紫花苜蓿高频再生组织培养体系建立.PDF
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2006年2月23日
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参见附件(98KB，5页)。
2005年 2月 重庆大学学报 (自然科学版 ) Feb . 2005
第 28卷第 2期 Journal of Chongqing University(Nɑ turɑ l Science Editi on) Vol . 28 No . 2
文章编号: 1000 - 582X (2005) 02 - 0132 - 05
紫花苜蓿高频再生组织培养体系建立3
王 凭 青1
,周 兴 龙1
,杨 青 川2
,吴 明 生1
,谢 伟 伟1
(1 .重庆大学 生物工程学院 生物力学与组织工程教育部重点实验室,重庆 400030; 2 .中国农业科学院 畜牧研究所,北京 100094)
摘 要:以 8个品种的无菌实生苗子叶和下胚轴为外植体 ,研究了 4种不同培养程序及基因型对紫
花苜蓿胚性愈伤组织、 胚状体诱导及成苗移栽的影响。结果显示: 4种培养程序对苜蓿的出愈率影响差
别不大 ,但不同培养程序对苜蓿的分化率和成苗率影响差异显著 ,其中 SHK - MS O - MSO在分化率和
出苗率上表现较佳;另外 ,不同基因型在苜蓿出愈率和成苗率上反应不显著 ,但在分化率上反应显著 ,其
中中苜一号 ,草原 2号和保定苜蓿表现较佳。
关键词:紫花苜蓿;组织培养;愈伤组织;胚状体
中图分类号: S188 文献标识码: A
紫花苜蓿 (M edicago sa tiva L. )属多年生豆科植
物 ,为重要的高蛋白质饲料牧草 ,被誉为“ 牧草之王 ” ,在畜牧业生产中占有重要的地位[ 1 ]。近年来 ,由于我
国生态环境遭到破坏 ,草场盐碱化程度加重 ,造成产草
量不足 ,影响了畜牧业的发展。而恢复草场生态环境 ,投资大 ,周期长 ,这就需要考虑培育抗虫 ,抗病 ,抗逆的
苜蓿品种[ 2 ]。传统的遗传育种见效慢 ,转基因技术则
是一项行之有效的手段 ,然而紫花苜蓿作为基因转化
的受体 ,其组织培养体系还存在再生率低、培养的周
期长等缺点 ,因此需要建立紫花苜蓿高频再生组织培
养体系 ,为今后通过基因转化改良紫花苜蓿性状和实
现其产业化作准备[ 3 ]。
1 材料与方法
1 . 1 试验材料
供试苜蓿品种为阿尔冈金 ,中苜一号 ,草原 2号 ,WL232,WL323,DEF I , Sitel,保定苜蓿。
1 . 2 试验方法
1 . 2 . 1 外植体的准备
将苜蓿种子用 75%酒精浸泡 10 min,再用 0 . 1%
HgCI 2消毒 8～15 min,无菌水冲洗 5次 ,每次 5 min
后 ,将种子放到装有无菌水的三角瓶中浸泡 2 h,待种
子膨胀后 ,将种子接种到 1 2MS培养基上 , 27 ℃黑暗
培养 48 h,种子开始萌发 (见图 1) ,然后 16 h光照 , 8 h
黑暗培养 3～5 d后 ,长出子叶 (见图 2) ,切取苜蓿新
生苗的子叶和下胚轴 ,用于诱导愈伤组织[ 4 ]。
图 1 种子萌发
图 2 长出子叶
3 收稿日期: 2004 - 10 - 20
基金项目:教育部重点科技基金资助项目 (01145和 02156) ;国家“863” 重大项目 (2002AA241101) ;重庆市应用基础研究科
学基金资助项目 (7900)
作者简介:王凭青 (1962 - ) ,男 ,湖北鄂州人 ,重庆大学副教授 ,博士 ,从事生物工程与农业生物技术研究工作。
? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.1 . 2 . 2 培养基及培养程序
本实验在借鉴前人工作的基础上 ,共设计了 4种
培养程序 ,进行愈伤组织和胚状体的诱导及植株成苗
再生。
Ⅰ.诱导愈伤组织形成的培养基: SHK;诱导体胚
分化的培养基: SHK;成苗培养基: 1 2MS。
Ⅱ.诱导愈伤组织形成的培养基:MSH;诱导体胚
分化的培养基: Boi2y;成苗培养基: 1 2MS。
Ⅲ.诱导愈伤组织形成的培养基: SHK;诱导体胚
分化的培养基: Boi2y;成苗培养基: 1 2MS。
Ⅳ.诱导愈伤组织形成的培养基: SHK;诱导体胚
分化的培养基:MSO;成苗培养基:MS O。
1 . 3 实验处理
1 . 3 . 1 接种
在无菌环境下 ,将切好的苜蓿子叶和下胚轴分别
接入 MSH, SHK, SHK, SHK培养基上 ,每种培养基上
接种 15块愈伤组织 (见图 3) , 10次重复 ,接种后用封
口膜封口。
图 3 诱导 3天后的愈伤组织
1 . 3 . 2 诱导愈伤
接种后 ,在 27 ℃ 黑暗条件下培养 ,诱导愈伤组织。
连续经过两轮继代选择培养后 ,第 3次继代淘汰呈褐
色和水浸化的愈伤组织 ,得到质地结实 ,浅黄绿色的胚
性愈伤组织 (见图 4)。
图 4 浅黄绿色的胚性愈伤组织
1 . 3 . 3 诱导体胚分化
将浅黄绿色愈伤组织分别转接到 Boi2y, Boi2y,SHK,MSO培养基上 , 27 ℃黑暗条件下 ,诱导体胚分
化。连续经过多次继代培养 ,淘汰褐色的愈伤 ,筛选出
呈黄白色、 浆糊状、 并镶嵌有绿色小颗粒的愈伤组织
(见图 5)。
图 5 体胚
1 . 3 . 4 成苗
将出现胚状体 (呈簇状 )的愈伤组织转接到
1 2MS, 1 2MS, 1 2MS, MSO 培养基上 , 27 ℃,光强
3 000 lx,每日光照 16 h,黑暗 8 h培养 ,约 3周 ,体胚发
育成正常的植株 (见图 6)。
图 6 体胚发育成正常的植株
1 . 3 . 5 练苗移栽
当再生的小植株出现 5条以上的健壮根时 ,可将
小三角瓶上的封口膜去掉 ,室内锻炼 24 h然后将幼苗
从三角瓶中取出 ,自来水冲净根部的培养基 ,移栽于混
有灭过菌的营养土和蛭石 (1: 3)的小花盆中 (见图 7,图 8) ,最初 3～5 d,幼苗应遮上塑料薄膜 ,以保持湿
度 ,当苜蓿小苗长出健壮的茎叶时 ,可将其移入大田或
大花盆中 (见图 9,图 10)。
图 7 移苗
331 第 28卷第 2期 王凭青 等: 紫花苜蓿高频再生组织培养体系建立
? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.1 . 4 高频再生体系的建立
采用胚状体诱导率和再生率均较高的苜蓿品种和
培养程序 ,利用它们胚状体形成的植株叶片进行多轮
诱导分化 ,筛选出高频再生组织培养体系 ......
第 28卷第 2期 Journal of Chongqing University(Nɑ turɑ l Science Editi on) Vol . 28 No . 2
文章编号: 1000 - 582X (2005) 02 - 0132 - 05
紫花苜蓿高频再生组织培养体系建立3
王 凭 青1
,周 兴 龙1
,杨 青 川2
,吴 明 生1
,谢 伟 伟1
(1 .重庆大学 生物工程学院 生物力学与组织工程教育部重点实验室,重庆 400030; 2 .中国农业科学院 畜牧研究所,北京 100094)
摘 要:以 8个品种的无菌实生苗子叶和下胚轴为外植体 ,研究了 4种不同培养程序及基因型对紫
花苜蓿胚性愈伤组织、 胚状体诱导及成苗移栽的影响。结果显示: 4种培养程序对苜蓿的出愈率影响差
别不大 ,但不同培养程序对苜蓿的分化率和成苗率影响差异显著 ,其中 SHK - MS O - MSO在分化率和
出苗率上表现较佳;另外 ,不同基因型在苜蓿出愈率和成苗率上反应不显著 ,但在分化率上反应显著 ,其
中中苜一号 ,草原 2号和保定苜蓿表现较佳。
关键词:紫花苜蓿;组织培养;愈伤组织;胚状体
中图分类号: S188 文献标识码: A
紫花苜蓿 (M edicago sa tiva L. )属多年生豆科植
物 ,为重要的高蛋白质饲料牧草 ,被誉为“ 牧草之王 ” ,在畜牧业生产中占有重要的地位[ 1 ]。近年来 ,由于我
国生态环境遭到破坏 ,草场盐碱化程度加重 ,造成产草
量不足 ,影响了畜牧业的发展。而恢复草场生态环境 ,投资大 ,周期长 ,这就需要考虑培育抗虫 ,抗病 ,抗逆的
苜蓿品种[ 2 ]。传统的遗传育种见效慢 ,转基因技术则
是一项行之有效的手段 ,然而紫花苜蓿作为基因转化
的受体 ,其组织培养体系还存在再生率低、培养的周
期长等缺点 ,因此需要建立紫花苜蓿高频再生组织培
养体系 ,为今后通过基因转化改良紫花苜蓿性状和实
现其产业化作准备[ 3 ]。
1 材料与方法
1 . 1 试验材料
供试苜蓿品种为阿尔冈金 ,中苜一号 ,草原 2号 ,WL232,WL323,DEF I , Sitel,保定苜蓿。
1 . 2 试验方法
1 . 2 . 1 外植体的准备
将苜蓿种子用 75%酒精浸泡 10 min,再用 0 . 1%
HgCI 2消毒 8～15 min,无菌水冲洗 5次 ,每次 5 min
后 ,将种子放到装有无菌水的三角瓶中浸泡 2 h,待种
子膨胀后 ,将种子接种到 1 2MS培养基上 , 27 ℃黑暗
培养 48 h,种子开始萌发 (见图 1) ,然后 16 h光照 , 8 h
黑暗培养 3～5 d后 ,长出子叶 (见图 2) ,切取苜蓿新
生苗的子叶和下胚轴 ,用于诱导愈伤组织[ 4 ]。
图 1 种子萌发
图 2 长出子叶
3 收稿日期: 2004 - 10 - 20
基金项目:教育部重点科技基金资助项目 (01145和 02156) ;国家“863” 重大项目 (2002AA241101) ;重庆市应用基础研究科
学基金资助项目 (7900)
作者简介:王凭青 (1962 - ) ,男 ,湖北鄂州人 ,重庆大学副教授 ,博士 ,从事生物工程与农业生物技术研究工作。
? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.1 . 2 . 2 培养基及培养程序
本实验在借鉴前人工作的基础上 ,共设计了 4种
培养程序 ,进行愈伤组织和胚状体的诱导及植株成苗
再生。
Ⅰ.诱导愈伤组织形成的培养基: SHK;诱导体胚
分化的培养基: SHK;成苗培养基: 1 2MS。
Ⅱ.诱导愈伤组织形成的培养基:MSH;诱导体胚
分化的培养基: Boi2y;成苗培养基: 1 2MS。
Ⅲ.诱导愈伤组织形成的培养基: SHK;诱导体胚
分化的培养基: Boi2y;成苗培养基: 1 2MS。
Ⅳ.诱导愈伤组织形成的培养基: SHK;诱导体胚
分化的培养基:MSO;成苗培养基:MS O。
1 . 3 实验处理
1 . 3 . 1 接种
在无菌环境下 ,将切好的苜蓿子叶和下胚轴分别
接入 MSH, SHK, SHK, SHK培养基上 ,每种培养基上
接种 15块愈伤组织 (见图 3) , 10次重复 ,接种后用封
口膜封口。
图 3 诱导 3天后的愈伤组织
1 . 3 . 2 诱导愈伤
接种后 ,在 27 ℃ 黑暗条件下培养 ,诱导愈伤组织。
连续经过两轮继代选择培养后 ,第 3次继代淘汰呈褐
色和水浸化的愈伤组织 ,得到质地结实 ,浅黄绿色的胚
性愈伤组织 (见图 4)。
图 4 浅黄绿色的胚性愈伤组织
1 . 3 . 3 诱导体胚分化
将浅黄绿色愈伤组织分别转接到 Boi2y, Boi2y,SHK,MSO培养基上 , 27 ℃黑暗条件下 ,诱导体胚分
化。连续经过多次继代培养 ,淘汰褐色的愈伤 ,筛选出
呈黄白色、 浆糊状、 并镶嵌有绿色小颗粒的愈伤组织
(见图 5)。
图 5 体胚
1 . 3 . 4 成苗
将出现胚状体 (呈簇状 )的愈伤组织转接到
1 2MS, 1 2MS, 1 2MS, MSO 培养基上 , 27 ℃,光强
3 000 lx,每日光照 16 h,黑暗 8 h培养 ,约 3周 ,体胚发
育成正常的植株 (见图 6)。
图 6 体胚发育成正常的植株
1 . 3 . 5 练苗移栽
当再生的小植株出现 5条以上的健壮根时 ,可将
小三角瓶上的封口膜去掉 ,室内锻炼 24 h然后将幼苗
从三角瓶中取出 ,自来水冲净根部的培养基 ,移栽于混
有灭过菌的营养土和蛭石 (1: 3)的小花盆中 (见图 7,图 8) ,最初 3～5 d,幼苗应遮上塑料薄膜 ,以保持湿
度 ,当苜蓿小苗长出健壮的茎叶时 ,可将其移入大田或
大花盆中 (见图 9,图 10)。
图 7 移苗
331 第 28卷第 2期 王凭青 等: 紫花苜蓿高频再生组织培养体系建立
? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.1 . 4 高频再生体系的建立
采用胚状体诱导率和再生率均较高的苜蓿品种和
培养程序 ,利用它们胚状体形成的植株叶片进行多轮
诱导分化 ,筛选出高频再生组织培养体系 ......
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