收稿日期:2003 - 06 - 06

    作者简介:冯玲玲(1969 - ) ,女,湖北襄樊人,硕士研究生,主要从事植物细胞工程研究。

    丹参愈伤组织的诱导及增殖效应

    冯玲玲,范美华,周吉源

    (华中师范大学生命科学学院 ,武汉 430079)

    摘 要:以丹参( Salvia miltiorrhiza bunge)的幼叶、茎、叶柄为外植体 ,接种于附加2 ,4 - D、 NAA、 KT、 ZT、 6 - BA及其组合的

    MS固体培养基上 ,结果发现单独使用四种植物生长调节物质在一定浓度范围均有愈伤组织产生;最佳组合的诱导培

    养基为MS + 2 ,4 - D0. 5mg L + 6 - BA1. 0mg L。进一步研究发现 ,在黑暗和光照培养条件下 ,愈伤组织增殖呈“S”型 ,且生长

    周期均为30天。

    关键词:愈伤组织;诱导;增殖;丹参

    中图分类号:Q418 文献标识码:A 文章编号:1008 - 9632(2004) 05 - 0025 - 03

    丹参( Salvia miltiorrhiza Bunge) ,唇形科鼠尾草属的

    多年生草本植物。近年来随着丹参制剂在国内、国际心

    血管药物市场占有量不断提高,以及新的应用价值不断

    被发现[1～4]

    ,对丹参的需求和开发也迅速扩大。目前,已从丹参中分离出丹参酮 Ⅰ、丹参酮 Ⅱ、原儿茶醛、迷迭

    香酸等治疗冠心病、抗肿瘤的药物成分,最近有报

    道[5～7]

    迷迭香酸有抗艾滋病病毒(HIV) 活性,但其在植

    株中的含量较低,化学合成和半合成不理想。因此,用

    细胞培养的方法生产重要的丹参次生代谢物有很大的

    市场潜力。

    本文以丹参幼嫩叶片为外植体进行愈伤组织诱导

    和细胞增殖培养,测定了愈伤组织培养增殖过程中的生

    长曲线,目的是探讨细胞培养条件和增殖优化条件,为

    丹参次生代谢物的工业化生产和产业化开发利用提供

    理论依据。

    1 材料与方法

    1. 1 材料

    丹参幼嫩植株取自湖北蕲春丹参药业基地。

    1. 2 实验方法

    1. 2. 1 丹参愈伤组织的诱导

    实验时,取丹参幼嫩叶片,自来水冲洗干净,并用软

    毛刷轻轻刷洗;然后在超静工作台上先用75 %酒精浸泡

    0. 5～1 分钟,无菌水冲洗2 次;再用0. 1 %升汞消毒10～

    13min ,因丹参叶片厚被绒毛,灭菌时可加几滴吐温- 80 ,有助于彻底杀菌,最后用无菌水冲洗3～5 遍。将叶片

    剪成0. 5cm× 0. 5cm的小块,幼茎、叶柄剪成0. 3cm长的

    小段,接种于附加不同生长调节物质的MS固体培养基

    上(pH5. 8 ,高压灭菌) ,在光照条件下诱导形成愈伤组

    织。培养温度为(25± 2) ℃,每天光照时间10～12 小时,光强 40mol· m- 2

    · s

    - 1

    20 天后统计诱导出愈伤组织的外植

    体数并计算诱导率,同时记录愈伤组织的质地、颜色和

    生长情况。按下式计算诱导率:

    诱导率= (长出愈伤组织的外植体数总接种外植

    体的块数) × 100 %

    1. 2. 2 愈伤组织的细胞增殖及生长曲线的测定

    挑选质地、颜色相似的愈伤组织接种于含50mLMS

    + 2 ,4 - D0. 5mg L + 6 - BA1. 5mg L固体培养基150mL 三角瓶

    中,每瓶接种量为1g ,分别置于黑暗和光照(光强40mol·

    m- 2

    · s

    - 1

    , 10～12h d) 条件下培养,培养温度为( 25 ±

    2) ℃。接种后每隔2d 取不同条件下培养的愈伤组织,用滤纸除去附在其上的培养基后称重,以培养时间(Tn)

    为横坐标,以愈伤组织总鲜重 Wn或鲜重增长量(Wn -

    Wn - 1)为纵坐标,绘出愈伤组织总鲜重生长曲线和增长

    量变化曲线。实验重复三次,取其平均值。

    2 结果与讨论

    2. 1 不同激素对丹参愈伤组织的诱导效应

    本实验单独或配比使用2 ,4 - D、 NAA、 KT和6 - BA

    四种植物生长调节物质,附加在MS基本培养基上,20 天

    后观察统计的结果如下:

    2. 1. 1 2 ,4 - D的诱导效应

    不同浓度的2 ,4 - D对幼茎、叶、叶柄等外植体诱导

    产生愈伤组织的效应见表1。

    由表1 可知,2 ,4 - D对丹参外植体形成愈伤组织具

    有强诱导作用,浓度为1. 0mg L 以上,诱导率均能达到

    100 %。但是2 ,4 - D形成的愈伤组织浓度(0. 5mg L 下)

    后期会生出许多透明的须根,在较高浓度(1. 5mg L 以

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    第21卷第5期

    2004年10月 生 物 学 杂 志

    JOURNAL OF BIOLOGY Vol . 21 No. 5

    Oct ,2004

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.上)时形成的愈伤组织不仅生长缓慢,呈灰褐色,而且很

    容易褐化死亡。叶、茎段、叶柄均易形成愈伤组织,但更

    易褐化,可能是由于茎段、叶柄输导组织发达,可以更快

    输送和传递生长素的原因。因此单独使用2 ,4 - D进行

    愈伤组织诱导,效果并不好,收获的愈伤组织质量不高。

    同时我们也进行了光照和黑暗条件下对照培养实验,结

    果显示,黑暗条件下愈伤组织生长较快且不易褐化,呈

    黄绿色。

    表1 2 ,4 - D对愈伤组织的诱导率( %)及对其生长势的影响

    Table 1 Effect of 2 ,4 - D on callus inductivity and its growth potential

    浓度

    (mg L)

    接种外

    植体数

    产生愈伤组织块数 诱导率( %) 生长势

    幼茎 叶 叶柄 幼茎 叶 叶柄幼茎 叶 叶柄

    0. 5 40 35 30 32 87. 5 75 80 + + + +

    1. 0 40 40 40 40 100 100 100 + + + +

    2. 0 40 40 40 40 100 100 100 - + + + -

    3. 0 40 40 40 40 100 100 100 - + + -

    5. 0 40 40 40 40 100 100 100 - + -

    注: - 死亡, +差, + +一般, + + +较好, + + + +旺盛(下同)

    2. 1. 2 NAA的诱导效应

    不同浓度的NAA对幼茎、叶、叶柄等外植体诱导产

    生愈伤组织的效应见表2。

    由表2 可以看出,NAA 对丹参的诱导作用也很强,0. 5mg L 以上浓度诱导率均为 100 % ,但是浓度为 3.

    0mg L 以下时愈伤组织生长10～15 天后很快长出许多

    透明的须根。与2 ,4 - D诱导形成灰褐色水晶样疏松的

    愈伤组织相比,NAA 诱导形成的愈伤组织呈紧密、绿色

    块状。本实验还同时在黑暗条件下进行对照培养发现,15天时光照条件下形成的愈伤组织没有完全包被外植

    体,生长速度较慢,紧密、绿色团块状,而黑暗条件下形

    成的愈伤组织已完全包被外植体,生长较快,疏松、浅黄

    色团块状。

    表2 NAA对愈伤组织的诱导率( %)及对其生长势的影响

    Table 2 Effect of NAA on callus inductivty and its growth potential

    浓度

    (mgL)

    接种外

    植体数

    产生愈伤组织块数 诱导率( %) 生长势

    幼茎 叶 叶柄 幼茎 叶 叶柄 幼茎 叶 叶柄

    0. 5 40 40 40 40 100 100 100 + + +

    1. 0 40 40 40 40 100 100 100 + + + + + + + + +

    2. 0 40 40 40 40 100 100 100 + + + + + + + + + + + +

    3. 0 40 40 40 40 100 100 100 + + + + + + + + +

    5. 0 40 40 40 40 100 100 100 + + + + + +

    2. 1. 3 6 - BA的诱导效应

    不同浓度的6 - BA 对幼茎、叶、叶柄等外植体诱导

    产生愈伤组织的效应见表3 ......