输血传播病毒TTV致病性的探讨
关键词: 输血传播病毒;致病性;非甲-非戊肝炎;聚合酶链反应;序列分析
摘 要:目的 通过病例对比，进一步研究TTV是否有致病性;对1例西安地区非甲-非戊型肝炎但血清TTV阳性患者套式PCR终产物纯化测序，在验证我们TTV DNA检测正确性的同时初步研究西安地区TTV流行株部分分子生物学特点. 方法 在TTV ORF1区参照文献[1]设计一套套式PCR引物，并建立稳定的套式PCR检测法，对西安地区119例非甲-非戊型肝炎患者及162例健康有偿献血员进行TTV对比检测和统计学处理;对1例患者套式PCR终产物纯化测序，用DNAsis软件在计算机上与中国1株做同源性比较阳性. 结果 119例非甲-非戊型肝炎患者中37例TTV DNA阳性，阳性率31.1%;162例健康有偿献血员中TTV DNA阳性30例，阳性率18.5%;两组有明显的统计学差异(P<0.05，χ2 =5.251).对1例非甲-非戊型肝炎患者血清TTV套式PCR终产物纯化直接测序，测得143bp序列，经计算机比较，其与中国1株同源性为65.0%，差异率为35.0%(>30.0%).其中62bp序列同源性高达75.8%. 结论 TTV可能有致病性;西安地区可能存在新的TTV流行株.
Pilot study on pathogenicity of transfusion transmit┐ted virus
FU En-Qing BAI Xue-Fan WANG Ping-Zhong PAN Lei LI Guang-Yu CHEN Hong-Mei YANG Wei-Song
ZHOU Yong-Xing
1 Department of Respiratory Medicine，
2 Center of In-fectious Diseases Prevention of Chinese PLA，Tang-du Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710038，China
Keywords:transfusion transmitled virus;pathogenicity;hep-atitis，non-A to non-E;polymerase chain reac-tion;sequence analysis
Abstract:AIM To study pathogenicity of transfusion trans-mitted virus(TTV)and sequence part of TTV DNA in Xi'an.To compare partial sequence of TTV in Xi'an with DBH1，which were reported by WANG Hai-tao who is a pro-fessor of the Academy of Military Medical Sciences，in com-puter with software of DNAsis to find their homogeneity.METHODS A nested polymerase chain reaction(nested-PCR)assay with two pair of primers from ORF1of TTV genome was established to detect TTV DNA in serum sam-ples from119cases of non-A to non-E hepatitis patients and162cases of healthy blood donors.Their ALT and AST were detected in their serum too.RESULTS TTV DNA were de-tected in serum from37of119(31.1%)non-A to non-E hepatitis patients and30of162(18.5%)healthy blood donors.These two groups had statistical difference(χ2 =5.251，P<0.05).3of37cases of non-A to non-E hepatitis patients with TTV DNA positive were cirrhosis，the other30cases of non-A to non-E hepatitis patients with TTV DNA positive were acute hepatitis.The partial sequence of TTV(143bp)in Xi'an was sequenced and its homology with BDH1(Gen Bank AF116842)was65.0%after comparason with computer.CONCLUSION TTV may have pathogenici-ty，it can cause acute and chronic hepatitis.The results of comparason of the partial sequence of TTV in Xi'an with BDH1suggest that there may be new genicity of TTV in Xi'an.
0 引言
输血传播病毒TTV(transfusion transmitted virus)作为肝炎相关病毒被发现以来，对其致病性的研究一直是国内外TTV研究的焦点之一.虽然，众多学者进行了大量的研究，但是，至今TTV是否为肝炎病毒仍无较为明确的结论，我们通过对119例不明原因肝炎患者TTV DNA及肝功能检测，并与我院健康有偿献血员TTV DNA检测对比，试图对TTV的致病性进行研究.
1 对象和方法
1.1 对象 选择我院1998-01/2000-08住院与门诊及西京医院门诊非甲-非戊肝炎患者119(男83，女36)例;平均年龄(38±17)岁;将162(男46，女116)例有偿献血员经肝功能检测正常(ALT<667nkat·L-1 ，AST<500nkat·L-1 )，乙-丙型肝炎血清标志物检测均阴性，HIV抗体检测阴性者作为对照组.平均年龄(60±8)岁.对其中1例血清TTV DNA阳性的非甲-非戊型肝炎患者，将其TTV套式PCR检测终产物纯化测序，用DNAsis软件在计算机上与军事医学科学院王海涛报道的中国1株(BDH1，Gen Bank注册号AF116842)进行序列同源性比较.肝功能检测方法:全自动肝功能检测仪自动检测肝功.Taq DNA聚合酶、2.5mmol·L-1 dNTPs，DNA分子质量标准、肝炎系列标记物检测试剂盒均为华美公司生产，QIAEXⅡPCR产物纯化试剂盒为德国QIAGEN公司生产，琼脂糖上海东海制药厂生产，PCR扩增仪为美国PE公司生产的PE2400型PCR扩增仪，DNA全自动测序仪由美国ABI公司生产.
1.2 方法 取血清20μL，置于Ependoph管中，加入20μL(等体积)的裂解液，置沸水中加热10min，高速离心(80g，10min)，取上清备用.引物设计用于TTV DNA检测的引物，参照文献[1]报道的引物序列设计，由西安美联公司合成(Tab1).引物合成后以无离子水稀释至2.5mmol·L-1 的应用浓度.
表1 TTV DNA套式PCR扩增引物序列 略
套式PCR(nested-PCR)扩增方法文献[2]并做适当的修改，第1次取标本离心上清2μL做DNA模板，第2轮以第1轮产物2μL做模板，两次PCR反应体积均为15μL，含2.5mmol·L-1 dNTPs1μL，2.5μmol·L-1 浓度引物各1μL(第1轮为两外引物，第2轮为两内引物)，Taq酶1.5U，10×Taq酶 buffer1.5μL.顶部以石蜡油封闭.以PE公司生产的PE-2400型PCR仪自动循环，均按下列参数循环:94℃30s，56℃30s，72℃30s，共35个循环.开始循环前94℃预变性5min，最后72℃延伸5min.PCR终产物经15g·L-1 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线检测仪观察结果.当观察到197bp的扩增DNA条带时判为TTV DNA检出阳性(Fig1).每次检测均设阳性与阴性对照.从低熔点凝胶中切下阳性条带，用QIAEX纯化试剂盒按说明步骤进行纯化，送我校中心实验室以自带引物直接测序法测序，所用内引物对应的TTV DNA位置为nt2061～2080和nt2238～2257，预计靶基因全长197bp.
图1 略
2 结果
非甲-非戊肝炎组及健康有偿献血员组TTV DNA检测结果(Tab2)，非甲-非戊肝炎组肝功能结果:谷丙转氨酶(ALT)为(4328.7±6536.3)nkat·L-1 ，谷草转氨酶(AST)为(3500.0±6631.8)nkat·L-1 .对1例非甲-非戊型肝炎患者血清检测扩增的TTV DNA的靶片段进行了碱基序列的直接测定，测得143bp长片段，测序结果与王海涛在Gen Bank注册BDH1序列比较结果(Fig2，3)，两者同源性为65.0%，差异率为35.0%(>30.0%).其中62bp片段与其同源性高达75.8%.
表2 TTV DNA检测结果表 略
图2 - 图3 略
3 讨论
对TTV致病性的研究，一直是TTV研究最热点问题之一[3] ，同时，国际上至今并未达成统一的认识.Zein等[4] 通过对丙型肝炎合并TTV感染的研究发现TTV与HCV相关肝病病程及预后无关.Forns等[5] 对西班牙96例长期透析患者检测发现53.0%TTV阳性者中肝功能异常仅2例，提示TTV与肝炎发病无相关性.Kao等[6] 对我国台湾地区一组肝炎患者研究未发现TTV与非甲-非戊型急性肝衰竭有相关性.Poovorawan等[7] 在201例吸毒者与200例献血员的研究也发现TTV阳性与阴性者血清谷丙转氨酶(ALT)比较无差异，不支持TTV有致病性，且发现人体对TTV具有免疫清除作用.Sugiya-ma等[8] 在儿童中的研究同样得出TTV无致病性结论.Asaba等[9] 和Hasebe等[10] 分别对非乙-非丙型肝炎患者肝组织进行病理研究，发现TTV阳性与TTV阴性患者之间肝组织结构无任何差异，同样不赞成TTV有致病性.然而，也有众多研究支持TTV有致病性;Shibayama等[11] 对829例慢性肝病患者及30例非乙-非丙、非庚型肝炎患者研究推测TTV可能为非乙-非丙、非庚型慢性肝病的病因.Tanaka等[12] 和Kanda等[13] 研究认为TTV可引起急性非甲-非戊型肝炎，但无证据证明其可致急性重度肝炎，不过TTV阳性的爆发性肝炎预后明显差于TTV阴性者.Tsubota[14] 通过11例单纯TTV阳性肝炎患者观察研究发现，TTV可引起与其他慢性肝炎相似的病理改变，其表现为γ-GTP异常，而ALT正常的肝炎改变.Hoshino等[15] 在研究非甲-非丙肝炎中TTV的基因型差异时发现TTV1b型可能有致病性.Okamoto[3] 也认为TTV的部分基因型有重要的临床意义.我们研究发现，非甲-非戊型肝炎组TTV DNA检测阳性率为31.1%，较我们前期报道的60.0%[16] 低，可能与前期病例数较少有关.健康有偿献血员组TTV DNA检测阳性率为18.5%，与我们以前报道的16.8%相当[17，18] ;非甲-非戊型肝炎组与健康有偿献血员组TTV DNA检测阳性率有明显的统计学差异(χ2 =5.251，P<0.05)，提示TTV有致病性;我们前期研究[16] 也得出同样的结论;在37例TTV阳性非甲-非戊型肝炎中，3例为肝硬化，34例均为急性肝炎，其引起肝炎中，ALT最高达36690.7nkat·L-1 ，AST最高达34523.6nkat·L-1 ，并非如文献报道的仅仅表现为ALT轻度异常型肝炎[19] .Itoh等[20] 将861名以前无输血史，且HBV，HCV标志物均阴性的献血员分为ALT增高组(1488.6±606.8)nkat·L-1 和ALT正常组(≤750nkat·L-1 )，TTV DNA阳性率分别为22.1%(62/280)和15.7%(91/581)，二者相比有显著差异(P<0.02)，认为TTV与非甲-非戊型肝炎有较好的相关性，与我们得出相似的结论.本组病例ALT为(4328.7±6536.3)nkat·L-1 ，AST为(3500.0±6631.8)nkat·L-1 ，可以看出ALT与AST表现出较大的差异度，提示单纯TTV阳性肝炎引起肝功能损害的多样性.对1例非甲-非戊型肝炎血清TTV DNA套式PCR扩增终产物纯化测序143bp，结果经计算机与BDH1株同源性比较，两者同源性为65.0%，差异率为35.0%(>30.0%)，提示西安地区可能存在新的TTV流行株.姬新颖等[21] 对中国山东、北京、深圳、南京等地6例随机TTV DNA阳性血清ORF1区309bp长片段测序比较，结果中国株之间同源性为91.0%，而与日本株之间同源性高达98.0%，这与我们的结论有些差异;然而，Okamoto等[22，23] 对众多TTV分离株比较研究发现TTV有极高的基因变异性，变异率达52.0%，以差异率>30.0%为度，至少将TTV分为16个基因型.Mizokami等[24] 通过分子流行病学研究也发现TTV至少可以分9个基因型，具有极高的基因多样性.由于我们未做TTV分子流行病学调查，故无法说明西安地区TTV分子流行病学更多特点，也不能分清西安地区TTV流行株与肝炎发病之间的关系，这有待于研究.
参考文献:
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作者简介: 傅恩清(1965-)，男(汉族)，安徽省全椒县人.主治医师，讲师，硕士.Tel.(029)3577541(H) Email.Fueqing@.fmmu.edu.cn
第四军医大学唐都医院:1 呼吸内科，
2 全军感染病防治中心，陕西西安710038
编辑 许昌泰, http://www.100md.com(傅恩清 白雪帆 王平忠 潘蕾 李光玉 陈红梅 杨为)
摘 要:目的 通过病例对比，进一步研究TTV是否有致病性;对1例西安地区非甲-非戊型肝炎但血清TTV阳性患者套式PCR终产物纯化测序，在验证我们TTV DNA检测正确性的同时初步研究西安地区TTV流行株部分分子生物学特点. 方法 在TTV ORF1区参照文献[1]设计一套套式PCR引物，并建立稳定的套式PCR检测法，对西安地区119例非甲-非戊型肝炎患者及162例健康有偿献血员进行TTV对比检测和统计学处理;对1例患者套式PCR终产物纯化测序，用DNAsis软件在计算机上与中国1株做同源性比较阳性. 结果 119例非甲-非戊型肝炎患者中37例TTV DNA阳性，阳性率31.1%;162例健康有偿献血员中TTV DNA阳性30例，阳性率18.5%;两组有明显的统计学差异(P<0.05，χ2 =5.251).对1例非甲-非戊型肝炎患者血清TTV套式PCR终产物纯化直接测序，测得143bp序列，经计算机比较，其与中国1株同源性为65.0%，差异率为35.0%(>30.0%).其中62bp序列同源性高达75.8%. 结论 TTV可能有致病性;西安地区可能存在新的TTV流行株.
Pilot study on pathogenicity of transfusion transmit┐ted virus
FU En-Qing BAI Xue-Fan WANG Ping-Zhong PAN Lei LI Guang-Yu CHEN Hong-Mei YANG Wei-Song
ZHOU Yong-Xing
1 Department of Respiratory Medicine，
2 Center of In-fectious Diseases Prevention of Chinese PLA，Tang-du Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710038，China
Keywords:transfusion transmitled virus;pathogenicity;hep-atitis，non-A to non-E;polymerase chain reac-tion;sequence analysis
Abstract:AIM To study pathogenicity of transfusion trans-mitted virus(TTV)and sequence part of TTV DNA in Xi'an.To compare partial sequence of TTV in Xi'an with DBH1，which were reported by WANG Hai-tao who is a pro-fessor of the Academy of Military Medical Sciences，in com-puter with software of DNAsis to find their homogeneity.METHODS A nested polymerase chain reaction(nested-PCR)assay with two pair of primers from ORF1of TTV genome was established to detect TTV DNA in serum sam-ples from119cases of non-A to non-E hepatitis patients and162cases of healthy blood donors.Their ALT and AST were detected in their serum too.RESULTS TTV DNA were de-tected in serum from37of119(31.1%)non-A to non-E hepatitis patients and30of162(18.5%)healthy blood donors.These two groups had statistical difference(χ2 =5.251，P<0.05).3of37cases of non-A to non-E hepatitis patients with TTV DNA positive were cirrhosis，the other30cases of non-A to non-E hepatitis patients with TTV DNA positive were acute hepatitis.The partial sequence of TTV(143bp)in Xi'an was sequenced and its homology with BDH1(Gen Bank AF116842)was65.0%after comparason with computer.CONCLUSION TTV may have pathogenici-ty，it can cause acute and chronic hepatitis.The results of comparason of the partial sequence of TTV in Xi'an with BDH1suggest that there may be new genicity of TTV in Xi'an.
0 引言
输血传播病毒TTV(transfusion transmitted virus)作为肝炎相关病毒被发现以来，对其致病性的研究一直是国内外TTV研究的焦点之一.虽然，众多学者进行了大量的研究，但是，至今TTV是否为肝炎病毒仍无较为明确的结论，我们通过对119例不明原因肝炎患者TTV DNA及肝功能检测，并与我院健康有偿献血员TTV DNA检测对比，试图对TTV的致病性进行研究.
1 对象和方法
1.1 对象 选择我院1998-01/2000-08住院与门诊及西京医院门诊非甲-非戊肝炎患者119(男83，女36)例;平均年龄(38±17)岁;将162(男46，女116)例有偿献血员经肝功能检测正常(ALT<667nkat·L-1 ，AST<500nkat·L-1 )，乙-丙型肝炎血清标志物检测均阴性，HIV抗体检测阴性者作为对照组.平均年龄(60±8)岁.对其中1例血清TTV DNA阳性的非甲-非戊型肝炎患者，将其TTV套式PCR检测终产物纯化测序，用DNAsis软件在计算机上与军事医学科学院王海涛报道的中国1株(BDH1，Gen Bank注册号AF116842)进行序列同源性比较.肝功能检测方法:全自动肝功能检测仪自动检测肝功.Taq DNA聚合酶、2.5mmol·L-1 dNTPs，DNA分子质量标准、肝炎系列标记物检测试剂盒均为华美公司生产，QIAEXⅡPCR产物纯化试剂盒为德国QIAGEN公司生产，琼脂糖上海东海制药厂生产，PCR扩增仪为美国PE公司生产的PE2400型PCR扩增仪，DNA全自动测序仪由美国ABI公司生产.
1.2 方法 取血清20μL，置于Ependoph管中，加入20μL(等体积)的裂解液，置沸水中加热10min，高速离心(80g，10min)，取上清备用.引物设计用于TTV DNA检测的引物，参照文献[1]报道的引物序列设计，由西安美联公司合成(Tab1).引物合成后以无离子水稀释至2.5mmol·L-1 的应用浓度.
表1 TTV DNA套式PCR扩增引物序列 略
套式PCR(nested-PCR)扩增方法文献[2]并做适当的修改，第1次取标本离心上清2μL做DNA模板，第2轮以第1轮产物2μL做模板，两次PCR反应体积均为15μL，含2.5mmol·L-1 dNTPs1μL，2.5μmol·L-1 浓度引物各1μL(第1轮为两外引物，第2轮为两内引物)，Taq酶1.5U，10×Taq酶 buffer1.5μL.顶部以石蜡油封闭.以PE公司生产的PE-2400型PCR仪自动循环，均按下列参数循环:94℃30s，56℃30s，72℃30s，共35个循环.开始循环前94℃预变性5min，最后72℃延伸5min.PCR终产物经15g·L-1 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线检测仪观察结果.当观察到197bp的扩增DNA条带时判为TTV DNA检出阳性(Fig1).每次检测均设阳性与阴性对照.从低熔点凝胶中切下阳性条带，用QIAEX纯化试剂盒按说明步骤进行纯化，送我校中心实验室以自带引物直接测序法测序，所用内引物对应的TTV DNA位置为nt2061～2080和nt2238～2257，预计靶基因全长197bp.
图1 略
2 结果
非甲-非戊肝炎组及健康有偿献血员组TTV DNA检测结果(Tab2)，非甲-非戊肝炎组肝功能结果:谷丙转氨酶(ALT)为(4328.7±6536.3)nkat·L-1 ，谷草转氨酶(AST)为(3500.0±6631.8)nkat·L-1 .对1例非甲-非戊型肝炎患者血清检测扩增的TTV DNA的靶片段进行了碱基序列的直接测定，测得143bp长片段，测序结果与王海涛在Gen Bank注册BDH1序列比较结果(Fig2，3)，两者同源性为65.0%，差异率为35.0%(>30.0%).其中62bp片段与其同源性高达75.8%.
表2 TTV DNA检测结果表 略
图2 - 图3 略
3 讨论
对TTV致病性的研究，一直是TTV研究最热点问题之一[3] ，同时，国际上至今并未达成统一的认识.Zein等[4] 通过对丙型肝炎合并TTV感染的研究发现TTV与HCV相关肝病病程及预后无关.Forns等[5] 对西班牙96例长期透析患者检测发现53.0%TTV阳性者中肝功能异常仅2例，提示TTV与肝炎发病无相关性.Kao等[6] 对我国台湾地区一组肝炎患者研究未发现TTV与非甲-非戊型急性肝衰竭有相关性.Poovorawan等[7] 在201例吸毒者与200例献血员的研究也发现TTV阳性与阴性者血清谷丙转氨酶(ALT)比较无差异，不支持TTV有致病性，且发现人体对TTV具有免疫清除作用.Sugiya-ma等[8] 在儿童中的研究同样得出TTV无致病性结论.Asaba等[9] 和Hasebe等[10] 分别对非乙-非丙型肝炎患者肝组织进行病理研究，发现TTV阳性与TTV阴性患者之间肝组织结构无任何差异，同样不赞成TTV有致病性.然而，也有众多研究支持TTV有致病性;Shibayama等[11] 对829例慢性肝病患者及30例非乙-非丙、非庚型肝炎患者研究推测TTV可能为非乙-非丙、非庚型慢性肝病的病因.Tanaka等[12] 和Kanda等[13] 研究认为TTV可引起急性非甲-非戊型肝炎，但无证据证明其可致急性重度肝炎，不过TTV阳性的爆发性肝炎预后明显差于TTV阴性者.Tsubota[14] 通过11例单纯TTV阳性肝炎患者观察研究发现，TTV可引起与其他慢性肝炎相似的病理改变，其表现为γ-GTP异常，而ALT正常的肝炎改变.Hoshino等[15] 在研究非甲-非丙肝炎中TTV的基因型差异时发现TTV1b型可能有致病性.Okamoto[3] 也认为TTV的部分基因型有重要的临床意义.我们研究发现，非甲-非戊型肝炎组TTV DNA检测阳性率为31.1%，较我们前期报道的60.0%[16] 低，可能与前期病例数较少有关.健康有偿献血员组TTV DNA检测阳性率为18.5%，与我们以前报道的16.8%相当[17，18] ;非甲-非戊型肝炎组与健康有偿献血员组TTV DNA检测阳性率有明显的统计学差异(χ2 =5.251，P<0.05)，提示TTV有致病性;我们前期研究[16] 也得出同样的结论;在37例TTV阳性非甲-非戊型肝炎中，3例为肝硬化，34例均为急性肝炎，其引起肝炎中，ALT最高达36690.7nkat·L-1 ，AST最高达34523.6nkat·L-1 ，并非如文献报道的仅仅表现为ALT轻度异常型肝炎[19] .Itoh等[20] 将861名以前无输血史，且HBV，HCV标志物均阴性的献血员分为ALT增高组(1488.6±606.8)nkat·L-1 和ALT正常组(≤750nkat·L-1 )，TTV DNA阳性率分别为22.1%(62/280)和15.7%(91/581)，二者相比有显著差异(P<0.02)，认为TTV与非甲-非戊型肝炎有较好的相关性，与我们得出相似的结论.本组病例ALT为(4328.7±6536.3)nkat·L-1 ，AST为(3500.0±6631.8)nkat·L-1 ，可以看出ALT与AST表现出较大的差异度，提示单纯TTV阳性肝炎引起肝功能损害的多样性.对1例非甲-非戊型肝炎血清TTV DNA套式PCR扩增终产物纯化测序143bp，结果经计算机与BDH1株同源性比较，两者同源性为65.0%，差异率为35.0%(>30.0%)，提示西安地区可能存在新的TTV流行株.姬新颖等[21] 对中国山东、北京、深圳、南京等地6例随机TTV DNA阳性血清ORF1区309bp长片段测序比较，结果中国株之间同源性为91.0%，而与日本株之间同源性高达98.0%，这与我们的结论有些差异;然而，Okamoto等[22，23] 对众多TTV分离株比较研究发现TTV有极高的基因变异性，变异率达52.0%，以差异率>30.0%为度，至少将TTV分为16个基因型.Mizokami等[24] 通过分子流行病学研究也发现TTV至少可以分9个基因型，具有极高的基因多样性.由于我们未做TTV分子流行病学调查，故无法说明西安地区TTV分子流行病学更多特点，也不能分清西安地区TTV流行株与肝炎发病之间的关系，这有待于研究.
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作者简介: 傅恩清(1965-)，男(汉族)，安徽省全椒县人.主治医师，讲师，硕士.Tel.(029)3577541(H) Email.Fueqing@.fmmu.edu.cn
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编辑 许昌泰, http://www.100md.com(傅恩清 白雪帆 王平忠 潘蕾 李光玉 陈红梅 杨为)