收稿日期: 2003212208; 修回日期: 2004202223

    基金项目: 河南省杰出人才创新基金(0221000700) ; 国家攻关引导项目(2003BA 761C)

    第一作者: 张振臣(1964- ) , 男, 河南延津人, 研究员, 博士, 主要从事植物病毒病研究; E2 mail : zhangzc@public2. zz . ha . cn

    植物病理学报

    ACTA PHYTO PA THOLO GICA S IN ICA 34 (5) : 3952399 (2004)

    河南省地黄病毒病初步鉴定

    张振臣, 张丽芳, 乔 奇, 王永江, 靳秀兰 (河南省农业科学院植物保护研究所, 郑州 450002)

    摘要: 利用血清学、 RT 2 PCR 并结合核苷酸序列测定等方法, 对河南省地黄病毒病进行了初步鉴定。结果表明, 烟草花叶病

    毒(TMV )为侵染地黄的主要病毒; 对TMV 地黄分离物(TMV 2 RH)CP 基因的序列分析结果表明, TMV 2 RH 与TMV 2 U 1

    株系CP 基因的核苷酸同源性为 86. 5% ,氨基酸同源性为 94. 3%; 与已发表的TMV 其它株系CP 基因的核苷酸同源性在

    76. 3%～ 88. 5%之间, 氨基酸同源性在 79. 3%～ 95. 0%之间, 同源性较低。根据不同株系CP 的氨基酸序列进化树分析, 推

    测该分离物可能为TMV 的一个新株系。

    关键词: 地黄; 病毒病; 烟草花叶病毒; 株系

    Iden t if ica t ion of v ira l pa thogen s of Rehm ann ia g lu t inosa disea se in Henan Prov ince

    ZHAN G Zhen2 chen, ZHAN G L i2 fang, Q IAO Q i, WAN G Yong2jiang, J IN Xiu2lan ( Inst itute of P lant

    P ro tect ion, Henan A cademy of A gr icultural Sciences, Zhengzhou 450002, Ch ina)

    Abstract : V iru s species infected R ehm ann ia g lu t inosa w ere detected by u sing EL ISA , RT 2 PCR and nu2

    cleo t ide (n t) sequence analysis of coat p ro tein (CP) gene . The resu lt s revealed that T obacco m osa ic v irus

    (TMV ) w as the m ajo r viru s infect ing R ehm ann ia g lu t inosa in Henan P rovince . CP gene of TMV f rom

    R ehm ann ia g lu t inosa (TMV 2 RH) w as cloned and sequenced . The sequence analysis show ed that the n t

    and am ino acid (aa) sequence of TMV 2 RH CP w ere 86. 5% and 94. 3% iden t ical to TMV 2 U 1 st rain, and

    w ere 76. 3% to 88. 5% and 79. 3% to 95. 0% iden t ical to o ther TMV st rain s, respect ively . A cco rding to

    the resu lt s of phylogenet ic t ree generated based on aa sequences of CP genes, it is suppo sed that TMV 2

    RH m ay be a new st rain of TMV.

    Key words: R ehm ann ia g lu t inosa; viru s disease; T obacco m osa ic v irus; st rain

    中图分类号: S432141; S4351672 文献标识码: A 文章编号: 041220914 (2004) 0520395205

    地黄(R ehm ann ia g lu t inosa)又名生地, 为我国

    中医药上最常用的药材。病毒病危害是地黄生产中

    的一大难题, 病毒病可造成地黄产量降低、品质下

    降和种性退化, 严重影响地黄生产和出口创汇[ 1 ]。

    目前, 对危害地黄的病毒种类还缺乏深入系统的研

    究。1962 年田 波等[ 2 ]

    首先分离到地黄退化病毒

    (DDV ) , 鉴定为烟草花叶病毒属(T obam ov irus)成

    员。1994 年余方平等[ 3 ]

    利用鉴别寄主和血清学方

    法, 从河南等地的地黄上分离到 4 种病毒, 其中 2

    种分别鉴定为烟草花叶病毒(TMV )和黄瓜花叶病

    毒(CMV ) , 另 2 种未确定分类地位。2000～ 2003

    年作者利用血清学、 PCR 并结合序列测定等方法,对河南省地黄的病毒种类进行了初步研究, 现将结

    果报道如下。

    1 材料与方法

    1 . 1 材料

    地黄病毒病样品分别采自河南省温县和孟县

    等地。克隆载体pMD182 T、反转录试剂盒、各种限

    制性内切酶、 T 4DNA 连接酶、 T aq DNA 聚合酶等

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.购自 TaKaRa 公司; RNA 提取试剂盒、胶回收试

    剂盒等购自上海生工生物工程公司; 碱性磷酸酯酶

    标记的P ro tein A 为Sigm a 公司产品; 其它药品试

    剂均由河南省农科院植保所提供。烟草花叶病毒

    (TMV )等6 种病毒的抗血清分别由中国科学院遗

    传发育研究所和中国农业大学植病系惠赠。

    1 . 2 方法

    1. 2. 1 地黄病毒病发生情况调查 在温县、博爱

    和孟县等地黄产区, 在每年的地黄病毒病发生高峰

    期(5～ 8 月份)进行田间调查, 记载不同地黄品种

    的病毒病发生情况。

    1. 2. 2 血清学鉴定 利用TMV 等 6 种病毒的抗

    血清和间接 EL ISA 法对地黄病毒病样品进行检

    测, 每一样品重复2 次。

    1. 2. 3 RT 2 PCR 检测和TMV 地黄分离物CP 基

    因的克隆及序列分析 1)引物: 根据 GenBank 中

    已登录的TMV 核苷酸序列(登录号为V 01408 和

    Z92909) , 设计并合成了一对简并引物 P5 和 P3。

    P5: 5′ 2GTCGC (C? G ) GA (A? T ) TC ( G? T )

    GA TTCGT ( T? A ) TTA 23′ ; P3: 5′ 2G ( G? A )

    A TTCGAA (C? T ) CCCTCGCTTT (A? T ) TT 23′ ......