分离自鸡眼草和木蓝的根瘤菌分类研究.PDF
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2006年2月23日
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参见附件(143KB，9页)。
3国家自然科学基金重点资助项目(No. 39130010)
收稿日期:1998205225 ,修回日期:1998210212
分离自鸡眼草和木蓝的根瘤菌分类研究3
韦革宏1
陈文新2
朱铭莪1
(1 西北农业大学资环系 杨凌 712100) (2 中国农业大学生物学院 北京 100094)
提 要 采用数值分类方法对分离自鸡眼草( Kummerowia)和木蓝( Indigof era)的根瘤菌及
已知参比菌株进行聚类分析 ,发现在 83 %的相似性水平上形成 2 个不同与已知菌种的新类
群。以 SDS全细胞蛋白电泳技术快速聚类分群扩大菌株数 ,在 86 %的相似性水平上 ,分离自
鸡眼草的 24 株菌形成第 1 类群 ,分离自木蓝的 20 株菌形成第 2 类群。DNA 同源性测定结
果表明 ,这 2 个类群中心菌株 SH713和 SHL042与13 个已知根瘤菌种的DNA同源性均小于
61 %。因此 ,分离自鸡眼草和木蓝的根瘤菌分别构成 2 个独立的根瘤菌新种群。
关键词 鸡眼草 , 木蓝 , 根瘤菌 , 数值分类 , 全细胞蛋白电泳 , DNA同源性
分类号 Q939. 09 文献标识码 A 文章编号 0001 - 6209 (1999) 05 - 0387 - 95
近年来 ,随着豆科植物根瘤菌资源的不断开发和现代分类技术的应用 ,使根瘤菌的分
类研究得到了迅速的发展 ,同时 ,各种方法的应用又从多角度、多方位揭示了根瘤菌丰富
多样的特征。数值分类是采用大量生理生化性状的测定 ,借助计算机进行聚类分群 ,并可
得到菌群间的鉴别特征和表型特征的描述[1 ]。蛋白质是基因表达的产物 ,关系密切的根
瘤菌在蛋白质组成上有一定的相似性 ,这是蛋白质电泳分析用于根瘤菌分类的理论基础。
根瘤菌细胞中可溶性蛋白种类较多 ,通过 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,可将细胞中的各种
蛋白组分进行分离 ,并对电泳图谱进行聚类分析[2 ]。DNA G+ C mol %及 DNA 同源性的
测定已成为分类鉴定中的基本方法 ,是一个能反映属、种间亲缘关系的遗传型特征。在根
瘤菌分类中 ,其被公认为是建立新种的必要标准之一[1 ]。
本试验在陕甘宁地区野生豆科植物根瘤菌资源调查的基础上 ,对国内外未曾作过分
类研究的分离自鸡眼草和木蓝的根瘤菌 ,应用数值分类方法进行分析 ,然后再进一步采
样 ,以 SDS—全细胞蛋白电泳技术快速聚类分群扩大菌株数 ,并进行 DNA 分析 ,初步确
定其分类地位。
1 材料和方法
111 菌株来源
未知菌株分离自黄土高原—陕西及甘肃的豆科植物鸡眼草属和木蓝属的根瘤 ,YMA
平板纯化、回接原寄主后 ,保存备用。
参比菌株是目前 Int J S yst Bacteriol 上正式发表的13 个快生根瘤菌 ,各菌株种名、宿
主及来源见表 1[3 ]。
39 卷 5 期
1999年 10 月
微 生 物 学 报
Acta Microbiologica Sinica
Vol . 39 No. 5
October 1999
? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.表 1 参比菌株一览表
Table 1 List of the reference st rains
种 名 Species
菌 株 Stains
宿 主 Hosts
来 源 Origins
R . legumi nosarum USDA2370 T
127K17
Medicago sat iva
Phaseol us sp.
美国 美国
R . t ropici
CIAT899 T
BR853
Phaseol us v ulgaris
Leucaena leucocephala
CNPBS
CNPBS
R . hai nanesis
I66 T
H14
Desmodi um si nuat um
D. heterophyl l un
海南 海南
R . et li CFN42 T Phaseol us v ulgaris CNPBS
R . galegae
HAMBI540 T
HAMBI1185
Galega orientalis
Galega sp.
芬兰 美国
R . ciceri USDA3383 Ciceri ariet i num 美国
S . f redii
USD205 T
USDA194
Glyci ne soja
Glyci ne soja
河南 河南
S . meli lot i
USDA1002 T
102F28
Medicago sat iva
Medicago sat iva
美国 美国
S . saheli USDA4102 T Sesbania cannabi ne 美国
S . teranga USDA4101 T Acacia laeta 塞内加尔
M. huakuii
CCBAU2609 T
A106
Ast ragal us si nicus
A . si nicus
南京 湖北
M. lot i
NZP2213 T
NZP2227
L ot us coniculat us
lot us sp.
新西兰 新西兰
M. t ianshanese
AIBST
6
Glycyrriaa pal li dif lora
G. uralensis
新疆 新疆
T : Type st rains CNPBS ;Cent ro National de Pesquisa em Biologia do solo.
1. 2 性状测定
性状测定项目及方法按文献[4 ]进行 ,共测定了包括唯一 C ,N 源试验 ,抗生素敏感性
及对染料和化学药物的耐受性等共 133 个项目。每个试验均设三个重复及阳性和阴性对
照。
113 全细胞蛋白电泳
11311 SDS2聚丙烯酰胺凝胶的制备:浓缩胶浓度为 3 % ,分离胶浓度为 1215 %。以熔化
的琼脂密封胶板的边缘和底部 ,胶厚 014mm。
11312 蛋白质样品的制备;采用改进的方法 ,供试菌株经 YMA 斜面活化后 ,接地 5mL
TY液体培养基内 ,28 ℃振荡培养至对数期 ,12000r min 离心 3min ,转入 115mL Eppen2
dorf 管中 ,用 10mmol L Tris2HCl 缓冲液洗涤后 ,加入 015mL 的上样缓冲液(SDS 500mg ,β 2巯基乙醇 1mL ,甘油 3mL ,溴酚蓝 4mg ,1mol L Tris2HCl (pH6. 8) 2mL , 加水至 10mL) ,煮沸 10min , - 20 ℃反复冻融 3 次 ,临上样前 ,沸水浴 2min ,12000 r min 离心 3min ,上清
液点样。
11313 电泳:电泳缓冲液为 Tris2甘氨酸(pH8. 3) 。点样后 80V 电压电泳 ,待溴酚蓝指示
剂到达分离胶前沿 ,电压增至 300V ,将电泳槽放入 4 ℃的冰箱 ......
收稿日期:1998205225 ,修回日期:1998210212
分离自鸡眼草和木蓝的根瘤菌分类研究3
韦革宏1
陈文新2
朱铭莪1
(1 西北农业大学资环系 杨凌 712100) (2 中国农业大学生物学院 北京 100094)
提 要 采用数值分类方法对分离自鸡眼草( Kummerowia)和木蓝( Indigof era)的根瘤菌及
已知参比菌株进行聚类分析 ,发现在 83 %的相似性水平上形成 2 个不同与已知菌种的新类
群。以 SDS全细胞蛋白电泳技术快速聚类分群扩大菌株数 ,在 86 %的相似性水平上 ,分离自
鸡眼草的 24 株菌形成第 1 类群 ,分离自木蓝的 20 株菌形成第 2 类群。DNA 同源性测定结
果表明 ,这 2 个类群中心菌株 SH713和 SHL042与13 个已知根瘤菌种的DNA同源性均小于
61 %。因此 ,分离自鸡眼草和木蓝的根瘤菌分别构成 2 个独立的根瘤菌新种群。
关键词 鸡眼草 , 木蓝 , 根瘤菌 , 数值分类 , 全细胞蛋白电泳 , DNA同源性
分类号 Q939. 09 文献标识码 A 文章编号 0001 - 6209 (1999) 05 - 0387 - 95
近年来 ,随着豆科植物根瘤菌资源的不断开发和现代分类技术的应用 ,使根瘤菌的分
类研究得到了迅速的发展 ,同时 ,各种方法的应用又从多角度、多方位揭示了根瘤菌丰富
多样的特征。数值分类是采用大量生理生化性状的测定 ,借助计算机进行聚类分群 ,并可
得到菌群间的鉴别特征和表型特征的描述[1 ]。蛋白质是基因表达的产物 ,关系密切的根
瘤菌在蛋白质组成上有一定的相似性 ,这是蛋白质电泳分析用于根瘤菌分类的理论基础。
根瘤菌细胞中可溶性蛋白种类较多 ,通过 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,可将细胞中的各种
蛋白组分进行分离 ,并对电泳图谱进行聚类分析[2 ]。DNA G+ C mol %及 DNA 同源性的
测定已成为分类鉴定中的基本方法 ,是一个能反映属、种间亲缘关系的遗传型特征。在根
瘤菌分类中 ,其被公认为是建立新种的必要标准之一[1 ]。
本试验在陕甘宁地区野生豆科植物根瘤菌资源调查的基础上 ,对国内外未曾作过分
类研究的分离自鸡眼草和木蓝的根瘤菌 ,应用数值分类方法进行分析 ,然后再进一步采
样 ,以 SDS—全细胞蛋白电泳技术快速聚类分群扩大菌株数 ,并进行 DNA 分析 ,初步确
定其分类地位。
1 材料和方法
111 菌株来源
未知菌株分离自黄土高原—陕西及甘肃的豆科植物鸡眼草属和木蓝属的根瘤 ,YMA
平板纯化、回接原寄主后 ,保存备用。
参比菌株是目前 Int J S yst Bacteriol 上正式发表的13 个快生根瘤菌 ,各菌株种名、宿
主及来源见表 1[3 ]。
39 卷 5 期
1999年 10 月
微 生 物 学 报
Acta Microbiologica Sinica
Vol . 39 No. 5
October 1999
? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.表 1 参比菌株一览表
Table 1 List of the reference st rains
种 名 Species
菌 株 Stains
宿 主 Hosts
来 源 Origins
R . legumi nosarum USDA2370 T
127K17
Medicago sat iva
Phaseol us sp.
美国 美国
R . t ropici
CIAT899 T
BR853
Phaseol us v ulgaris
Leucaena leucocephala
CNPBS
CNPBS
R . hai nanesis
I66 T
H14
Desmodi um si nuat um
D. heterophyl l un
海南 海南
R . et li CFN42 T Phaseol us v ulgaris CNPBS
R . galegae
HAMBI540 T
HAMBI1185
Galega orientalis
Galega sp.
芬兰 美国
R . ciceri USDA3383 Ciceri ariet i num 美国
S . f redii
USD205 T
USDA194
Glyci ne soja
Glyci ne soja
河南 河南
S . meli lot i
USDA1002 T
102F28
Medicago sat iva
Medicago sat iva
美国 美国
S . saheli USDA4102 T Sesbania cannabi ne 美国
S . teranga USDA4101 T Acacia laeta 塞内加尔
M. huakuii
CCBAU2609 T
A106
Ast ragal us si nicus
A . si nicus
南京 湖北
M. lot i
NZP2213 T
NZP2227
L ot us coniculat us
lot us sp.
新西兰 新西兰
M. t ianshanese
AIBST
6
Glycyrriaa pal li dif lora
G. uralensis
新疆 新疆
T : Type st rains CNPBS ;Cent ro National de Pesquisa em Biologia do solo.
1. 2 性状测定
性状测定项目及方法按文献[4 ]进行 ,共测定了包括唯一 C ,N 源试验 ,抗生素敏感性
及对染料和化学药物的耐受性等共 133 个项目。每个试验均设三个重复及阳性和阴性对
照。
113 全细胞蛋白电泳
11311 SDS2聚丙烯酰胺凝胶的制备:浓缩胶浓度为 3 % ,分离胶浓度为 1215 %。以熔化
的琼脂密封胶板的边缘和底部 ,胶厚 014mm。
11312 蛋白质样品的制备;采用改进的方法 ,供试菌株经 YMA 斜面活化后 ,接地 5mL
TY液体培养基内 ,28 ℃振荡培养至对数期 ,12000r min 离心 3min ,转入 115mL Eppen2
dorf 管中 ,用 10mmol L Tris2HCl 缓冲液洗涤后 ,加入 015mL 的上样缓冲液(SDS 500mg ,β 2巯基乙醇 1mL ,甘油 3mL ,溴酚蓝 4mg ,1mol L Tris2HCl (pH6. 8) 2mL , 加水至 10mL) ,煮沸 10min , - 20 ℃反复冻融 3 次 ,临上样前 ,沸水浴 2min ,12000 r min 离心 3min ,上清
液点样。
11313 电泳:电泳缓冲液为 Tris2甘氨酸(pH8. 3) 。点样后 80V 电压电泳 ,待溴酚蓝指示
剂到达分离胶前沿 ,电压增至 300V ,将电泳槽放入 4 ℃的冰箱 ......
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