2002204226 收到, 2002207205 接受。

    国家自然科学基金(No. 29606009)资助项目。

    3

    通讯作者(mengqin @mail . hz. zj . cn) 。

    用吸附法固定化培养紫草细胞

    薛 莲 孟 琴3

    吕德伟

    (浙江大学化工系,杭州 310027)

    摘要: 采用生物活性载体 ,通过吸附固定化方式 ,结合

    液体石蜡原位萃取技术 ,培养紫草细胞。测定了细胞

    生长、底物消耗和产物合成的动力学 ,紫草宁产率为 0.

    916 g g干重细胞和 0. 953 g g干重接种细胞 ,分别为

    悬浮培养的 12. 7倍和 6. 3 倍。同时 ,对吸附与包埋固

    定化方法进行了综合比较 ,探讨了吸附固定化方法的

    应用前景。

    关键词: 吸附 ,固定化 ,紫草

    学科分类号: Q942

    自Brodelius于 1979 年首次报告固定高等植物

    细胞以来 ,通过固定化培养植物细胞生产次生代谢

    产物的研究取得了重大进展(Brodelius 等 1979) 。

    固定化加强了细胞之间的接触 ,细胞的组织化则有

    利于细胞进行次生代谢(Bringi 和 Shuler 1990) ,从

    而提高总产量;同时 ,固定化有可能使细胞保持休

    止状态 ,因此 ,可以解决植物细胞在悬浮培养中容

    易变异的问题。

    用于植物细胞领域的固定化方法有凝胶包埋、吸附、泡沫固定及应用膜反应器 (陈士云 1995 ,Tyler 等 1995)等。凝胶包埋法因固定条件温和而

    广泛得以应用。但凝胶作为固定化材料具有较大

    的传质阻力 ,即使在最为常用的海藻酸钙包埋法

    中 ,也存在由于培养基中的磷酸根结合 Ca

    2 +

    生成

    沉淀而对凝胶造成一定破坏的问题。吸附法具有

    操作简单 ,细胞活性能保持高水平的特点 ,也有人

    尝试性将之应用于植物细胞的固定化 ,如采用尼龙

    块( Iborra 等 1994) 、玻璃纤维( Facchini 和 DiCosmo

    等 1991)等作为吸附载体。但总体而言 ,因细胞与

    载体间结合力较弱 ,该固定化方法的操作稳定性

    差 ,因而其应用还处于尝试阶段 ,有关植物细胞吸

    附固定化培养的报告很少 ,研究进展缓慢。

    本文采用的吸附载体是由本实验室通过微生

    物菌体制备的絮状生物活性载体。其主要成分为

    壳聚糖(脱乙酰几丁质) ,表面带有大量2NH2 基(严

    俊1984) ,具有很强的结合力 ,可吸附表面带负电的

    植物细胞;其絮状结构有利于细胞彼此间的接触 ,同时也保证了细胞与载体结合紧密 ,从而有利于提

    高操作的稳定性;据报告几丁质可刺激细胞分泌次

    生代谢物( Kusaka和 Wakayama 1991) ,因此该材料

    在作为吸附载体的同时 ,还具有活性作用。

    本文探讨了采用生物活性载体吸附紫草细胞

    进行固定化培养的工作。确定了固定化细胞的制

    备条件;为减少产物抑制 ,结合了双液相培养技术

    对细胞进行培养;验证了载体对细胞次生代谢的刺

    激作用;测定了固定化细胞的生长、底物消耗和次

    生代谢物生产的动力学;将吸附法与传统包埋法固

    定化的培养进行了比较;并探讨了吸附固定化方法

    在植物细胞培养领域内具有的潜力与应用前景。

    1 材料与方法

    1. 1 实验材料

    紫草( L i thospermum erythrorhizon ) 细胞株由

    北京医学科学院提供。生物活性载体由霉菌菌丝

    体经一系列物化处理制备而得 ,普通吸附载体对紫

    草细胞的干基吸附量在 200 mg g 以下。本载体由

    于其大量的表面电荷与有利于吸附细胞的空间结

    构 ,其对紫草细胞的吸附量达 1 g g以上。

    1. 2 细胞重量测定

    细胞悬浮液经真空抽滤 5 min 后称重 ,即得细

    胞鲜重。将细胞置于 70 ℃烘箱中恒温 48 h 至恒

    重 ,即得细胞干重。

    1. 3 碳源测定

    采用岛津210A 高效液相色谱仪分析培养基中

    的可溶性糖浓度。色谱柱为 Spherisorb2NH2 柱 ,流

    动相为乙腈∶水(75∶ 25) ,流速 1. 0 ml min ,检测器:

    RI。

    1. 4 紫草宁含量测定

    胞外紫草宁测定 取一定量培养液 ,用石油醚

    反复萃取至无色 ,将萃取液定容 ,于 520 nm 下测定

    吸光值。根据标准曲线计算其含量。

    胞内紫草宁测定 称取一定量鲜细胞 ,加入石

    963 植物生理与分子生物学学报 , J ournal of Plant Physiology and Molecula r Biology 2002 , 28( 5) :369 - 374

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.油醚反复研磨 ,将石油醚定容 ,于 520 nm下测定其

    吸光值。根据标准曲线计算其含量。

    有机相紫草宁测定 取一定量上层有机相 ,于

    其最大吸光波长下测定其吸光值。根据制定的标

    准曲线计算其含量。

    1. 5 数据统计

    数据是 3 次或 3 个以上实验结果的平均值。

    1. 6 细胞的分散与固定

    植物细胞在培养过程中有聚集成团生长的趋

    势。在本培养体系中紫草细胞形成直径约 2～8

    mm的细胞团。固定化时 ,要求使用直径在 1 mm

    以下的细小细胞团 ,因此进行固定化前必须首先对

    细胞加以分散。细胞形成团块是由于细胞在生长

    过程中分泌的果胶类物质将细胞彼此粘连在一起 ,因此 ,采用果胶酶对果胶加以分解以便在不破坏细

    胞活性的情况下使细胞团得以分散。

    配制浓度为 2. 5 g L 的果胶酶液( E. Merck 公

    司 ,1. 0 U mg) ,其中含有 pH 5. 6 的 Na2HPO42柠

    檬酸缓冲液。将 8 g年龄为 8 d的紫草细胞加入到

    80 ml 酶液中 ,在 26 ℃、转速 70 r min 的摇床中酶

    解36 h。酶解后将细胞悬液用 0. 7 mm与 0. 1 mm

    的不锈钢网筛进行两步过滤 ,采用直径在 0. 1 mm

    ～0. 7 mm的细胞进行固定化操作。

    因活性载体经高温灭菌后吸附性能会大大下

    降 ,因此 ,我们将其浸泡在5 %的醋酸溶液中进行冷

    消毒。细胞固定化按如下步骤操作: (1)将浸泡在

    5 %醋酸溶液中的载体转移到 0. 1 mm 不锈钢网筛

    上 ,用无菌水冲洗至中性 ,称取一定重量 ,然后转移

    至装有无菌水的三角烧瓶中; (2)将经酶解后过滤

    得到的分散细胞用无菌水冲洗 ,并称取一定重量

    (载体与细胞鲜重比约 1∶ 10) ,转移至上述装有载体

    的三角烧瓶中; (3)在三角烧瓶中用玻棒轻微搅动

    30 s ,使细胞与载体充分接触 ,然后静置 5 min ; (4)

    固定化完成后 ,将固定化细胞用 0. 9 mm 不锈钢网

    筛过滤 ,将之转移至液体培养基中 ,进行固定化培

    养。

    由于我们采用的细胞直径在 0. 1 mm 以上 ,而

    紫草细胞呈鲜红色 ,因此在固定化过程中 ,判断细

    胞的固定化是否完成可以通过肉眼观察。固定化

    前酶解细胞在无菌水中形成红色悬液 ,固定化完成

    后无菌水呈无色 ,表明无游离细胞存在 ......