漆树酶固定化及其性质研究.pdf
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2006年2月23日
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V0 1 .11
l 9 9 0 年 1月
高 等 学 校 化 学 学 报
0 I 瑚 CL JoURNAL OF CH1 NESE Um VERSl T1 ES
NO.1
漆树酶固定化及其性质研究
詹东风 杜子 民 栈保 功
( 武投大学资薄开发与应用技术研究所)
摘要 本文舟绍了用过菠盎属水台氧化物 固定化津树蒜酶的方法. 考察 了羹台法固定津树酶曲最
适条件. 对 固定{ 匕 前后痞酶的性质进行了比较， 井分析了造成固定化酶与潜音酶性质差异的愿 因.
关键词 瘁树酶 过菠盎羁水音氧化枷 固定化酶
漆酶的固定化大部分以真菌漆酶为对象 ， 漆树漆酶的固定化并不多见. 我们设想以过
渡金属水合氧化物为载体对漆酶进行固定化， 使酶与载体的结合点主要集中在漆酶糖蛋白的
含糖部分. 从而减少漆酶失活的可能性. 本文着重介绍过渡金属水合氧化物固定化漆酶的制备
方法 ， 并对固定化前后漆酶的性质进行比较.
材 料 与 方 法
l 材 料
漆酶： 根据 R e i n h a mma r的方法 ， 从湖北利川毛坝漆中分离得到电泳纯漆酶， 并对其物理
化学参数进行 了测定( 表 1 ) [ ” .
表 l 瘁酶理{ 匕 参数
_ 一 M o 、 ^I · 和 ^ “丹 别 表示样 品在 2 8 帅m、 6 I 6 m 和 2 5 帅m 处的 吸光崖 ，6 . 酶比活力单位为， 3 0 ℃时. 1 B壤酶加入 1 . 5 B Xj O - ~ m o l L对苯二胺底物浒{ 葭( 用 0 . I l 6 l ， L p T a 7 5的磷酸氢二钠
磷酸二氲钾埋冲帮渣配射) 中一 单位时问内催化反应使产糖在 3 3 6 m 处吸光虚靛生的变化值.
对苯二胺： 化学纯 ， 用前经升华纯化. 磷酸盐缓冲液： 用 Na HP 0 | KH ~ P O· 配制. 其它试荆
均为分析纯. 未经进一步纯化. 漆酶活性及动力学数据用S h i ma d z u U V一 3 0 0仪测定.
2 方 法
2 . 1 固定化漆酶 的制备 以过渡金属氯化物( T i C i hz r a· 、 F c C I a 、 C u C I l 、 Z n C l ) 为原料 ，用 1 t oo l L的盐酸配制成 0 . 6 5 mo i L的溶液， 搅拌下用 2 t oo l L的氨水溶液中和至 p H 7 0.
随着氨水的加入体系中形成水合氧化物沉淀， 搅拌使之均匀悬浮. 冰水浴下慢慢漓加漆酶水溶
液( 1 O mg mL ， 一般载体与酶量之比( w w) 控制在 1 帅～2 0 0为宜) t 搅拌反应 2 h后滤去母液.
固定化酶分别用 0 . 5 mo l L的氯化钠溶液和蒸馏水洗至洗出液中无酶可检 出为止. 合并反应
上清液和洗涤液， 分别测定溶液和固定化酶的活力. 固定化漆酶用 0 . 1 mo l L p H 6 . 5的磷酸盐
缓冲液悬浮保存于冰箱中( 5 ℃) .
收瞢日期t 1 9 8 ~0 6 — 2 1 . 联系人 t 詹东风.
国塞自然科学基金资助 詹
维普资讯 http:www.cqvip.com
2 . 2 漆酶活 性 的秘 定 在 3 0 ℃下 ， 于 】c m 的检测池 和参 比池 中分 别加 入 3 mL I . 3 5 ×
】 0 - S mo l L对苯二胺溶液( 用 0 . I mo l L 7 . 5的磷酸盐缓冲液配翩) . 取 2 0 ) ~ L酶液( 含 I . 6 H 8
漆酶) 加入检测池中， 混均后 0 . 5 mi n ， 记录 3 3 6 n m处吸光度的变化. 固定化漆酶测定与游离酶
相同， 每次测定时在检测池中加固定化酶悬浮液 i 0 0 H L ， 同时在参比池中加入等量的热失活固
定化酶 ( 】 0 0 ~ C下处理 3 0 mi n ) ， 记录 3 3 6 n m处吸光度的变化. 取等量的固定化酶悬浮液于称
量瓶中 1 0 0 X ~ 下 衡重 ， 然后计算固定化酶的 比活力.
2 . 3 固定化酶重复使用试验 取 6 . 5 ×1 0 活力单位的水合氧化锆固定化漆酶于 1 0 r n L
的离心管中， 加 1 . 3 5 ×1 0 - 3 mo l L对苯二胺底物溶液( 用 0 . Imo l L p H7 . 5的磷酸盐缓冲液配
制 ) 8 mL， 充分混合后于 3 0 ℃水浴中恒温反应 2 5 mi n ( 间隙搅动) . 离心分出反应液( 5 1 8 0 ×g ，] 0 mi n ) ， 以未加酶的底物溶液( 同样保温) 为参 比. 测定反应液在 3 3 6 n m处的吸光度. 重复以上
操作观察固定化酶活性的变化.
结 果 与 讨 论
l 不同过渡金属对漆醵的固定化效果
过渡金属水合氧化物具有螫合蛋白质的能力， 从而被成功地用作固定化酶的载体∽. 以锆
为例 ， 当 Z r C 1 . 溶于水时得到： [ z r ( Hz o) 。 ] ¨、 [ z f ( H ) ( o H) ] ¨、 [ z r ( H： o) e ( OH) ] 件和[ z r ·
( H o) ( o H) a ] “. 过渡金属上的配基 r 如 H 0、 O H等) 可以被新的配基所取代. 多糖羟基 以及
蛋白质中游离的羟基、 氨基、 羧基、 琉基团等都是过渡金属的有效配基.
漆树酶是一种含糖量高达 4 5 的糖蛋白. 表2 不同过渡盘属水台氧化物对漆酶的固定化
用过渡金属 氧化物固定化漆酶 ......
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漆树酶固定化及其性质研究
詹东风 杜子 民 栈保 功
( 武投大学资薄开发与应用技术研究所)
摘要 本文舟绍了用过菠盎属水台氧化物 固定化津树蒜酶的方法. 考察 了羹台法固定津树酶曲最
适条件. 对 固定{ 匕 前后痞酶的性质进行了比较， 井分析了造成固定化酶与潜音酶性质差异的愿 因.
关键词 瘁树酶 过菠盎羁水音氧化枷 固定化酶
漆酶的固定化大部分以真菌漆酶为对象 ， 漆树漆酶的固定化并不多见. 我们设想以过
渡金属水合氧化物为载体对漆酶进行固定化， 使酶与载体的结合点主要集中在漆酶糖蛋白的
含糖部分. 从而减少漆酶失活的可能性. 本文着重介绍过渡金属水合氧化物固定化漆酶的制备
方法 ， 并对固定化前后漆酶的性质进行比较.
材 料 与 方 法
l 材 料
漆酶： 根据 R e i n h a mma r的方法 ， 从湖北利川毛坝漆中分离得到电泳纯漆酶， 并对其物理
化学参数进行 了测定( 表 1 ) [ ” .
表 l 瘁酶理{ 匕 参数
_ 一 M o 、 ^I · 和 ^ “丹 别 表示样 品在 2 8 帅m、 6 I 6 m 和 2 5 帅m 处的 吸光崖 ，6 . 酶比活力单位为， 3 0 ℃时. 1 B壤酶加入 1 . 5 B Xj O - ~ m o l L对苯二胺底物浒{ 葭( 用 0 . I l 6 l ， L p T a 7 5的磷酸氢二钠
磷酸二氲钾埋冲帮渣配射) 中一 单位时问内催化反应使产糖在 3 3 6 m 处吸光虚靛生的变化值.
对苯二胺： 化学纯 ， 用前经升华纯化. 磷酸盐缓冲液： 用 Na HP 0 | KH ~ P O· 配制. 其它试荆
均为分析纯. 未经进一步纯化. 漆酶活性及动力学数据用S h i ma d z u U V一 3 0 0仪测定.
2 方 法
2 . 1 固定化漆酶 的制备 以过渡金属氯化物( T i C i hz r a· 、 F c C I a 、 C u C I l 、 Z n C l ) 为原料 ，用 1 t oo l L的盐酸配制成 0 . 6 5 mo i L的溶液， 搅拌下用 2 t oo l L的氨水溶液中和至 p H 7 0.
随着氨水的加入体系中形成水合氧化物沉淀， 搅拌使之均匀悬浮. 冰水浴下慢慢漓加漆酶水溶
液( 1 O mg mL ， 一般载体与酶量之比( w w) 控制在 1 帅～2 0 0为宜) t 搅拌反应 2 h后滤去母液.
固定化酶分别用 0 . 5 mo l L的氯化钠溶液和蒸馏水洗至洗出液中无酶可检 出为止. 合并反应
上清液和洗涤液， 分别测定溶液和固定化酶的活力. 固定化漆酶用 0 . 1 mo l L p H 6 . 5的磷酸盐
缓冲液悬浮保存于冰箱中( 5 ℃) .
收瞢日期t 1 9 8 ~0 6 — 2 1 . 联系人 t 詹东风.
国塞自然科学基金资助 詹
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2 . 2 漆酶活 性 的秘 定 在 3 0 ℃下 ， 于 】c m 的检测池 和参 比池 中分 别加 入 3 mL I . 3 5 ×
】 0 - S mo l L对苯二胺溶液( 用 0 . I mo l L 7 . 5的磷酸盐缓冲液配翩) . 取 2 0 ) ~ L酶液( 含 I . 6 H 8
漆酶) 加入检测池中， 混均后 0 . 5 mi n ， 记录 3 3 6 n m处吸光度的变化. 固定化漆酶测定与游离酶
相同， 每次测定时在检测池中加固定化酶悬浮液 i 0 0 H L ， 同时在参比池中加入等量的热失活固
定化酶 ( 】 0 0 ~ C下处理 3 0 mi n ) ， 记录 3 3 6 n m处吸光度的变化. 取等量的固定化酶悬浮液于称
量瓶中 1 0 0 X ~ 下 衡重 ， 然后计算固定化酶的 比活力.
2 . 3 固定化酶重复使用试验 取 6 . 5 ×1 0 活力单位的水合氧化锆固定化漆酶于 1 0 r n L
的离心管中， 加 1 . 3 5 ×1 0 - 3 mo l L对苯二胺底物溶液( 用 0 . Imo l L p H7 . 5的磷酸盐缓冲液配
制 ) 8 mL， 充分混合后于 3 0 ℃水浴中恒温反应 2 5 mi n ( 间隙搅动) . 离心分出反应液( 5 1 8 0 ×g ，] 0 mi n ) ， 以未加酶的底物溶液( 同样保温) 为参 比. 测定反应液在 3 3 6 n m处的吸光度. 重复以上
操作观察固定化酶活性的变化.
结 果 与 讨 论
l 不同过渡金属对漆醵的固定化效果
过渡金属水合氧化物具有螫合蛋白质的能力， 从而被成功地用作固定化酶的载体∽. 以锆
为例 ， 当 Z r C 1 . 溶于水时得到： [ z r ( Hz o) 。 ] ¨、 [ z f ( H ) ( o H) ] ¨、 [ z r ( H： o) e ( OH) ] 件和[ z r ·
( H o) ( o H) a ] “. 过渡金属上的配基 r 如 H 0、 O H等) 可以被新的配基所取代. 多糖羟基 以及
蛋白质中游离的羟基、 氨基、 羧基、 琉基团等都是过渡金属的有效配基.
漆树酶是一种含糖量高达 4 5 的糖蛋白. 表2 不同过渡盘属水台氧化物对漆酶的固定化
用过渡金属 氧化物固定化漆酶 ......
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