第29卷

    2001年7月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第7期

    745～749

    研 究 报 告

    高效液相色谱串联质谱法测定血清中内美通

    李 广1 ,2

    王清刚1

    王义明1

    罗国安3 1

    吴尔诺3

    高雪峰3

    1

    (清华大学化学系 ,北京 ,100084) 2

    (韶关大学化学系 ,韶关 512005)

    3

    (国家计划生育委员会研究所 ,北京 100084)

    摘 要 研究了高效液相色谱串联质谱联用测定人血清中内美通的方法。用乙醚提取血清中的内美

    通 ,米非斯酮做内标 ,电喷雾离子化 ,选择内美通母、子离子对 m z 3092m z 241 ;内标的母、子离子对 m

    z 4302m z 372 ;串联质谱采用多反应扫描监测方法 ,定量测定人血清中的内美通。该方法测定速度快 ,灵敏度高 ,选择性好。方法的标准曲线线性范围 315～177μg L ( r

    2

    = - 0. 999) ;检出限 0. 8μg L ;进行 6

    次平行测定 ,日间 RSD = 2. 3 %～13. 7 % ,RE = 4. 8 %～3. 0 %;日内 RSD = 5. 5 %～14. 8 % ,RE = 3. 1 %～

    617 %;回收率内美通是91. 0 % ,内标米非斯酮是90. 6 %。4 min完成一个样品测定。

    关键词 内美通 ,高效液相色谱 ,电喷雾串联质谱

    2000208210收稿;2001201220接受

    本文系国家自然科学基金重点资助项目(No. 296350220)

    1 引 言

    内美通(英文名称gestrinone ,简称 R2323)是一种治疗子宫内膜炎和紧急避孕药〔 1〕。血清中 R2323

    快速准确测定 ,有助于深入研究它的药理作用和进一步开发利用。R2323 通常采用放射免疫测定的方

    法〔 2〕。这种方法操作处理繁琐 ,结果误差大 ,难实现自动化。也可以用高效液相色谱(HPLC)

    〔 3〕,在 342

    nm下 ,用UV检测器进行测定。这种方法测定过程需要时间较长 ,测定的灵敏度不太高 ,无法对血清一

    类低含量的样品直接进行测定。80年代末迅速发展起来的液相色谱和串联质谱联用技术(LC ESIMS

    MS) ,具有对样品前处理要求不高 ,分析自动化程度高 ,速度快 ,选择性好 ,灵敏度高等特点。被广泛用

    于复杂体系 ,低含量有机化合物分析 ,如生物体内药物及代谢产物分析〔 4～9〕。本文利用(LCMSMS)多

    反应监测(MRM)的方法 ,以米非斯酮为内标(英文名称 mifepristone 简称 RU 486) ,建立血清中 R2323 快

    速定量测定方法。

    2 实验部分

    211 试剂与仪器

    21111 试剂 R2323分子量:308 ,结构式如图1a (由北京第三制药公司提供) 。RU486 分子量 429 ,结构

    式如图1b(由法国 Roussel Uclaf 公司提供) 。甲醇和甲酸(HPLC级 ,香港fisher scientific 公司提供) 。其余

    试剂为国产分析纯试剂。血样由国家计划生育委员会研究所提供。

    21112 仪器 三级四极杆串联质谱仪:API3000LCMSMS系统( PE 公司制造 ,包括离子喷雾离子源

    ( IS) 、四极杆MSMS质谱仪、在线真空脱气机 ,PE200 型LC高压泵) ,Packing Kromasil C18色谱柱(天津特

    纳科学仪器有限公司) ,250mm× 4. 6mm I.D.粒度5μm等。

    212 仪器条件

    21211 液相色谱条件 流动相:012 %甲酸的甲醇溶液;流速 110 mL min ,柱温:室温(25 ±2 ℃) ;进样量

    20μ L ,LC与MSMS的接口采取10∶ 1的分流进入质谱离子源的方式。21212 质谱条件 扫描模式:正离子扫描;电喷雾电压 + 5. 0 kV ,温度 200 ℃;雾化气(高纯氮)流速为

    1 L min ;气帘气设置1. 44 L min ;聚焦孔电压50 V ,在此条件下记录全扫描;碰撞活化解离(CAD)用压强

    为3. 999 × 10 - 3

    Pa 高纯氮气作碰撞气体 ,流速0. 8 L min ,碰撞能量29 eV。用MRM进行800 ms定量 ,对

    R2323 m z 309作母离子 , m z 241作子离子 ,内标 RU 486用 m z 430作母离子 , m z 241作子离子。使

    用MRM方式同时监测 m z 3092m z 241、 m z 4302m z 372离子对。

    图1 R2323(a)和 RU486(b)的结构

    Fig. 1 Structure of gestrinone (R2323) (a) and mefepristone (RU486) (b)

    213 样品预处理

    从已生育 ,身体健康口服R2323的量为5 mg的妇女静脉抽取的血样 ,在室温放置2 h进行凝固。待

    血样凝固后 ,将它放在1000 r min离心机中离心 15 min ,分离出血清 ,将它在 - 20 ℃下保存备用。空白

    血样从已生育 ,身体健康未服 R2323的妇女身上抽取 ,处理方法同前。

    取采集到的血清200μ L ,加入50μ L 内标 RU486 (浓度100μg L 的甲醇溶液)分别用 210 mL 乙醚抽

    提两次 ,不夹带水相 ,将醚层完全转移出来;合并醚层 ,加热到 40 ℃除去乙醚 ,再用 200μ L 甲醇溶解 ,每

    次取20μ L 用于LCMSMS分析。

    214 标准样品系列溶液的配制

    准确配制浓度为110 mg L 的R2323贮备液 ,在4 ℃下保存 ,依次向200μ L 空白血清中加入适量的贮

    备液和50μ L 浓度100μg L 内标 RU486 ,样品按照213节所建立方法进行提取和定容处理 ,使 R2323 浓

    度分别为:177、 7018、 3514、 1717、 711、 315μg L。RU486的浓度均为 25μg L 的溶液。作为标准样品系列

    溶液。

    215 标准检验样品的配制

    用空白血清 ,依次加入 R2323和 RU486 ,然后进行样品血清相同的预处理 ,最后用甲醇定容 ,并使溶

    液的 R2323的浓度依次为8、 80、 100μg L。RU486的浓度均为25μg L ......