丹参脱病毒及组培快繁技术研究

    温春秀1

    , 谢晓亮1

    , 吴志明1

    , 田 伟1

    , 方 阵2X

    (11 河北省农林科学院 药用植物研究中心, 河北 石家庄 050051; 21 三九医药股份有限公司, 广东 深圳 518029)

    丹参S a lv ia m il t iorrh iz a Bge1 为唇形科鼠尾草

    属多年生草本药用植物, 为常用大宗中药材, 主治心

    血管系统疾病, 具有活血祛瘀、消肿止痛、养血安神

    的功能[ 1 ]。近年来研究表明, 丹参可有效地抑制体外

    肿瘤细胞的增殖, 能高效拮抗乙肝病毒核心抗原

    (HBeA g) , 有较好的抗艾滋病毒(H IV )作用[ 2 ]。一系

    列对重大疾病有疗效的丹参新药的研制开发, 致使

    丹参用量不断增加, 种植面积不断扩大, 已成为国际

    市场重要的药材之一。前期研究发现大田种植丹参,普遍感染黄瓜花叶病毒[ 3 ]

    , 该病田间发病率高, 有些

    田块高达 60%以上, 引起植株退化, 表现为卷叶、皱

    缩、黄化、脉间失绿、矮化等典型症状, 感病植株根系

    变小, 严重影响了丹参的产量和品质, 为此开展了丹

    参脱病毒技术研究。

    1 材料

    YS—13000 超净工作台(上海苏净集团安泰空

    气技术有限公司) , HW Y200 恒温摇床(上海智诚分

    析仪器公司) , ZRX—258D 光照培养箱(杭州钱江仪

    器设备有限公司) , LDZX—40B I自动消毒锅(上海

    申安医疗器械厂) , 3KW 18 高速冷冻离心机(德国

    Sigm a 公司) , XTB—1 体视显微镜和MB2? 酶联免

    疫仪为北京新技术所产品。

    M S 基本培养基中化学试剂和植物激素 62 BA、IBA、IAA、 NAA 以及琼脂、蔗糖等购自华美生物工

    程有限公司, 均为分析纯。

    丹参外植体采集于河北省农业科学院药用植物

    研究中心种质资源圃。狭叶丹参、大叶丹参、皱叶丹

    参、圆叶丹参为本中心进行丹参资源收集、评价研究

    中筛选出的性状相对稳定的栽培类型。这些类型主

    要是根据叶片形态初步划分确定的。

    2 方法

    211 接种诱导芽体再生: 用常规的方法接种丹参根

    段于不定芽诱导培养基上, 诱导不定芽产生, 获得不

    同种质类型的丹参组培无性系。

    212 热处理、切取茎尖: 将丹参试管瓶苗放置于光

    照培养箱中, 在温度为 37～ 38 ℃、湿度 80%、光强

    3 000～ 4 000 lx, 光照时间 12 h? d 的条件下, 恒温

    培养 38 d, 然后取出瓶苗用双目体视显微镜在无菌

    条件下切取012～ 014 mm 茎尖, 接种于不定芽培养

    基1? 3M S+ BA 110 m g? L + IBA 0102 m g? L , 培养

    温度(25±1) ℃, 光强2 000～ 3 000 lx, 光照时间12

    h? d, 得到待检测的丹参小植株。

    213 病毒检测: 采用双抗夹心2酶链免疫吸附测定

    法(DA S2EL ISA ) , 利用CMV 抗血清对脱毒处理的

    待检小植株进行检测, 检测结果在酶链免疫仪上读

    数确定。

    214 培养条件: 以M S 为培养基, 附加不同浓度的

    生长素和细胞分裂素, 琼脂017% , pH518, 其中分化

    培养基(表 1)含 3%蔗糖, 生根培养基(表 2)含 2%

    的蔗糖。培养基分装后在121 ℃下灭菌15 m in。培

    养温度(25±1) ℃, 光强2 000～ 3 000 lx, 光照时间

    12 h? d。

    表 1 分化培养基

    Table 1 Culturemedia for dif feren t iat ion

    培养基号 基本培养基 62 BA? (mg·L - 1) IBA? (mg·L - 1)

    (1) M S 0 012

    (2) M S 015 012

    (3) M S 110 012

    (4) M S 115 012

    (5) M S 210 012

    (6) M S 215 012

    表 2 生根培养基

    Table 2 Culture media for root-form ing

    培养基

    编号

    基本

    培养基

    IBA

    ? (mg·L - 1)

    IAA

    ? (mg·L - 1)

    NAA

    ? (mg·L - 1)

    (7) 1? 2M S 0

    (8) 1? 2M S 012

    (9) 1? 2M S 015

    (10) 1? 2M S 110

    (11) 1? 2M S 012

    (12) 1? 2M S 015

    (13) 1? 2M S 110

    (14) 1? 2M S 012

    (15) 1? 2M S 015

    (16) 1? 2M S 110

    · 7501 · 中草药 Ch inese T radit ional and HerbalD rugs 第 35 卷第 9 期 2004 年 9 月

    X 收稿日期: 2003212219

    基金项目: 河北省科技攻关项目(03220111)

    作者简介: 温春秀(1965—) , 女, 河北藁城人, 副研究员, 主要从事药用植物生物技术及栽培、育种研究。Tel : (0311) 7652129

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.3 结果与分析

    311 热处理与茎尖培养脱病毒

    31111 热处理: 不同丹参种质类型对热处理温度的

    反应有较大差别, 处理的 4 个丹参类型中, 狭叶丹参

    耐热性最强, 大叶丹参较强, 皱叶丹参耐热性一般,圆叶丹参最差(表3)。

    表 3 热处理对不同丹参品系的影响

    Table 3 Ef fect of high temperature treatmen t

    on dif feren tDan shen var iet ies

    丹参品系 处理一周后 处理两周后 处理30 d 后

    狭叶丹参 生长正常 叶缘干枯, 生长正常 少数顶尖死亡

    大叶丹参 生长正常 基部叶片部分干枯, 生长正常 1? 3 顶尖死亡

    皱叶丹参 生长正常 基部叶缘干枯, 生长基本正常 2? 3 部分顶尖死亡

    圆叶丹参

    基部叶片死亡,顶尖叶开始干枯

    茎叶全部干枯

    20 d 后死亡

    31112 茎尖培养: 在超净工作台上, 通过双目实体

    显微镜对热处理后丹参切取 012～ 014 mm 茎尖, 置

    于不定芽诱导培养基上培养 1 个月, 然后检查成活

    率(表 4) ......