外部因子条件对麻黄细胞悬浮培养的影响3

    X

    高晓原 曹有龙

    (宁夏农业生物技术重点实验室 ,750002 ,银川)

    摘 要 用中麻黄种子萌发的子叶诱导出愈伤组织 ,并在不同的培养基、不同的激素及不同的

    pH值和不同的蔗糖浓度条件下培养 ,探讨麻黄离体细胞生长的适宜条件。实验证明以MS + 2 ,4 -

    Dlmg L + NAA2mg L 培养基较好 ,愈伤组织色泽正常 ,生长量高。悬浮培养 pH值在 3 - 9 均能生

    长 ,但以pH7 - 8最适 ,其细胞增殖量增加8 - 9倍;其含糖量在30g L 较适宜。

    关键词 麻黄 ,愈伤组织;悬浮培养;条件

    中图分类号 Q949· 672

    麻黄是我国西北地区荒漠草原的一种野生药用

    植物 ,其形态与结构特殊 ,茎中含有多种麻黄碱 ,具

    有消炎、活血、宣肺平喘之功效。近年来人们进行大

    面积人工种植 ,扩大此资源已取得可喜成果 ,但从种

    植收获到加工成纯品 ,具有周期长、成本高的缺点。

    为此我们试图利用生物技术手段 ,采用麻黄外植体

    诱导愈伤组织 ,再用愈伤组织细胞进行液体悬浮培

    养 ,从中获得药用次生代谢产物麻黄碱及有效成分 ,达到室内人工生产麻黄碱的目的。现将这一研究初

    报如下:

    1 材料及方法

    1. 1 材料

    中麻黄种子 ( Ephedra intermedia Schrenket ex

    Mey) ,取自内蒙鄂托克前旗。

    1. 2 方法

    种子经水多次冲洗后 ,用 75 %酒精表面消毒

    1min ,弃去。再用0. 1 %升汞表面消毒 7min ,用无菌

    水冲洗3次 ,备用。将 100g细沙装入 100ml 三角瓶

    中 ,加水使沙全部湿润 ,封口在 120 ℃条件下灭菌

    20min ,冷却后在无菌条件下用小镊将消毒种子放入

    瓶中的沙面上 ,每瓶10粒 ,封口。在26 ℃,光照周期

    10h d条件下培养。

    1. 2. 1 愈伤组织的诱导

    种子沙培萌发后 ,子叶长出1 - 2d内 ,在无菌条

    件下将子叶剪成 0. 5cm的小段 ,作为诱导愈伤组织

    的材料 ,接入附加不同激素的 MS、 N6、 B5、 white 培养

    基中 ,在26 ℃光照周期10h d条件下培养 ,约30d后

    根据愈伤组织诱导率 ,愈伤组织大小、色泽等 ,确定

    较理想的激素组合和培养基。

    1. 2. 2 不同蔗糖浓度麻黄细胞悬浮培养

    以去除蔗糖和琼脂的 MS + 2. 4 - Dlmg L +

    NAA2mgL 为基本培养液 ,供设 5 个处理 ,即每升培

    养液中加蔗糖 0、 10、 15、 30、 50g (g L) ,每个处理 5

    瓶 ,每瓶80ml 培养液 ,装于 250ml 三角瓶中 ,灭菌。

    培养材料选用生长 25d 松脆型愈伤组织 ,每瓶接入

    2～3g (干重 0. 1g) ,稍加压碎倒入瓶中。在 26 ℃,转

    速为100r min条件下振荡培养。20d 后分别过滤收

    集培养物 ,80℃条件下烘干 ,称重。每瓶增加的干重

    表示细胞生长量。

    1. 2. 3 不同pH条件下细胞悬浮培养

    以MS + 2. 4 - Dlmg L + NAA2mg L (不加琼脂)

    为培养液。共设 8 个处理 ,即:pH 2、 3. 5、 4. 5、 5. 5、6. 5、 7. 5、 8. 5、 9. 5。每处理 5 瓶。其详细的操作、培

    养方法与以上不同含糖量悬浮培养方法相同。

    2 结果与分析

    2. 1 愈伤组织的诱导

    见表1。我们选用这四种常用培养基进行愈伤

    组织诱导比较实验 ,结果表明它们具有明显的不同。

    第22卷 第3期

    2001年 宁 夏 农 学 院 学 报

    Journal of Ningxia Agricultural College

    Vol . 22 No. 3

    2001

    X 宁夏自然科学基金

    收稿日期:2001 - 05 - 29

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.white 均能诱导出愈伤组织 ,但诱导率低 ,愈伤组织

    长势弱 ,约 7 天后逐渐变为黄褐色 ,直径在 0. 5～

    0. 7cm不再增大 ,三个激素组合基本一致。在 N6 与

    B5 中没有任何愈伤组织产生 ,接入的外植体全部变

    褐死亡。而在 MS中愈伤组织诱导率高 ,愈伤组织

    长势好 ,在 2. 4 - D 浓度不变的情况下 ,适当调整

    NAA用量使愈伤组织型态疏松 ,随NAA用量的增加

    愈伤组织诱导率明显提高 ,色泽由浅变深。因此以

    2. 4 - Dlmg L + NAA2mg L 相组合愈伤组织无论在

    生长速度、愈伤组织大小、色泽显然优于其它 2 种 ,结构疏松 ,适合于悬浮培养。

    表1 30d后各培养基中愈伤组织诱导率及生长状况

    培养基 激素组合(mg L) 诱导率% 愈伤组织生长状况

    2. 4 - Dl + NAA 0. 5 60 谈绿色 疏松 生长较慢

    MS 2. 4 - Dl + NAA1 65 淡绿色 疏松 生长慢

    2. 4 - D1 + NAA2 80 绿色 疏松 生长快

    2. 4 - Dl + NAA0. 5 10 淡褐色 松软 生长很慢

    White 2. 4 - Dl + NAA1 10 淡褐色 松软 生长很慢

    2. 4 - Dl + NAA2 50 初期淡绿色后期变褐 疏松 生长慢

    2. 4 - Dl + NAA0. 5 0 无

    N6 2. 4 - Dl + NAA1 0 无

    2. 4 - Dl + NAA2 0 无

    2. 4 - Dl + NAA0. 5 0 无

    B5 2. 4 - Dl + NAA1 0 无

    2. 4 - Dl + NAA2 0 无

    2. 2 不同蔗糖浓度对麻黄细胞悬浮培养的影响

    从表2看出不同蔗糖用量对麻黄细胞悬浮培养

    的影响:MS培养基对麻黄细胞培养是较适宜的 ......