfusion by TUNEL assay (略)
表2 不同时相肾缺血再灌注后大鼠肾小管上皮细胞Bcl2，Fas，FasL蛋白阳性染色细胞指数的变化(略)
Tab 2 Changes of rats renal tubular epithelial cells Bcl2，Fas and FasL positive (略)
图1 缺血再灌注24 h(A)，48 h(B)后肾组织HE染色
Fig 1 Renal tissue at 24 h(A),48 h(B) after ischemia/reperfusion HE ×200(略)
图2 TUNEL 法证实缺血再灌注损伤48 h后大鼠肾组织出现的凋亡(略)
Fig 2 Rats renal displayed apoptosis at 48 h after ischemia/reperfusion injury verified by TUNEL(略)
图3 Bcl2 蛋白在缺血再灌注组表达增强，随缺血及再灌注持续时间延长而增强，再灌注48 h后达到高峰(略)
Fig 3 Bcl2 protein was increased in renal in ischemia/reperfusion group, and gradually upregulated with the duration of ischemia or reperfusion and peaked at 48 h after reperfusion. (略)
图4 Fas及FasL 蛋白在缺血再灌注组表达增强，随缺血及再灌注持续时间延长而增强，再灌注72 h后达到高峰(略)
Fig 4 Fas/FasL proteins were increased in renal in ischemia/reperfusion group, and gradually upregulated with the duration of ischemia or reperfusion and peaked at 72 h after reperfusion(略)
3 讨论
尽管“急性肾小管坏死”仍然被用来描述急性肾功能衰竭(ARF)的主要病理变化，但目前研究认为ARF除了表现为细胞坏死外，同时出现了细胞凋亡[1].凋亡在调节细胞发育期间的数目和组织细胞内环境的稳定中发挥重要作用[2].凋亡的调控机能障碍最终导致多种临床疾病发生，包括癌症，自身免疫性疾病，神经变性疾病，造血机能障碍和不孕症[3-11].1987年在肾盂积水的动物模型中人们首次用凋亡描述肾脏病变，此后凋亡在肾脏损伤中的作用成为世界各国学者研究的热点.大量的动物实验表明在输尿管梗阻性疾病，肾动脉狭窄，药物，生物毒素，创伤等因素所致的肾脏损伤中都可以见到大量的肾小管细胞凋亡.肾缺血再灌注损伤亦可以引起肾小管上皮细胞凋亡，但对其发生的部位、损伤的程度及其调控机制仍存在许多争议.
我们在实验中观察到，大鼠肾缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞即发生凋亡，且随时间的延长凋亡细胞数量增加，同时亦观察到凋亡发生的部位以远曲小管为主，而近曲小管主要以细胞坏死为主，凋亡细胞较少，这可能是由于近曲小管上皮细胞对于缺血、缺氧的敏感程度高于远曲小管，从而发生细胞坏死，表现为细胞结构溶解破坏，而以凋亡为主的远曲小管细胞损伤较轻.
Bcl2是重要的抗细胞凋亡基因，在缺血再灌注损伤中表现得尤为突出[2].本实验显示肾缺血再灌注后远曲肾小管出现大量凋亡细胞，Bcl2在该部位呈高度表达，因此，肾脏缺血再灌注后的远曲小管可能是通过Bcl2的过度表达并发挥其抗凋亡作用，减轻细胞损伤.Bcl2抗细胞凋亡的作用机制可能与以下几方面有关：① 抑制Ca2的释放.② bc12通过阻止促细胞凋亡基因信号传递或阻止这些诱导基因产物发挥作用.③ 细胞内抗氧化作用.亦有研究表明，Bcl2抗氧化作用是间接的，即可能在于抑制超氧阴离子的产生而不是直接清除活性氧，而bc12的这种抑制超氧阴离子的作用与其能抑制细胞色素C的释放有关.
Fas蛋白是存在于细胞表面的一种Mr 45 000的膜受体蛋白( Ⅰ 型膜蛋白), FasL是Mr约为40 000的 Ⅱ 型膜蛋白, 两者均属于肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员.Fas/FasL被认为是与细胞凋亡密切相关的基因，Fas(CD95)与Fas配体结合可以诱导Fas阳性细胞凋亡[12-14].FasL在正常大鼠肾脏的表达主要在肾小管上皮细胞，可以促使Fas敏感的淋巴细胞发生凋亡[15].有人在大鼠DIC模型中发现Fas/FasL蛋白在皮质区近曲肾小管上皮细胞呈阳性表达，而在肾小球细胞和血管上皮细胞则无表达[16].
本实验发现肾缺血再灌注后肾小管上皮细胞表达Fas/FasL，以远曲小管明显， 随缺血再灌注时间的延长而增加，72 h达高峰.本实验显示缺血再灌注后近曲小管出现片状坏死灶，其周围有较多的炎性细胞浸润.坏死灶周围的肾小管上皮细胞亦可见Fas蛋白表达，表明肾缺血再灌注后坏死区及周围浸润的部分炎性细胞被激活而表达FasL蛋白,表达FasL蛋白阳性的炎性细胞很可能与邻近的表达Fas蛋白阳性的肾小管上皮细胞相互作用,从而诱导细胞凋亡.
凋亡与坏死具有不同的生物学特征，凋亡过程更容易通过多种途径进行干预.提高Bcl2的活性而干预细胞凋亡或阻断 Fas/FasL系统的相互作用可能抑制肾小管上皮细胞凋亡而减轻肾小管损伤.这无疑为防治肾缺血再灌注损伤提供了新的途径.
【参考文献】
[1] Gobe G, Willgoss D, Hogg N, Schoch E, Endre Z.Cell survival or death in renal tubularepithelium after ischemiareperfusion injury[J]. Kidney Int， 1999;56(4):1299-1304.
[2] Meier P, Finch A, Evan G. Apoptosis in development[J]. Nature, 2000;407(6805):796-801.
[3]Rathmell JC, Thompson CB. Pathways of apoptosis in lymphocyte development, homeostasis, and disease[J]. Cell, 2002;109(Suppl):S97-S107.
[4] Ameisen JC. On the origin, evolution and nature of programmed cell death: a timeline of four billion years[J]. Cell Deat Differ, 2002;9(4):367-393.
[5]Kiechle FL, Zhang X. The postgenomic era. Implications for the clinical laboratory[J]. Arch Pathol Lab Med, 2002;126(3): 255-262.
[6]Yuan J,Yankner BA. Apoptosis in the nervous system[J]. Nature, 2000;407(6805): 802-809.
[7]Ramos F, FuertesNunez M, SuarezVilela D, FernandezLopez A. What does apoptosis have to do with clinical features of myelodysplastic syndrome[J]?Haematologica, 2002;87(4): 381-391.
[8] Markstrom E, Svensson ECh, Shao R, Svanberg B, Billig H. Survival factors regulating ovarian apoptosisdependence of follicule differentiation[J]. Reproduction, 2002;123(1): 23-30.
[9] Mullauer L, Gruber P, Sebinger D, Buch J, Wohlfart S, Chott A. Mutations in apoptosis genes:A pathogenetic factor for human disease[J]. Mutat Res, 2001; 488(3): 211-231.
[10] Hanlon MG, Gacis ML, Kakakios AM, Kilham H. Investigation of suspected deficient Fasmediated apoptosis in a father and son[J]. Cytometry, 2001;43(3): 195-198.
[11] Mirkes PE. 2001 Workany lecture: To die or not to die, the role of apoptosis in normal and abnormal mammalian development[J]. Teratology, 2002;65(5): 228-239.
[12] Saxton NE, Barclay JL, Clouston AD, Fawcett J. Cyclosporin A pretreatment in a rat model of warm ischaemia/reperfusion injury[J]. J Hepatol, 2002;36(2): 241-247.
[13] Yoneyama K, Goto T, Miura K, Mikami K, Ohshima S, Nakane K, Lin JG, Sugawara M, Nakamura N, Shirakawa K, Komatsu M, Watanabe S. The expression of Fas and Fas ligand, and the effects of interferon in chronic liver diseases with hepatitis C virus[J]. Hepatol Res, 2002; 24(4): 327-337.
[14] Mor G, Straszewski S, Kamsteeg M. Role of the Fas/Fas ligand system in female reproductive organs: Survival and apoptosis[J]. Biochem Pharmacol, 2002;64(9): 1305-1315.
[15] Ortiz A, Lorz C, Egido J. The Fas ligand/Fas system in renal injury[J]. Nephrol Dial Transplant， 1999;14(8): 1831-1834.
[16] Koide N, Narita K, Kato Y, Sugiyama T, Chakravortty D, Morikawa A, Yoshida T, Yokochi T. Expression of Fas and Fas ligand on mouse renal tubular epithelial cells in the generalized shwartzman reaction and its relationship to apoptosis[J]. Infect Immun, 1999;67(8): 4112-4118.
编辑 袁天峰
作者简介：于新路(1964)，男(汉族),辽宁省庄河市人, 2001级中青年人才基金班学员(导师 王禾).主治医师.Tel.(029)3375321 Email.yuxinlu@263.net, http://www.100md.com(于新路， 王禾，张波， 张更，武国军，高娟，崔崇伟)
Relationship between apoptosis of renal tubular epithelial cells and the change of expression of Bcl2 and Fas/FasL proteins in rats after renal ischemia/reperfusion injury
YU Xin Lu, WANG He, ZHANG Bo, ZHANG Geng, WU Guo Jun, GAO Juan, CUI ChongWei
Department of Urology，Xijing Hospital, Department of Pathology, Faculty of Preclinical Medicine, Fourth Military Medical University, Xian 710033，China
【Abstract】 AIM: To investigate the changes of the expression of Bcl2 and Fas/FasL proteins and apoptosis in rat kidneys after ischemia/reperfusion and their relations to renal injury. METHODS: Renal ischemia/reperfusion injury models of rat were established and SABC immunohistochemical methods were used to detect the changes of expression of Bcl2 and Fas/FasL proteins. Pathomorphological changes of renal ischemia/reperfusion injury were also observed and the occurrence of apoptosis was detected by TUNEL method. RESULTS: The pathological changes mainly occurred in the tubular epithelial cells of rat kidneys. The apoptosis index and the expression of Bcl2 proteins increased in the kidneys of ischemia/reperfusion group, gradually upregulated with the duration of ischemia/reperfusion and peaked at 48 h of reperfusion (P<0.05). Bcl2 mainly expressed in renal distal convoluted tubules and the expression was weak positive in control group. Fas/FasL peaked at 72 h of reperfusion (P<0.05) and was negatively expressed in the control group. Local necrosis and inflammatory cell infiltration surrounding the infracted area of ischemia/reperfusion groups were found by HE stain. The necrosis mainly occurred around the proximal convoluted tubules. CONCLUSION: These results suggest that ischemia/reperfusion injury can induce apoptosis in rat kidneys and Bcl2 and Fas/FasL proteins may be involved in the process of renal ischemia/reperfusion injury.
【Keywords】ischemia;kidney reperfusion Injury; apoptosis; Genes, Bcl2 ;Fas/FasL
【摘 要】 目的： 探讨大鼠实验性肾缺血再灌注引起肾脏损伤、肾小管上皮细胞凋亡情况及其与Bcl2，Fas/FasL表达变化的关系.方法： 建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，在不同时间点处死动物取肾组织石蜡包埋切片，HE染色分析肾组织病理损伤程度，用TUNEL法标记检测肾小管上皮细胞凋亡的变化，SABC免疫组化方法检测Bcl2，Fas与FasL蛋白表达的变化. 结果： 缺血再灌注后肾组织的病理损伤主要发生在肾小管，肾小管上皮细胞凋亡指数增加，且随缺血再灌注时间延长而进一步上升，48 h达高峰 (P<005).Bcl2蛋白在对照组呈弱阳性表达，缺血30 min，60 min后再灌注0 h有少量表达，再灌注24 ，48及72 h呈阳性表达，48 h达高峰 (P<005) ，并以远曲小管为主.Fas，FasL蛋白在对照组呈阴性表达，缺血30，60 min后再灌注0 h有少量表达，再灌注24，48及72 h呈阳性表达，以72 h时达高峰 (P<005) ，多表达在远曲小管.HE染色可见肾缺血再灌注后各组均有不同程度的肾小管上皮组织片状坏死灶，以近曲小管为主，坏死灶周围有炎性细胞浸润. 结论： 肾缺血再灌注可诱导肾小管上皮细胞凋亡，Bcl2，Fas/FasL系统可能在肾小管上皮细胞凋亡过程中发生着重要的调控作用.
【关键词】 局部缺血；肾；再灌注损伤；脱噬作用 ；基因，Bcl2；Fas/FasL
0 引言
肾缺血再灌注损伤常常引起严重的急性肾功能衰竭，肾小管上皮细胞死亡是其组织病理学改变的主要特征，肾缺血再灌注介导的肾小管上皮细胞死亡有坏死和凋亡两种形式，细胞凋亡的确切机制尚不十分清楚，近年研究认为与某些凋亡调控基因的表达有关.我们通过建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，观察肾小管上皮细胞凋亡情况，并探讨Bcl2，Fas/FasL表达变化与细胞凋亡及肾脏损伤的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 选用雄性SD大鼠45只(第四军医大学实验动物中心提供)，体质量270~280 g，随机分为对照组、缺血30 min组、缺血60 min组，缺血组又分别分为再灌注0，24，48，72 h组，每组5只.用速眠灵(0.8 mL·kg-1体质量) im麻醉，取腹正中切口，切除右肾，游离左肾蒂，以无损伤动脉夹夹闭左肾动脉分别为30 min，60 min后松开动脉夹，若左肾灌注后由暗黑转为红润，表示灌注成功，关闭切口.对照组仅游离左肾蒂，不钳夹动脉.分别于缺血终点(即再灌注0 h)、再灌注24，48和72 h后切取左肾，留取组织标本.
1.2 方法
1.2.1 HE染色的组织学检查 取上述动物模型肾组织标本经40 g·L-1多聚甲醛固定，石蜡包埋，制作石蜡切片，经HE染色后光镜观察各组肾组织病理学变化情况，分析各组肾脏损伤程度.
1.2.2 肾小管上皮细胞凋亡的检测 采用原位末端标记法(TUNEL)，将留取的大鼠肾脏沿长轴于中部开始，每隔4 μm横断面切取数张石蜡切片，每只鼠取5张不同部位的切片进行染色，方法按说明书.每张切片于分析仪(Noesis S.A.Frence)200倍光镜下随机选择10个无重叠视野，测定阳性染色平均光密度(MOD)及阳性染色面积率(视野中阳性核总面积占所有细胞核总面积的百分比)，计算细胞凋亡指数(apoptotic index，AI)：AI(%)=阳性染色平均光密度×阳性表达面积率×100%.
1.2.3 肾脏组织Bcl2，Fas/FasL蛋白水平的检测及半定量分析 取上述石蜡切片脱蜡置水，入 1 g·L-1 TBS中行微波修复抗原10 min,滴加抗原修复液15 min，30 mL·L-1H2O2 15 min，灭活内源性酶，0.01 mol·L-1的PBS冲洗后，每片分别各滴加Bcl2，Fas及FasL抗体(即用型，Santacruse公司)50 μL,4 ℃下孵育24 h.按SABC试剂盒说明(博士德公司)操作，DAB显色，封片，观察.每张切片于阳性表达区域选择10个无重叠视野.分析肾脏组织Bcl2，Fas与FasL蛋白阳性染色指数(Positive index，PI).PI(%)=阳性细胞数/视野所有细胞总数×100%.
统计学处理：数据以x±s表示，用SPSS10.0软件进行Kruskalwallis以及MannWhitney检验.
2 结果
2.1 HE染色肾组织切片的光镜检查 各组缺血时间的不同造成的病理损伤并不明显，而随再灌注时间的延长，肾脏组织发生不同的病理改变.
0 h组：肾小球和肾小管均未见明显病变.
24 h组： 肾皮、髓交界处的肾小管上皮细胞核固缩碎裂、细胞质浓缩，嗜酸性增强，结构消失并分散成多块；但周围无炎症反应，肾小管轮廓清晰，基底膜仅剩轮廓，部分肾小管中可见死亡细胞的胞质残留物质(Fig 1A).病变的肾小管面积占皮、髓交界处的肾小管总面积的593%以上.病变较轻的肾小管上皮出现颗粒变性或水样变性.皮质部肾小管病变程度较皮、髓交界处肾小管轻，病变的肾小管面积占该区肾小管总面积的366%，髓质部肾小管病变不明显，仅见散在的肾小管上皮细胞发生上述的病变，占该区肾小管总面积的108%.
48 h组：部分病变的肾小管已开始出现修复现象，靠近基底膜的再生肾小管上皮细胞表现为核大，核深染，核仁变大，可见核分裂像.胞质呈较明显的颗粒变性或水样变性，再生的上皮细胞不断增多，将原肾小管中的死亡细胞残留物推向管腔中央，并逐渐排出(Fig 1B).此时，死亡细胞残留物中固缩、碎裂的核物质大部分已被降解，因此不易见到，仅见嗜伊红染色的浓缩、块状胞质残留物.
72 h组：肾小管上皮细胞大量增生，核分裂多见，大部分肾小管结构已基本恢复，管腔内容物已基本清除，但肾小管上皮细胞仍有颗粒变性、水样变性或无核物质的胞质碎片存在现象.
各组染色后肾小球均未见明显的病理改变，病变区域及周围组织均未见炎症反应(无炎性细胞浸润、无纤维组织增生).
2.2 TUNEL结果 对照组仅见极少数散在的凋亡细胞；肾缺血/再灌注后凋亡细胞明显增加，凋亡细胞多位于外髓区远曲小管，较皮质及近曲小管明显(Fig 2)，肾缺血时间相同但再灌注时间延长以及再灌注时间相同而缺血时间延长均可导致肾小管上皮凋亡细胞明显增加(Tab 1).实验组与正常对照组的结果见Tab 1.
2.3 肾缺血再灌注后各时段肾小管上皮细胞Bcl2，Fas，FasL的表达 对照组Bcl2在肾远曲小管上皮细胞有少量表达，在近曲小管上皮细胞无表达，Fas，FasL在远曲小管上皮细胞无表达，在近曲小管上皮细胞少量表达.在实验组，Bcl2在远曲小管上皮细胞的表达随再灌注时间的延长明显增加，48 h达高峰(Fig 3)；在缺血再灌注24 h近曲小管仅有少量表达，再灌注48 h，72 h均呈中度表达.Fas，FasL在缺血再灌注24 h，48 h近曲小管中呈中度表达，72 h表达增加；而在缺血再灌注后远曲小管表达明显增加，72 h达高峰(Fig 4).Tab2显示不同时相肾缺血再灌注后大鼠肾小管上皮细胞Bcl2，Fas，FasL蛋白阳性染色细胞指数的变化.
表1 TUNEL法测定肾缺血再灌注后大鼠肾小管上皮细胞凋亡结果(略)
Tab 1 Results of renal tubular epithelial cells apoptosis after ischemia/reperfusion by TUNEL assay (略)
表2 不同时相肾缺血再灌注后大鼠肾小管上皮细胞Bcl2，Fas，FasL蛋白阳性染色细胞指数的变化(略)
Tab 2 Changes of rats renal tubular epithelial cells Bcl2，Fas and FasL positive (略)
图1 缺血再灌注24 h(A)，48 h(B)后肾组织HE染色
Fig 1 Renal tissue at 24 h(A),48 h(B) after ischemia/reperfusion HE ×200(略)
图2 TUNEL 法证实缺血再灌注损伤48 h后大鼠肾组织出现的凋亡(略)
Fig 2 Rats renal displayed apoptosis at 48 h after ischemia/reperfusion injury verified by TUNEL(略)
图3 Bcl2 蛋白在缺血再灌注组表达增强，随缺血及再灌注持续时间延长而增强，再灌注48 h后达到高峰(略)
Fig 3 Bcl2 protein was increased in renal in ischemia/reperfusion group, and gradually upregulated with the duration of ischemia or reperfusion and peaked at 48 h after reperfusion. (略)
图4 Fas及FasL 蛋白在缺血再灌注组表达增强，随缺血及再灌注持续时间延长而增强，再灌注72 h后达到高峰(略)
Fig 4 Fas/FasL proteins were increased in renal in ischemia/reperfusion group, and gradually upregulated with the duration of ischemia or reperfusion and peaked at 72 h after reperfusion(略)
3 讨论
尽管“急性肾小管坏死”仍然被用来描述急性肾功能衰竭(ARF)的主要病理变化，但目前研究认为ARF除了表现为细胞坏死外，同时出现了细胞凋亡[1].凋亡在调节细胞发育期间的数目和组织细胞内环境的稳定中发挥重要作用[2].凋亡的调控机能障碍最终导致多种临床疾病发生，包括癌症，自身免疫性疾病，神经变性疾病，造血机能障碍和不孕症[3-11].1987年在肾盂积水的动物模型中人们首次用凋亡描述肾脏病变，此后凋亡在肾脏损伤中的作用成为世界各国学者研究的热点.大量的动物实验表明在输尿管梗阻性疾病，肾动脉狭窄，药物，生物毒素，创伤等因素所致的肾脏损伤中都可以见到大量的肾小管细胞凋亡.肾缺血再灌注损伤亦可以引起肾小管上皮细胞凋亡，但对其发生的部位、损伤的程度及其调控机制仍存在许多争议.
我们在实验中观察到，大鼠肾缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞即发生凋亡，且随时间的延长凋亡细胞数量增加，同时亦观察到凋亡发生的部位以远曲小管为主，而近曲小管主要以细胞坏死为主，凋亡细胞较少，这可能是由于近曲小管上皮细胞对于缺血、缺氧的敏感程度高于远曲小管，从而发生细胞坏死，表现为细胞结构溶解破坏，而以凋亡为主的远曲小管细胞损伤较轻.
Bcl2是重要的抗细胞凋亡基因，在缺血再灌注损伤中表现得尤为突出[2].本实验显示肾缺血再灌注后远曲肾小管出现大量凋亡细胞，Bcl2在该部位呈高度表达，因此，肾脏缺血再灌注后的远曲小管可能是通过Bcl2的过度表达并发挥其抗凋亡作用，减轻细胞损伤.Bcl2抗细胞凋亡的作用机制可能与以下几方面有关：① 抑制Ca2的释放.② bc12通过阻止促细胞凋亡基因信号传递或阻止这些诱导基因产物发挥作用.③ 细胞内抗氧化作用.亦有研究表明，Bcl2抗氧化作用是间接的，即可能在于抑制超氧阴离子的产生而不是直接清除活性氧，而bc12的这种抑制超氧阴离子的作用与其能抑制细胞色素C的释放有关.
Fas蛋白是存在于细胞表面的一种Mr 45 000的膜受体蛋白( Ⅰ 型膜蛋白), FasL是Mr约为40 000的 Ⅱ 型膜蛋白, 两者均属于肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员.Fas/FasL被认为是与细胞凋亡密切相关的基因，Fas(CD95)与Fas配体结合可以诱导Fas阳性细胞凋亡[12-14].FasL在正常大鼠肾脏的表达主要在肾小管上皮细胞，可以促使Fas敏感的淋巴细胞发生凋亡[15].有人在大鼠DIC模型中发现Fas/FasL蛋白在皮质区近曲肾小管上皮细胞呈阳性表达，而在肾小球细胞和血管上皮细胞则无表达[16].
本实验发现肾缺血再灌注后肾小管上皮细胞表达Fas/FasL，以远曲小管明显， 随缺血再灌注时间的延长而增加，72 h达高峰.本实验显示缺血再灌注后近曲小管出现片状坏死灶，其周围有较多的炎性细胞浸润.坏死灶周围的肾小管上皮细胞亦可见Fas蛋白表达，表明肾缺血再灌注后坏死区及周围浸润的部分炎性细胞被激活而表达FasL蛋白,表达FasL蛋白阳性的炎性细胞很可能与邻近的表达Fas蛋白阳性的肾小管上皮细胞相互作用,从而诱导细胞凋亡.
凋亡与坏死具有不同的生物学特征，凋亡过程更容易通过多种途径进行干预.提高Bcl2的活性而干预细胞凋亡或阻断 Fas/FasL系统的相互作用可能抑制肾小管上皮细胞凋亡而减轻肾小管损伤.这无疑为防治肾缺血再灌注损伤提供了新的途径.
【参考文献】
[1] Gobe G, Willgoss D, Hogg N, Schoch E, Endre Z.Cell survival or death in renal tubularepithelium after ischemiareperfusion injury[J]. Kidney Int， 1999;56(4):1299-1304.
[2] Meier P, Finch A, Evan G. Apoptosis in development[J]. Nature, 2000;407(6805):796-801.
[3]Rathmell JC, Thompson CB. Pathways of apoptosis in lymphocyte development, homeostasis, and disease[J]. Cell, 2002;109(Suppl):S97-S107.
[4] Ameisen JC. On the origin, evolution and nature of programmed cell death: a timeline of four billion years[J]. Cell Deat Differ, 2002;9(4):367-393.
[5]Kiechle FL, Zhang X. The postgenomic era. Implications for the clinical laboratory[J]. Arch Pathol Lab Med, 2002;126(3): 255-262.
[6]Yuan J,Yankner BA. Apoptosis in the nervous system[J]. Nature, 2000;407(6805): 802-809.
[7]Ramos F, FuertesNunez M, SuarezVilela D, FernandezLopez A. What does apoptosis have to do with clinical features of myelodysplastic syndrome[J]?Haematologica, 2002;87(4): 381-391.
[8] Markstrom E, Svensson ECh, Shao R, Svanberg B, Billig H. Survival factors regulating ovarian apoptosisdependence of follicule differentiation[J]. Reproduction, 2002;123(1): 23-30.
[9] Mullauer L, Gruber P, Sebinger D, Buch J, Wohlfart S, Chott A. Mutations in apoptosis genes:A pathogenetic factor for human disease[J]. Mutat Res, 2001; 488(3): 211-231.
[10] Hanlon MG, Gacis ML, Kakakios AM, Kilham H. Investigation of suspected deficient Fasmediated apoptosis in a father and son[J]. Cytometry, 2001;43(3): 195-198.
[11] Mirkes PE. 2001 Workany lecture: To die or not to die, the role of apoptosis in normal and abnormal mammalian development[J]. Teratology, 2002;65(5): 228-239.
[12] Saxton NE, Barclay JL, Clouston AD, Fawcett J. Cyclosporin A pretreatment in a rat model of warm ischaemia/reperfusion injury[J]. J Hepatol, 2002;36(2): 241-247.
[13] Yoneyama K, Goto T, Miura K, Mikami K, Ohshima S, Nakane K, Lin JG, Sugawara M, Nakamura N, Shirakawa K, Komatsu M, Watanabe S. The expression of Fas and Fas ligand, and the effects of interferon in chronic liver diseases with hepatitis C virus[J]. Hepatol Res, 2002; 24(4): 327-337.
[14] Mor G, Straszewski S, Kamsteeg M. Role of the Fas/Fas ligand system in female reproductive organs: Survival and apoptosis[J]. Biochem Pharmacol, 2002;64(9): 1305-1315.
[15] Ortiz A, Lorz C, Egido J. The Fas ligand/Fas system in renal injury[J]. Nephrol Dial Transplant， 1999;14(8): 1831-1834.
[16] Koide N, Narita K, Kato Y, Sugiyama T, Chakravortty D, Morikawa A, Yoshida T, Yokochi T. Expression of Fas and Fas ligand on mouse renal tubular epithelial cells in the generalized shwartzman reaction and its relationship to apoptosis[J]. Infect Immun, 1999;67(8): 4112-4118.
编辑 袁天峰
作者简介：于新路(1964)，男(汉族),辽宁省庄河市人, 2001级中青年人才基金班学员(导师 王禾).主治医师.Tel.(029)3375321 Email.yuxinlu@263.net, http://www.100md.com(于新路， 王禾，张波， 张更，武国军，高娟，崔崇伟)