褶合光谱法测定β 2半乳糖苷酶的活性

    郑 红3

    吴玉田 方慧生

    (第二军医大学药学院药物分析教研室 ,上海 200433)

    摘 要 运用褶合光谱法建立了β 2半乳糖苷酶的最佳褶合光谱以及该酶在最佳测试条件下的线性方

    程: Qj = 1. 906× 10 - 2

    + 4. 946× 10 - 3

    C + 1. 909× 10 - 4

    C2

    , r = 1. 0000 ;对已瞬时转染β 2半乳糖苷酶表达载体

    的 COS 21细胞提取液样品中的β 2半乳糖苷酶的活性进行了测定 ,并与吸光度值分析法相对照。结果表

    明:本法快速、简便、准确 ,在生化分析中有广泛的应用价值。

    关键词 褶合光谱法 , β 2半乳糖苷酶 ,活性

    2000206224收稿;2001201215接受

    本文系国家自然科学基金资助项目(No. 39770904)

    1 引 言

    来源于大肠杆菌的lacZ基因编码β 2半乳糖苷酶 ,是用途最广泛的遗传报道分子之一 ,有各种不同

    的底物可供进行体外及体内分析。该酶催化各种β 2半乳糖苷类物质的水解 ,包括几种专为不同分析方

    法而特制的底物。除了用作未知特性的顺式调控序列的报道分子外 ,在确定的启动子控制下的β 2半乳

    糖苷酶的表达也常用作校正其他报道分子分析结果的内对照。 β 2半乳糖苷酶对校正 CAT及荧光虫荧光

    素酶尤其有用 ,因为这些报道分子分析方法中所制备的细胞裂解物同样适于用来检测β 2半乳糖苷酶的

    活性。目前已知检测β 2半乳糖苷酶活性的方法有吸光度值分析、荧光分析、化学发光分析 ,其中以邻2硝

    基苯2 β 2D2半乳吡喃糖苷(ONPG)进行吸光度值分析最为常用〔 1〕。本文首次运用褶合光谱法〔 2〕 对β 2半乳

    糖苷酶的活性进行了测定 ,证实与吸光度值分析法相比 ,本法不仅更加简便、快速 ,而且灵敏度和精确性

    也更高。

    2 实验部分

    2. 1 仪器和试剂

    Cary100紫外2可见分光光度仪(Varian公司) ;UV Vis2W褶合光谱仪软件分析系统(玉田分析仪器公

    司) ;ONPG、 β 2半乳糖苷酶(Amresco 公司) ;邻2硝基苯酚(上海化学试剂公司) ;其余试剂均为分析纯。100

    × Mg溶液〔 3〕:为0. 1 mol L MgCl2 ,4. 5 mol Lβ 2巯基乙醇;0. 1 mol L 磷酸钠缓冲液(pH 7. 5) :由41 mL 0.

    2 mol L Na2HPO4· 2H2O、 9 mL 0. 2 mol L NaH2PO4· 2H2O和50 mL 水配制而成;1 × ONPG底物溶液:为0. 1

    molL 磷酸钠(pH 7. 5)的4 g L ONPG溶液;酶标准溶液:将β 2半乳糖苷酶用 0. 1 mol L 磷酸钠(pH 7. 5)

    溶解配成3000单位 mL 的浓度 ,使用前稀释成50 u mL 及10 u mL 的浓度;0. 5030μmol L 邻2硝基苯酚

    溶液:取适量邻2硝基苯酚溶于 0. 1 mol L NaOH ,稀释配制而成;模拟样品液的配制:分别取 10 u mL 的

    酶标准溶液 2、 3、 5、 6、 10 μ L ,并分别加 28、 27、 25、 24、 20 μ L 模拟细胞提取物 ,加 100 ×Mg 溶液 3 μ L ,1 ×

    ONPG底物溶液 66 μ L ,29 μ L 模拟细胞提取物及 0. 1 mol L 磷酸钠(pH 7. 5) 201 μ L ,混合 ,于 37 ℃温育

    30min ,加入011 mol L Na2CO3 500μ L 终止反应 ,配制成5份浓度不同的模拟样品液。

    2. 2 实验方法

    2. 2. 1 测定原理及酶单位定义〔 3 ,4〕 β 2半乳糖苷酶分解ONPG,生成邻2硝基苯酚和半乳糖。在碱性介

    质里反应产物邻 - 硝基苯酚呈黄色。一个单位大肠杆菌β 2半乳糖苷酶定义为 37 ℃每分钟内分解 1 μmol

    ONPG所需酶量。

    2. 2. 2 操作 取已瞬时转染β 2半乳糖苷酶表达载体的 COS 21细胞提取液30 μ L ,加 100 × Mg溶液 3 μ L ,1

    × ONPG底物溶液 66 μ L 及 0. 1 mol L 磷酸钠(pH 7. 5) 201 μ L ,混合 ,于 37 ℃温育 30 min ,加入 0. 1 mol L

    第29卷

    2001年5月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第5期

    583～585Na2CO3 500 μ L 终止反应 ,以磷酸钠缓冲液为空白 ,于350～550 nm扫描 ,通过褶合光谱仪的单组份定量分

    析功能系统 ,测定样品中β 2半乳糖苷酶的活性。所得结果与吸光度值分析法相对照 ......