第 4 9卷 第 2期

    2 0 0 3年 4月

    武 汉大 学 学报 ( 理学 版 )

    J .W u h a n Un i v . ( Na t .Sc i .Ed . )

    Vo1 . 49 N【 ) .2

    Apr . 20 03. 2 01 ～ 2O4

    文章 编号 ： 1 6 7 1 - 8 8 3 6 ( 2 0 0 3 ) 0 2 — 0 2 0 1 — 0 4

    漆树漆酶两种同工酶分离纯化与特性研究

    万云洋 ，杜予 民”，杨建红 ，陈荣智 ，肖 玲 ，张 艳

    ( 1 .武汉 大学 资源与环境科 学学院 ，湖 北 武汉 4 3 0 0 7 2 ；

    2 .武汉大学 生命科 学学 院， 湖北 武汉 4 3 0 0 7 2 )

    摘 要 ：应 用 柱层 析 和 HPLC方 法从 漆树 漆液 中分 离 提纯 漆酶 的两 种 同工 酶 u 和 L2 .两 者均 为低 温 酶 ， 最

    适 的温度 分 别为 2 0 C和 1 3 ℃ ， p H 值 分 别为 6 . 7和 7 . 2， 等 电点分 别 为 8 . 6和 9 . 1 .通 过 十二烷 基 硫酸 钠一 聚 丙烯 酰

    胺凝 胶 电泳 ， 测 得它 们 的分 子 量分 别为 1 . 2 ×1 0 j 和 1 . 0 5 ×1 0 .两 种 酶均 不能 催化 氧化 间 氨基 苯 甲酸 ， 对 3 一 氨基 酪

    氨酸等有很高的反应活性.

    关 键 词 ：漆树 漆 酶 ；同工酶 ；特性

    中图分 类号 ：Q 5 5 4 . 9 文献标 识 码 ： A

    我 国是世界上 漆树 资 源最 丰 富的 国家 ， 从漆 树

    中分泌 出的一种灰 白色浊液 ， 即为生漆或称 天然漆 .

    作 为一种超耐久性 的涂 料 ， 生 漆在 中国及东 南 亚地

    区已经使用 了几千 年 ， 长久 以来 享有 “ 涂料 之王 ” 的

    美誉 ] .漆树漆 酶是 生 漆 的重要 组 成部 分 ， 是 一 种

    含铜的糖蛋 白氧化还 原酶 ( EC. 1 .1 0 .3 . 2) .漆 酶对

    漆酚的聚合 、 纸浆去木质素 、 高等植物病 菌防御等过

    程 起着重要 的作用 ， 近年来 已经广泛 用于药物 分析 、乙醇生产和酒类去 酚 、 生物 整 治 ( 包括 染 料脱色 、 工

    业废水 处理和杀虫剂 的降解) 等领域 ] .长期 以来

    对 漆树漆酶 的研究 主要 集 中在对漆树漆酶 的分离提

    纯 【 3 ] 、 结构分析 ] 、 催化氧化 反应 等方 面.本 实验

    室也对漆树漆酶 的分 离纯 化 、 分 子量 测定 、 结 构 、 催

    化反应和应用等 做 了大量 的工作 ] .但 目前漆 树

    漆 酶同工酶 的 组成 分 析 、 酶学 性 能 等 尚未 见报 道 .

    本 文分离纯化漆树 漆酶 的 两种 同工 酶 ， 对其 主要 特

    性参 数如等 电点 、 分子 量 、 最 适 的温 度与 p H 值 、 热

    稳定性 以及催化反应 的底 物专一性等进行 了研究 .

    1 实验 部 分

    1 . 1 主 要 材 料 和 仪 器

    生 漆液 由武汉 国漆 厂提供 ； CM— S e p h a d e x C5 0，DEAE— S e p h a d e x A5 0等 为 Ph a r ma c i a公 司进 口分

    装 ； Tr i s 为生物纯 ； 对苯 二胺 、 邻苯 二胺 和邻 苯二 酚

    用前经 升华 纯化 ； 十二 烷 基硫 酸钠 ( S DS) 用前 重结

    晶 2次 ， 丙酮 ( 化学 纯 ， 经减 压 蒸馏 提取 )； 其 它试 剂

    均 为分析 纯.UV一 9 1 0 0和 UV一 1 6 0 A( S h i ma d z u，日

    本 ) 分光光 度计 用 于漆 酶 分析 ； 1 1 0 6型 元 素 分析 仪

    ( Ca r l o Er b a St r u me n t a z i o n e ， 意大利 )； WF5 1 8 0 — 6 0

    型原 子分光 光 度 仪 ， HWC 一 5 2型恒 温 仪 ( 上 海 天平

    仪器 厂) ； 超滤膜 ( P a l l — Ge l ma n L a b o r a t o r y ， 美 国) .

    1 . 2 分 离 纯 化

    漆 酶粗 提 ： 用丙 酮沉淀 除去 漆酚 得到漆 酶丙 酮

    粉末 ， 再用缓 冲液溶 解 、 离 心 、 过滤 除去水不溶物 ； 漆

    酶精 提 ： 超滤后 基本 参照文献 [ 3 ] .

    高效 液 相 色 谱 所 用 色 谱 柱 为 TS K— g e l C M一

    3 S W( 1 5 c m×2 . 1 5 c m) ， 2 8 0 n m uV 检测 仪 ， 流 速

    为 4 mL· r ai n ～ ， 缓 冲溶液梯 度 淋洗 ：A( 0 . 0 5 t oo l ·

    L Tr i s — HC1 ， pH 7.0)11 r ai n： B( 0.1 t ool·L一

    Na C1 0 . 0 5 t oo l · L Tr i s - HCl ， pH 7 . 1 ) 1 5 r ai n：C

    ( O . 2 5 t oo l · L～ Na C1 0 . 0 5 t oo l · L- 。Tr i s — HC1 。 pH

    7. 2)1 7 mi n.

    1 . 3 漆酶 比活 力测 定

    分别在 1 c m×1 c m 的测 量 比色 皿 和参 比 比色

    皿 内加入对 苯二胺溶 液 ( 磷 酸盐 缓 冲溶液 配 制 ) ， 取

    收 稿 日期 ：2 0 0 2 — 1 1 - 0 5 十通讯 联系 人 E— ma i l ： d u y u mi n @wh u . e d u . c n

    基 金项 目： 国家 自然科学 基 金资助 项 目( 3 0 1 7 0 7 5 7 )

    作 者简 介 ： 万 云洋 ( 1 9 7 7 一 ) ， 男 ， 硕士 生 ， 现 从事 再生 资源 化学生 物学 研究.

    维普资讯 http:www.cqvip.com 2 O 2 武汉 大学 学 报 ( 理学 版 ) 第 4 9卷

    一

    定量的漆树漆酶 ( 室 温下恒 温 1 5 mi n) ， 放人 测量

    比色皿 内 ， 搅拌 1 mi n， 在 波 长 5 0 0 n m 处测 量其 吸

    光度.此处 漆酶 的 比活 力活 定义 为 ： 2 5 ℃每毫 克漆

    酶蛋 白每 分钟 在 5 0 0 n m 处 吸光度 的变 化值 ， 单位

    为 U ·mg _。 .

    1 . 4 漆酶浓度 的测 定

    分别 以牛血清蛋 白和分离纯化 的漆酶 干粉 为标

    准 ， 以 2 8 0 n m处 吸光度 ( A) 对浓 度 ( c ) 作 图， 建立标

    准 曲线.分别测 定 漆酶 溶 液 的 A 。 。 ， 从 标准 曲线 中

    读 出相应 浓度值 ( 图略) .

    1 . 5 蛋白质 纯度和相对分子量 的测定

    参 照文献[ 8 ] 进 行 S DS 一 聚 丙烯 酰 胺凝 胶 电泳 ，分离胶 浓度 1 2 ， 浓 缩胶 浓 度 5 .等 电聚焦 测 定

    p H 值 ， 所用 两性 电解 质安 福灵 ( Amp h o l i n e ) 为 p H

    3 ～ 9 . 5 .用 考 马斯亮 蓝 R一 2 5 0( Fl u k a进 口分装 ) 对

    蛋 白质带染色.

    1 . 6 元素 分析和 Cu含量测定

    以元素分析仪对 两种 漆酶 同工酶进 行 c ......