高效液相色谱法测定蟾酥中有效成分的含量.PDF
http://www.100md.com
2006年2月23日
| 第1页 |
参见附件(86KB，4页)。
高效液相色谱法测定蟾酥
中有效成分的含量
王京辉 金伟 金红宇 周富荣
(北京市药品检验所 北京 100035)
摘要 目的:建立 HPLC法测定蟾酥药材中有效成分的含量。方法:选用 0. 5 %磷酸二氢钾溶液2乙
腈(50 :50) (磷酸调节pH为 3. 25 ±0. 02)为流动相测定蟾酥药材中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。
结果:测定组分具有良好的线性关系和分离度 ,华蟾酥毒基的平均回收率为 100. 35 % , RSD = 1. 86 % ,脂蟾毒配基的平均回收率为 100. 38 %, RSD = 2. 09 %。结论:本方法简便、快速、准确 ,具有实用性。
关键词 蟾酥 高效液相 华蟾酥毒基 脂蟾毒配基
蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍 B uf o buf o
gargariz ans Cantor 或黑眶蟾蜍 B uf o melanos2
t ict us Schneider 的干燥分泌物 ,具有解毒、止
痛、开窍醒神的功能[1 ]
,较普遍地用于中药成
方制剂中。其活性成分有蟾蜍二烯内酯(分为
蟾毒配基、蟾毒色胺两类) 、蟾酥碱等。对蟾蜍
二烯内酯的研究文献报道较多 ,定量分析方法
有紫外分光光度法[1 ]
、高效液相色谱法[2 ,3 ]
、薄
层色谱法[4 ]
、气相色谱法。1995 年版《中国药
典》采用紫外分光光度法测定蟾蜍二烯内酯类
成分 ,为更准确地反映蟾酥中有效成分的含量 ,我们对蟾酥中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基用
HPLC法进行了较系统的研究 ,并以两者之和
作为定量指标测定了 6 个不同地区 9 批药材的
含量。实验结果表明 ,本方法操作简便 ,灵敏度
高 ,重现性好。
1 仪器、试剂与样品
高效液相色谱仪 ,岛津 LC26A ;乙腈(天津
四友)为色谱纯 ,其它试剂为分析纯;对照品华
蟾酥毒基、脂蟾毒配基(中国药品生物制品检定
所提供) 。
2 实验与结果
2. 1 方法学考察
2. 1. 1 色谱条件 色谱柱 C18 ( 4. 6mm ×
50mm) ① Alltech 10 μm②MACHEREY 2NAGEL
5 μm③YWG 10 μm。流动相 0. 5 %磷酸二氢钾2
乙腈(50∶ 50) (磷酸调节pH值为 3. 25 ±0. 02) 。
柱温 40 ℃。检测波长 296nm。流速 0. 8ml
min。分离度华蟾酥毒基和脂蟾毒配基、两者
与其它成分的分离度均大于 1. 5。理论塔板
数 ,华蟾酥毒基及脂蟾毒配基均大于 4000 (见
附图) 。
附图 高效液相色谱图
A.对照品 B.蟾酥样品
1.华蟾酥毒基 2.脂蟾毒配基
2. 1. 2 对照品溶液的制备 精密称取华蟾酥
毒基、脂蟾毒配基对照品 ,加甲醇制成每1ml 各
含 0. 05mg的溶液 ,作为对照品溶液。
2. 1. 3 供试品溶液的制备 取蟾酥细粉约
25mg ,精密称定 ,置具塞锥形瓶中 ,精密加甲醇
20ml ,称重 ,置水浴上加热回流提取 1h ,放冷 ,称重 ,补足甲醇减失的重量 ,摇匀 ,滤过 ,取续滤
液作为供试品溶液。
2. 1. 4 检测波长的选择 取两种对照品适量
· 156 · 中国中药杂志 1998年第 23 卷第 11 期
? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.分别加流动相使溶解 ,并稀释成适当浓度 ,经紫
外光谱扫描测定 ,华蟾酥毒基在 294nm 处 ,脂
蟾毒配基在 299nm处有最大吸收 ,而在 296nm
处二者均接近最大吸收 ,故选择 296nm 作为测
定吸收波长。
2. 1. 5 线性关系考察 精密吸取华蟾酥毒基
对照品溶液(0. 114mg ml) ,脂蟾毒配基对照品
溶液(0. 116mg ml) 0. 8 ,1. 6 ,2. 4 ,3. 2 ,4. 0ml ,分别置 5ml 量瓶中 ,加甲醇稀释到刻度 ,摇匀 ,分别精密吸取 20 μl ,注入高效液相色谱仪 ,测
定。分别以对照品进样量为横坐标 ,峰面积积
分值为纵坐标 ,绘制标准曲线。回归方程为:华
蟾酥毒基 Y = 3712 ×102
+ 1763 , r = 0. 9999 ;
脂蟾毒配基 Y = 3 7 8 9 ×1 02
+ 3 7 6 7 , r =
0. 9999。结果表明 :华蟾酥毒基在0 . 36μg～
1. 8 μg ,脂蟾毒配基在 0. 37 μg～1. 9 μg ,范围内
线性关系良好。
2. 1. 6 稳定性实验 取供试品溶液 ,分别于配
制后 0 ,2 ,4 ,8 ,12 ,24h测定 ,结果表明供试品溶
液在 24h内基本稳定。
2. 1. 7 精密度实验 精密吸取同一供试品溶
液 ,连续进样测定 6 次 ,峰面积 RSD 华蟾酥毒
基为 1. 55 % ,脂蟾毒配基为 0. 93 % ,表明精密
度良好。
2. 1. 8 重现性实验 取同一批号的样品进行
6次测定 ,以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基之和作
为定量指标 ,求得 RSD 为 1. 14 %。
2. 1. 9 回收率实验 精密称取己知含量的同
一批号的蟾酥样品 12. 5mg ,分别精密加入华蟾
酥毒基、脂蟾毒配基对照品溶液(28. 4 μg ml ,29. 0 μg ml) 20ml ,按供试品溶液的制备方法测
定 ,结果见表 1 ,表 2。
表 1 华蟾酥毒基回收率实验
测得量 回收率 平均回收率 RSD
mg % % %
0. 564 99. 30
0. 588 103. 52
0. 571 100. 53 100. 35 1. 86
0. 562 98. 94
0. 565 99. 47
注:加入量均为0. 568mg
表 2 脂蟾毒配基回收率实验
测得量 回收率 平均回收率 RSD
mg % % %
0. 577 99. 48
0. 603 103. 97
0. 582 100. 34 100. 38 2. 09
0. 572 98. 62
0. 577 99. 48
注:加入量均为0. 580mg
2. 2 蟾酥药材的测定结果 以华蟾酥毒基和
脂蟾毒配基的和作为定量指标 ,按上述方法测
定 9 批样品的结果见表 3。
表 3 蟾酥药材测定结果 %
编号 样品来源 样品形状 华蟾酥毒
基含量
脂蟾毒配
基含量
两者
之和
1 同仁堂药店 细纷,深棕色 4. 04 4. 59 8. 63
2 安国药市 块,黑棕色 4. 91 3. 32 8. 23
3 安国药市 片,黑色 3. 96 2. 80 6. 76
4 安国药市 团,深棕褐色 4. 90 4. 38 9. 28
5 江苏 片,黑色 3. 44 6. 55 9. 99
6 厦门 块,黑色 5. 53 3. 20 8. 73
7 佳木斯 块,黑色 3. 22 7. 38 10. 60
8 哈尔滨 团,深棕褐色 5. 60 4. 99 10. 59
9 日本 细纷,黄棕色 5. 62 4. 57 10. 19
根据表中数据 ,暂规定本品以干燥品计
算 ,含华蟾酥毒基[ C26 H34O6 ]和脂蟾毒配基
[C24H32O4 ]之和不得少于 6. 0 % ......
中有效成分的含量
王京辉 金伟 金红宇 周富荣
(北京市药品检验所 北京 100035)
摘要 目的:建立 HPLC法测定蟾酥药材中有效成分的含量。方法:选用 0. 5 %磷酸二氢钾溶液2乙
腈(50 :50) (磷酸调节pH为 3. 25 ±0. 02)为流动相测定蟾酥药材中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。
结果:测定组分具有良好的线性关系和分离度 ,华蟾酥毒基的平均回收率为 100. 35 % , RSD = 1. 86 % ,脂蟾毒配基的平均回收率为 100. 38 %, RSD = 2. 09 %。结论:本方法简便、快速、准确 ,具有实用性。
关键词 蟾酥 高效液相 华蟾酥毒基 脂蟾毒配基
蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍 B uf o buf o
gargariz ans Cantor 或黑眶蟾蜍 B uf o melanos2
t ict us Schneider 的干燥分泌物 ,具有解毒、止
痛、开窍醒神的功能[1 ]
,较普遍地用于中药成
方制剂中。其活性成分有蟾蜍二烯内酯(分为
蟾毒配基、蟾毒色胺两类) 、蟾酥碱等。对蟾蜍
二烯内酯的研究文献报道较多 ,定量分析方法
有紫外分光光度法[1 ]
、高效液相色谱法[2 ,3 ]
、薄
层色谱法[4 ]
、气相色谱法。1995 年版《中国药
典》采用紫外分光光度法测定蟾蜍二烯内酯类
成分 ,为更准确地反映蟾酥中有效成分的含量 ,我们对蟾酥中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基用
HPLC法进行了较系统的研究 ,并以两者之和
作为定量指标测定了 6 个不同地区 9 批药材的
含量。实验结果表明 ,本方法操作简便 ,灵敏度
高 ,重现性好。
1 仪器、试剂与样品
高效液相色谱仪 ,岛津 LC26A ;乙腈(天津
四友)为色谱纯 ,其它试剂为分析纯;对照品华
蟾酥毒基、脂蟾毒配基(中国药品生物制品检定
所提供) 。
2 实验与结果
2. 1 方法学考察
2. 1. 1 色谱条件 色谱柱 C18 ( 4. 6mm ×
50mm) ① Alltech 10 μm②MACHEREY 2NAGEL
5 μm③YWG 10 μm。流动相 0. 5 %磷酸二氢钾2
乙腈(50∶ 50) (磷酸调节pH值为 3. 25 ±0. 02) 。
柱温 40 ℃。检测波长 296nm。流速 0. 8ml
min。分离度华蟾酥毒基和脂蟾毒配基、两者
与其它成分的分离度均大于 1. 5。理论塔板
数 ,华蟾酥毒基及脂蟾毒配基均大于 4000 (见
附图) 。
附图 高效液相色谱图
A.对照品 B.蟾酥样品
1.华蟾酥毒基 2.脂蟾毒配基
2. 1. 2 对照品溶液的制备 精密称取华蟾酥
毒基、脂蟾毒配基对照品 ,加甲醇制成每1ml 各
含 0. 05mg的溶液 ,作为对照品溶液。
2. 1. 3 供试品溶液的制备 取蟾酥细粉约
25mg ,精密称定 ,置具塞锥形瓶中 ,精密加甲醇
20ml ,称重 ,置水浴上加热回流提取 1h ,放冷 ,称重 ,补足甲醇减失的重量 ,摇匀 ,滤过 ,取续滤
液作为供试品溶液。
2. 1. 4 检测波长的选择 取两种对照品适量
· 156 · 中国中药杂志 1998年第 23 卷第 11 期
? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.分别加流动相使溶解 ,并稀释成适当浓度 ,经紫
外光谱扫描测定 ,华蟾酥毒基在 294nm 处 ,脂
蟾毒配基在 299nm处有最大吸收 ,而在 296nm
处二者均接近最大吸收 ,故选择 296nm 作为测
定吸收波长。
2. 1. 5 线性关系考察 精密吸取华蟾酥毒基
对照品溶液(0. 114mg ml) ,脂蟾毒配基对照品
溶液(0. 116mg ml) 0. 8 ,1. 6 ,2. 4 ,3. 2 ,4. 0ml ,分别置 5ml 量瓶中 ,加甲醇稀释到刻度 ,摇匀 ,分别精密吸取 20 μl ,注入高效液相色谱仪 ,测
定。分别以对照品进样量为横坐标 ,峰面积积
分值为纵坐标 ,绘制标准曲线。回归方程为:华
蟾酥毒基 Y = 3712 ×102
+ 1763 , r = 0. 9999 ;
脂蟾毒配基 Y = 3 7 8 9 ×1 02
+ 3 7 6 7 , r =
0. 9999。结果表明 :华蟾酥毒基在0 . 36μg～
1. 8 μg ,脂蟾毒配基在 0. 37 μg～1. 9 μg ,范围内
线性关系良好。
2. 1. 6 稳定性实验 取供试品溶液 ,分别于配
制后 0 ,2 ,4 ,8 ,12 ,24h测定 ,结果表明供试品溶
液在 24h内基本稳定。
2. 1. 7 精密度实验 精密吸取同一供试品溶
液 ,连续进样测定 6 次 ,峰面积 RSD 华蟾酥毒
基为 1. 55 % ,脂蟾毒配基为 0. 93 % ,表明精密
度良好。
2. 1. 8 重现性实验 取同一批号的样品进行
6次测定 ,以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基之和作
为定量指标 ,求得 RSD 为 1. 14 %。
2. 1. 9 回收率实验 精密称取己知含量的同
一批号的蟾酥样品 12. 5mg ,分别精密加入华蟾
酥毒基、脂蟾毒配基对照品溶液(28. 4 μg ml ,29. 0 μg ml) 20ml ,按供试品溶液的制备方法测
定 ,结果见表 1 ,表 2。
表 1 华蟾酥毒基回收率实验
测得量 回收率 平均回收率 RSD
mg % % %
0. 564 99. 30
0. 588 103. 52
0. 571 100. 53 100. 35 1. 86
0. 562 98. 94
0. 565 99. 47
注:加入量均为0. 568mg
表 2 脂蟾毒配基回收率实验
测得量 回收率 平均回收率 RSD
mg % % %
0. 577 99. 48
0. 603 103. 97
0. 582 100. 34 100. 38 2. 09
0. 572 98. 62
0. 577 99. 48
注:加入量均为0. 580mg
2. 2 蟾酥药材的测定结果 以华蟾酥毒基和
脂蟾毒配基的和作为定量指标 ,按上述方法测
定 9 批样品的结果见表 3。
表 3 蟾酥药材测定结果 %
编号 样品来源 样品形状 华蟾酥毒
基含量
脂蟾毒配
基含量
两者
之和
1 同仁堂药店 细纷,深棕色 4. 04 4. 59 8. 63
2 安国药市 块,黑棕色 4. 91 3. 32 8. 23
3 安国药市 片,黑色 3. 96 2. 80 6. 76
4 安国药市 团,深棕褐色 4. 90 4. 38 9. 28
5 江苏 片,黑色 3. 44 6. 55 9. 99
6 厦门 块,黑色 5. 53 3. 20 8. 73
7 佳木斯 块,黑色 3. 22 7. 38 10. 60
8 哈尔滨 团,深棕褐色 5. 60 4. 99 10. 59
9 日本 细纷,黄棕色 5. 62 4. 57 10. 19
根据表中数据 ,暂规定本品以干燥品计
算 ,含华蟾酥毒基[ C26 H34O6 ]和脂蟾毒配基
[C24H32O4 ]之和不得少于 6. 0 % ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(86KB，4页)。