鳖甲抗纤方抗肝纤维化作用的实验研究.PDF
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2006年2月23日
| 第1页 |
参见附件(84KB，3页)。
鳖甲抗纤方抗肝纤维 化 作 用 的 实 验 研 究
梁润英 路 嵘
(河南中医学院·郑州 450003)
摘 要 目的:研究鳖甲抗纤方防治肝纤维化的作用机理。方法:以猪血清诱导免疫损伤性肝纤维化大鼠
为实验对象 ,以鳖甲煎丸、秋水仙碱预防组、秋水仙碱治疗组作为阳性对照 ,空白组作为阴性对照。以大鼠
血清ALT、 ALB、 A G、 HA、 LN、 PCⅢ、Ⅳ- C、肝组织进行 HE常规染色和 VG特殊染色作为主要观察内容。
结果:鳖甲抗纤方与模型组比较ALT、 ALB、 HA、 LN、 PCⅢ、Ⅳ- C均有显著性意义( P < 0105) ,鳖甲抗纤方治
疗组与鳖甲抗纤方预防组比较LN、Ⅳ- C有显著差异。结论:鳖甲抗纤方可抑制胶原合成 ,防治肝纤维化
的作用好于鳖甲煎丸和秋水仙碱 ,而且其预防效果好于治疗效果。
主题词 肝硬化中医药疗法 @鳖甲抗纤方治疗应用 肝硬化超微结构 大鼠
肝纤维化是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时 ,肝脏内纤
维结缔组织异常增生的病理过程 ,轻者成为纤维化 ,重者进
而使肝小叶结构改变 ,假小叶及结节形成 ,成为肝硬化。肝
纤维化是慢性肝病重要的病理特征 ,也是进一步向肝硬化发
展的重要环节。近年来中医药在抗肝纤维化方面取得了较
大的成就 ,充分发挥了中药复方多途径、多层次、多靶点的综
合药理作用 ,具有明显的优势与广阔的应用前景。
鳖甲煎丸是张仲景《金匮要略》中治疗疟疾 瘕的名方 ,有可靠的临床基础 ,临床用于治疗肝炎、肝硬化、血吸虫病及
热病后所致肝脾肿大 ,该药对改善症状、消除肝脾肿大有确
切疗效 ,用于治疗肝癌也有一定的效果。
遵照经方的组方原则和治疗大法 ,针对肝纤维化的病机
特点 ,在鳖甲煎丸抗肝纤维化的基础上 ,对鳖甲煎丸原方进
行了调整 ,组成鳖甲抗纤方 ,既保留原来的主要功能 ,而且更
加有针对性地适用于肝纤维化阶段的病机特点 ,现将其实验
结果报道如下。
1 实验材料
111 动物 雄性 Wistar 大鼠 ,体重 180～200g ,70只 ,由河南
省实验动物中心提供。实验室温22± 2℃,相对湿度60 % ,常
规饲料喂养 ,饮水量不限。
112 药品 鳖甲抗纤方浸膏:由鳖甲、 虫、柴胡、丹皮、大
黄、葶苈子、人参、芍药组成。由河南中医学院中药鉴定教研
室提供。首先将药材浸泡15min ,煎煮2次 ,第1次加8倍水 ,75min ;第2次加6倍水 ,60min ,再用65 %乙醇作醇沉处理 ,静
置24h ,过滤 ,回收乙醇后定容 ,置已恒重的蒸发皿中 ,水浴蒸
干 ,105℃干燥3h后 ,迅速称重 ,即为干浸膏的量(g) ,相当于
原生药2g g浸膏。鳖甲煎丸:杭州胡庆余堂制药厂生产 ,批
号:01041203 ,购自北京同仁堂药店。将鳖甲煎丸粉碎 ,过200
目筛 ,用蒸馏水配成混悬液。秋水仙碱:西双版纳制药厂生
产 ,批号:010218 ,购自北京同仁堂药店。将秋水仙碱片研碎 ,用浓度为012 %的羧甲基纤维素钠配成混悬液。
113 试剂 猪血清( PS) :郑州佰安生物工程有限公司 ,批
号:990419 ,低温冰箱储存。
2 实验方法
211 造模方法 本实验选用猪血清诱导大鼠免疫性肝纤维
化模型。采用未灭活猪血清腹腔注射 ,每周 2 次 ,每次
015ml只 ,连续12W。6W后即可形成肝纤维化。
212 分组 将70只大鼠随机分为7组 ,正常对照组、病理模
型组、鳖甲抗纤方预防组、鳖甲抗纤治疗组、秋水仙碱预防
组、秋水仙碱治疗组、鳖甲煎丸组 ,每组10只。
213 给药方法 各预防组在造模同时给药 ,每天上午灌胃 1
次 ,至12W结束 ,各治疗组(正常组、预防组除外)于造模第
7W给药 ,至第12W结束。每天上午灌胃1次 ,连续6W,正常
组、模型组则用同体积自来水同一时间灌胃。鳖甲抗纤方半
成品干浸膏每克含生药 2g ,用蒸馏水稀释至每毫升含生药
1g。鳖甲抗纤方预防组、治疗组按 2ml 100g体重灌胃;秋水
仙碱预防组、治疗组按每日0101mg 100g体重灌胃;鳖甲煎丸
混悬液 ,每 ml 含生药0115g ,按2ml 100g体重灌胃 ,各组均自
由饮水 ,普通饲料喂养。
214 观察指标
21411 生化指标 实验第 12W末 ,断头取血分离血清 ,HA、LN、 PCⅢ、Ⅳ- C用放射免疫法(RIN) ,SN - 695B型智能放免
测量仪检测。ALT用速率法 ,ALB 用溴甲酚绿法 ,全自动生
化分析仪检测。
21412 组织学变化 第12W结束后 ,将各组大鼠断头处死 ,立即解剖取肝左叶 ,用中性福尔马林液固定 ,72h 取出肝组
织 ,各组取材部位基本一致 ,切取组织块厚度 2mm左右。病
理制作组织切片程序按常规脱水、透明、包埋、切片、然后进
行常规 HE常规染色、胶原纤维特殊VG染色。VG染色用苦
味酸 —酸性品红染色法。最后于光学显微镜下观察肝细胞
炎症反应以及纤维组织增生情况。摄取照片 ,并作统计学处
理。
VG染色统计测试方法:根据立体计量学 ,每个脏器切 3
张组织片 ,每张组织片随机照一张照片 ,用正方形测试格(点
分析法)进行测试。计算压在纤维隔上的交叉点数 ,即为体
密度。
3 实验结果
311 对实验大鼠血清ALT、 ALB、 A G的影响 见表1。
· 61 · 中国中医药科技 2004年第11卷第1期
? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.表1 各组大鼠血清ALT、 ALB、 A G含量的变化(? x ±s)
组别 n ALT(UL) ALB(GL) A G(GL)
正常组 10 36150± 5168 30160± 2188 0177± 0104
模型组 10 67140± 15155
23160± 2141
0156± 0114
鳖甲煎丸组 10 47150± 5146 33
28150± 3110 33
0167± 0113
秋水仙碱组△ 10 42180± 5103 33
27130± 2150 33
0160± 0106 33
鳖甲抗纤方组△ 10 43170± 4176 33
29160± 1184 33
0168± 0106
与正常组相比 P < 0105 , P < 0101 ;与模型组相比 3 P < 0105 , 3 3 P
< 0101 (下同) ; △均为治疗组
312 对实验大鼠血清 HA、 LN、 PCⅢ、Ⅳ- C含量的影响 见
表2。
表2 各组大鼠血清 HA、 LN、 PCⅢ、Ⅳ- C含量的变化( ? x ±s)
组别 n HA(ng ml) LN(ng ml) PCⅢ(μg L) Ⅳ- C(μg L)
正常组 10 265198± 51156 17153± 3157 2158± 0169 8160± 2114
模型组 10 55716± 39135
45105± 5160
9159± 1133
26156± 4157
鳖丸组 10 371151± 30146 3
33121± 3117 3
4198± 1104 3
16106± 1167 3
秋预组 10 403160± 45147
3 36158± 4129
3 5197± 3165 19105± 1119 33
秋治组 10 438140± 42186 3
36117± 5139 3
6141± 1129 33
21128± 2107
鳖预组 10 307104± 28104 3
32192± 5141 3
3130± 1141 3
11156± 1100 3+
鳖治组 10 340111± 74125 3☆☆ △△ 22188± 3154 3
☆☆ 4197± 3119 33
13148± 1117 3☆ ○ +
与秋水仙碱预防组比较 + P < 0101 ;与秋水仙碱治疗组比较 △P < 0105 , △△P < 0101 ;
与鳖甲抗纤方预防组比较 ☆P < 0105 , ☆☆P < 0101 ;与鳖甲煎丸组比较 ○P < 0101
313 对实验大鼠肝组织形态学的影响
HE染色后光镜下显示:正常组大鼠肝脏细胞核多为单
核 ,核圆形 ,位于中央 ......
梁润英 路 嵘
(河南中医学院·郑州 450003)
摘 要 目的:研究鳖甲抗纤方防治肝纤维化的作用机理。方法:以猪血清诱导免疫损伤性肝纤维化大鼠
为实验对象 ,以鳖甲煎丸、秋水仙碱预防组、秋水仙碱治疗组作为阳性对照 ,空白组作为阴性对照。以大鼠
血清ALT、 ALB、 A G、 HA、 LN、 PCⅢ、Ⅳ- C、肝组织进行 HE常规染色和 VG特殊染色作为主要观察内容。
结果:鳖甲抗纤方与模型组比较ALT、 ALB、 HA、 LN、 PCⅢ、Ⅳ- C均有显著性意义( P < 0105) ,鳖甲抗纤方治
疗组与鳖甲抗纤方预防组比较LN、Ⅳ- C有显著差异。结论:鳖甲抗纤方可抑制胶原合成 ,防治肝纤维化
的作用好于鳖甲煎丸和秋水仙碱 ,而且其预防效果好于治疗效果。
主题词 肝硬化中医药疗法 @鳖甲抗纤方治疗应用 肝硬化超微结构 大鼠
肝纤维化是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时 ,肝脏内纤
维结缔组织异常增生的病理过程 ,轻者成为纤维化 ,重者进
而使肝小叶结构改变 ,假小叶及结节形成 ,成为肝硬化。肝
纤维化是慢性肝病重要的病理特征 ,也是进一步向肝硬化发
展的重要环节。近年来中医药在抗肝纤维化方面取得了较
大的成就 ,充分发挥了中药复方多途径、多层次、多靶点的综
合药理作用 ,具有明显的优势与广阔的应用前景。
鳖甲煎丸是张仲景《金匮要略》中治疗疟疾 瘕的名方 ,有可靠的临床基础 ,临床用于治疗肝炎、肝硬化、血吸虫病及
热病后所致肝脾肿大 ,该药对改善症状、消除肝脾肿大有确
切疗效 ,用于治疗肝癌也有一定的效果。
遵照经方的组方原则和治疗大法 ,针对肝纤维化的病机
特点 ,在鳖甲煎丸抗肝纤维化的基础上 ,对鳖甲煎丸原方进
行了调整 ,组成鳖甲抗纤方 ,既保留原来的主要功能 ,而且更
加有针对性地适用于肝纤维化阶段的病机特点 ,现将其实验
结果报道如下。
1 实验材料
111 动物 雄性 Wistar 大鼠 ,体重 180～200g ,70只 ,由河南
省实验动物中心提供。实验室温22± 2℃,相对湿度60 % ,常
规饲料喂养 ,饮水量不限。
112 药品 鳖甲抗纤方浸膏:由鳖甲、 虫、柴胡、丹皮、大
黄、葶苈子、人参、芍药组成。由河南中医学院中药鉴定教研
室提供。首先将药材浸泡15min ,煎煮2次 ,第1次加8倍水 ,75min ;第2次加6倍水 ,60min ,再用65 %乙醇作醇沉处理 ,静
置24h ,过滤 ,回收乙醇后定容 ,置已恒重的蒸发皿中 ,水浴蒸
干 ,105℃干燥3h后 ,迅速称重 ,即为干浸膏的量(g) ,相当于
原生药2g g浸膏。鳖甲煎丸:杭州胡庆余堂制药厂生产 ,批
号:01041203 ,购自北京同仁堂药店。将鳖甲煎丸粉碎 ,过200
目筛 ,用蒸馏水配成混悬液。秋水仙碱:西双版纳制药厂生
产 ,批号:010218 ,购自北京同仁堂药店。将秋水仙碱片研碎 ,用浓度为012 %的羧甲基纤维素钠配成混悬液。
113 试剂 猪血清( PS) :郑州佰安生物工程有限公司 ,批
号:990419 ,低温冰箱储存。
2 实验方法
211 造模方法 本实验选用猪血清诱导大鼠免疫性肝纤维
化模型。采用未灭活猪血清腹腔注射 ,每周 2 次 ,每次
015ml只 ,连续12W。6W后即可形成肝纤维化。
212 分组 将70只大鼠随机分为7组 ,正常对照组、病理模
型组、鳖甲抗纤方预防组、鳖甲抗纤治疗组、秋水仙碱预防
组、秋水仙碱治疗组、鳖甲煎丸组 ,每组10只。
213 给药方法 各预防组在造模同时给药 ,每天上午灌胃 1
次 ,至12W结束 ,各治疗组(正常组、预防组除外)于造模第
7W给药 ,至第12W结束。每天上午灌胃1次 ,连续6W,正常
组、模型组则用同体积自来水同一时间灌胃。鳖甲抗纤方半
成品干浸膏每克含生药 2g ,用蒸馏水稀释至每毫升含生药
1g。鳖甲抗纤方预防组、治疗组按 2ml 100g体重灌胃;秋水
仙碱预防组、治疗组按每日0101mg 100g体重灌胃;鳖甲煎丸
混悬液 ,每 ml 含生药0115g ,按2ml 100g体重灌胃 ,各组均自
由饮水 ,普通饲料喂养。
214 观察指标
21411 生化指标 实验第 12W末 ,断头取血分离血清 ,HA、LN、 PCⅢ、Ⅳ- C用放射免疫法(RIN) ,SN - 695B型智能放免
测量仪检测。ALT用速率法 ,ALB 用溴甲酚绿法 ,全自动生
化分析仪检测。
21412 组织学变化 第12W结束后 ,将各组大鼠断头处死 ,立即解剖取肝左叶 ,用中性福尔马林液固定 ,72h 取出肝组
织 ,各组取材部位基本一致 ,切取组织块厚度 2mm左右。病
理制作组织切片程序按常规脱水、透明、包埋、切片、然后进
行常规 HE常规染色、胶原纤维特殊VG染色。VG染色用苦
味酸 —酸性品红染色法。最后于光学显微镜下观察肝细胞
炎症反应以及纤维组织增生情况。摄取照片 ,并作统计学处
理。
VG染色统计测试方法:根据立体计量学 ,每个脏器切 3
张组织片 ,每张组织片随机照一张照片 ,用正方形测试格(点
分析法)进行测试。计算压在纤维隔上的交叉点数 ,即为体
密度。
3 实验结果
311 对实验大鼠血清ALT、 ALB、 A G的影响 见表1。
· 61 · 中国中医药科技 2004年第11卷第1期
? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.表1 各组大鼠血清ALT、 ALB、 A G含量的变化(? x ±s)
组别 n ALT(UL) ALB(GL) A G(GL)
正常组 10 36150± 5168 30160± 2188 0177± 0104
模型组 10 67140± 15155
23160± 2141
0156± 0114
鳖甲煎丸组 10 47150± 5146 33
28150± 3110 33
0167± 0113
秋水仙碱组△ 10 42180± 5103 33
27130± 2150 33
0160± 0106 33
鳖甲抗纤方组△ 10 43170± 4176 33
29160± 1184 33
0168± 0106
与正常组相比 P < 0105 , P < 0101 ;与模型组相比 3 P < 0105 , 3 3 P
< 0101 (下同) ; △均为治疗组
312 对实验大鼠血清 HA、 LN、 PCⅢ、Ⅳ- C含量的影响 见
表2。
表2 各组大鼠血清 HA、 LN、 PCⅢ、Ⅳ- C含量的变化( ? x ±s)
组别 n HA(ng ml) LN(ng ml) PCⅢ(μg L) Ⅳ- C(μg L)
正常组 10 265198± 51156 17153± 3157 2158± 0169 8160± 2114
模型组 10 55716± 39135
45105± 5160
9159± 1133
26156± 4157
鳖丸组 10 371151± 30146 3
33121± 3117 3
4198± 1104 3
16106± 1167 3
秋预组 10 403160± 45147
3 36158± 4129
3 5197± 3165 19105± 1119 33
秋治组 10 438140± 42186 3
36117± 5139 3
6141± 1129 33
21128± 2107
鳖预组 10 307104± 28104 3
32192± 5141 3
3130± 1141 3
11156± 1100 3+
鳖治组 10 340111± 74125 3☆☆ △△ 22188± 3154 3
☆☆ 4197± 3119 33
13148± 1117 3☆ ○ +
与秋水仙碱预防组比较 + P < 0101 ;与秋水仙碱治疗组比较 △P < 0105 , △△P < 0101 ;
与鳖甲抗纤方预防组比较 ☆P < 0105 , ☆☆P < 0101 ;与鳖甲煎丸组比较 ○P < 0101
313 对实验大鼠肝组织形态学的影响
HE染色后光镜下显示:正常组大鼠肝脏细胞核多为单
核 ,核圆形 ,位于中央 ......
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