林 业 科 学 研 究 2 0 0 3 ， 1 6 ( 5 ) ： 5 6 8～ 5 7 4

    Fo r e s t R e s e a r c h

    文章编号 ：1 0 0 1 . 1 4 9 8 ( 2 0 0 3 ) 0 5 . 0 5 6 8 . 0 7

    印楝细胞悬浮培养系的建立及悬浮培养

    梁 军，魏 刚，吕 全，贾秀贞，张星耀

    ( 中国林业科学研究院森林生态与环境保护研究所 ， 北京 1 0 0 0 9 1 )

    摘要： 研究了印楝细胞悬浮培养系的建立及印楝细胞悬浮培养的条件。结果表明， 印楝细胞悬浮系的

    建立以 培养基 ， N A b _ 2 . 0～ 4 . 0 n l g · L 一， 采用直接倾倒法作 为接种方法为好 ； 基于生物量、 印楝素

    含量和印楝素产率综合分析认为， 印楝细胞悬浮培养的最佳条件为 培养基 ， N A b _ 2～ 4 n a g · L ～， 蔗

    糖 3 0 g · L 一， 培养温度 2 5℃， 及根据培养容器的大小选择合适 的转速和装液量。

    关键词： 印楝 ； 细胞悬浮培养 ； 印楝素 ； 植物源农药

    中图分类号 ： Q 9 4 3 . 1 文献标识码 ： A

    印楝( ， 4 d n d c a A. J u s s ) 是当今世界上著名的农药资源植物n ~ 引， 以其独特的杀虫效

    果和高效的杀虫、 拒食、 趋避、 毒杀和不育等活性[ 3 居于植物源农药资源的首位， 对 2 0 0余种昆虫

    具有生物活性， 主要表现在强烈的拒食作用， 是迄今为止人们发现的最强拒食剂， 如 0 . 0 2 m g · m- 2

    的印楝素就足以阻止沙漠蝗( h s t o c e r c a g r e g a r o . ( F o r s k a 1 ) ) 的侵食 ； 印楝素能有效地扰乱昆虫的

    胚后发育， 通过扰乱昆虫的内分泌使得幼虫脱皮、 化蛹不正常而导致死亡； 有效的绝育作用， 如对

    于产卵量大特别是社会性害虫如白蚁( C o p t o t e ml e ~s p p . ) 等， 使用印楝素防治效果尤为显著[ 4 ] 。印

    楝素( _ A z a d i r a e h t i n ) 是其主要的生物活性物质。印楝原产南亚的阿萨姆和缅甸或巴基斯坦、 斯里

    兰卡、 泰国、 马来群岛和印尼， 我国 1 9 8 6年在海南省万宁县引种栽培取得成功b ] ， 1 9 9 5年， 在云

    南省元江和元谋两地引种栽培印楝， 也取得很大成功n ] 。现在我国海南、 广东、 云南有一定数量

    的栽培。鉴于印楝在我国栽培的地域局限性 ] ， 规模化开发印楝活性物质需要开辟新的途径。

    而植物细胞悬浮培养以其繁殖规模大、 速度快为优势是生产有效物质的一种有前途的途径和手

    段【 l 0 J ， 从 7 0年代以来， 植物组织培养进展很快， 有许多被用于次生代谢产物为目的的经济价值较

    高的植物已进行了组织培养， 如人参 ( P a n a x n C.A.M e y ) 、 紫草( A me b a e u c h r o m a( R o y l e )

    J o h n , s t ) 等。印楝愈伤组织培养和植株再生也获得了成功[ 1 。本研究则希望针对印楝农药的生

    产， 寻求合适的印楝资源开发途径和方法。

    1 材料与方法

    1 - 1 材料

    印楝为中国林科院资源昆虫所筛选的 7号木。愈伤组织来 自于茎源经固体培养基上多次

    继代诱导产生的生长旺盛、 色泽嫩黄、 疏松易碎的组织。

    收稿 日期：2 0 1 2 . 1 0 - 2 5

    基金项 目：“ 十五” 攻关课题“ 林木病虫害环境协调性农药及其航空喷洒技术研究” ( 2 0 0 1 B A 5 0 9 B I 2 0 1 )的部分内容

    作者简介 ：梁军( 1 9 6 3 - . ) ， 男， 宁夏中卫人， 副研究员， 博士 .

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    1 . 2 悬浮培养系的诱导

    将约 2 g的疏松易碎的愈伤组织接种到盛有 4 0 m L液体培养基( MS和 ) 的 1 0 0 m L三角

    瓶中。接种后置于旋转式摇床振荡培养， 摇床转速为 1 2 0 r · mi n 一， 温度 2 5℃。

    初次液体培养愈伤组织生长旺盛， 摇匀培养液后稍置片刻 ， 用颗粒适中的悬浮细胞团进行

    继代培养， 悬浮细胞团颗粒较均匀后， 换用 2 O O～ 2 5 0 m L三角瓶装 6 0 m L液进行培养， 再继而

    用 5 0 0 m L三角瓶装 1 2 0 m L液培养 ， 以进行悬浮培养系的诱导。将悬浮起来的细胞悬浮液， 轻

    轻摇匀 ， 静置片刻后接种到新鲜培养基中， 进行悬浮细胞的继代培养 ， 视细胞生长情况而决定

    继代的间隔时间。

    1 . 3 悬浮培养系的建立

    1 . 3 . 1 培养基对悬浮系建立的影响 取生长旺盛、 疏松易碎的印楝茎源愈伤组织 ， 接种到附

    加有 N A A4 . 0 m g · L +队 0 . 5唱 · L 1+蔗糖 3 0 g · L 的 M s和 B 5 液体培养基中， 用镊子轻轻

    压碎进行培养。

    1 . 3 . 2 激素种类及浓度对悬浮系建立及维持的影响 以 B 5 +B A 0 . 5嘴 · L - 1+蔗糖 3 0 g · L

    为基本培养体系， N A A和 I B A浓度设计为 4嘴 · L 一， 对刚建立的悬浮系进行继代培养， 连续 3

    代。

    1 . 3 . 3 N A A浓度对悬浮系生长的影响 以 B 5 +队 0 . 5唱 · L . 1+蔗糖 3 0 g · L - 1 为基本培养体

    系， 设计 N A A浓度为 0 . 5 、 1 . 0 、 2 . 0 、 3 . 0 、 4 . 0 、 5 . 0 、 6 . 0 m g · L 一。

    1 . 3 . 4 接种法对印楝悬浮细胞团生长的影响 以 B 5 +B A 0 . 5嘴 · L +蔗糖 3 0 g · L - 1 为基本

    培养体系， 设计移液管接种法和直接倾倒法作为接种方法， 两种方法都选用 2 0 0 m L三角瓶， 装

    液量为 5 0 m L ， 接种量为 1 5 m L ， 观察两种方法对悬浮细胞生长情况的影响。

    1 . 4 印楝悬浮细胞培养影响因子

    根据常规悬浮细胞培养的定性分析 ， 设计了生长素、 培养基、 c源、 温度、 装液量和转速为

    影响因子， 具体水平和培养条件见表 l 。

    表 l 印楝悬浮细胞培养影响因子设计

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    1 . 5 印楝素产量的观察和测定

    把在摇床上振荡培养的装有悬浮细胞液的三角瓶取下， 摇匀后取 1 0 0 m L悬浮细胞培养

    液 ， 经抽滤至无水滴下时， 称量即为鲜质量 ， 而后置于 5 O℃的烘箱 中烘至恒质量 ， 称量即为干

    质量。

    印楝素含量 ： 1 g 干愈伤组织中印楝素的毫克数

    印楝素产量( 1 T l g · L ) =( 收获干质量( g ) X印楝素含量( 1 T l g · g ) ) ( 培养基体积( L ) )

    1 . 6 印楝素的提取和检测

    精密称取干样品 2～ 3 g ， 用洁净研钵小心研碎， 转入 1 5 0 m L三角瓶中 ......