毛细管电泳中葡萄糖2羟丙基甲基纤维素体系

    分离脱氧核糖核酸

    靳 艳1

    林炳承3 1

    冯应升2

    1

    (中国科学院大连化学物理研究所 ,大连 116023) 2

    (香港大学化学系 ,香港)

    摘 要 葡萄糖作为羟丙基甲基纤维素(Hydroxypropylmethyl cellulose , HPMC)筛分体系的添加剂 ,可以改

    善该体系在低浓度时分离脱氧核糖核酸(DNA)的能力。研究了硼酸浓度和 pH值对葡萄糖2羟丙基甲基

    纤维素体系分离性能的影响;并将葡萄糖与其它添加剂如甘油、甘露醇对分离的影响作了比较 ,葡萄糖

    特有的环状结构使得其对羟丙基甲基纤维素体系分离能力的提高更为显著。

    关键词 毛细管电泳 , 脱氧核糖核酸 ,葡萄糖

    2000206207收稿;2000210210接受

    本文系国家自然科学基金重点资助项目(20035010)

    1 引 言

    毛细管电泳在核酸分析中的作用已经引起广泛重视,其中聚合物溶液筛分体系由于其易于更换、操

    作简便、分辨率高、速度快等优点而成为当前毛细管电泳分离DNA的常用分离模式〔 1 ,2〕,已经用于DNA

    测序〔 3〕、限制性片段分析〔 4〕、聚合酶链反应(Polymerase chain reaction , PCR)产物分析〔 5〕。在这种分离模

    式中影响分离的主要因素有:高分子类型 ,分子量和浓度。但是选择合适的筛分介质和浓度是一个比较

    困难的问题 ,一般来讲 ,对于较小的核酸片段(小于1000碱基对〕要求较大的筛分剂浓度〔 2〕,但是大浓度

    的筛分介质的粘度也较大 ,给操作带来诸多不便。在纤维素衍生物筛分体系中加入小分子添加剂如甘

    油〔 6〕、甘露醇〔 7 ,8〕,可以在较低浓度达到高浓度时的筛分能力 ,成为不增加粘度提高分离能力的有效途

    径。

    用作纤维素衍生物筛分体系的添加剂都是多羟基化合物 ,多羟基化合物上的羟基与缓冲液中硼酸

    络合反应方程式如下:

    H3BO3 + H2O = B

    HO

    HO

    OH

    OH

    四羟基硼酸

    + H+

    (1)

    B

    HO

    HO

    OH

    OH

    -

    + C

    C HO

    C OH

    n [ B

    HO

    HO

    O

    C

    Cn

    O C

    -

    硼酸2二元醇络合物

    + H+

    (2)

    B

    HO

    HO

    O

    C

    Cn

    O C

    -

    + C

    C HO

    C OH

    n [

    B

    O C

    Cn

    C O

    O C

    Cn

    C O

    -

    + H+

    Spriane 二聚物

    (3)

    纤维素为多糖类分子 ,其链上的部分羟基被取代而成为衍生物如羟丙基甲基纤维素(HPMC) 。对

    HPMC而言 ,纤维素链上仍有60 %以上的羟基未被取代 ,这些羟基也会与硼酸根发生络合作用 ,因此多

    第29卷

    2001年5月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第5期

    502～506羟基化合物通过与硼酸根络合并进一步与 HPMC络合 , 相当于在 HPMC链上支接一个支链 , 这些支链

    修饰了 HPMC所形成的交缠溶液中的网孔 ,从而可以改善 DNA 分子在 HPMC分离体系中的迁移行为 ,提高分离能力。甘油和甘露醇都是直链多羟基化合物 ,链较柔软 ,空间位阻小;而葡萄糖是带有 5 个羟

    基的五元环化合物 ,其环状结构使得连接在 HPMC链上时产生的空间位阻较大 ,对 HPMC链的修饰作用

    将更明显 ,因此本研究选用葡萄糖作为羟丙基甲基纤维素筛分体系的添加剂 ,考察其对羟丙基甲基纤维

    素筛分体系分离DNA能力的影响 , 研究了硼酸浓度和pH值对该体系的影响 ,并将葡萄糖与添加剂甘

    油、甘露醇的分离效果加以比较。

    2 实验部分

    2. 1 材料和主要仪器设备

    Beckman P ACE System MDQ毛细管电泳仪(美国贝克曼公司) ,自制聚丙烯酰胺涂层石英毛细管柱

    ( ID. 50μm ,OD. 375μm ,原料柱购自河北永年光导纤维厂) ;UV检测波长254 nm ,柱温25 ℃,恒压 - →+

    操作模式 ,运行电压为8 kV ,电动进样10 kV· 5 s。实验所用毛细管总长40. 5 cm ,有效长度30 cm。

    2. 2 化学试剂及样品

    羟丙基甲基纤维素(HPMC ,2 %水溶液在 25 ℃时的粘度为 4 帕秒 ,Aldrich) ,三羟甲基氨基甲烷

    (Tris ,国产分装) ,EDTA(长春化学试剂厂) ,硼酸(开原化学试剂厂) ,葡萄糖(沈阳化学试剂厂) ,甘露醇

    (沈阳市和平化工厂) 。DNA标准片段10 bp DNA ladder (Gibco BRL) , 从10 bp 到330 bp ,每相邻两片段

    相差10 bp ;pBR322 Hinf I , 由北京协和医院提供;样品用二次去离子水稀释至20 g L。

    2. 3 缓冲液

    基本缓冲液为 TBE(100 mmol L Tris2Boric acid ,2 mmol L EDTA ,pH 8. 3) ;其它 pH值的缓冲液是将

    TBE用1 mol L NaOH或1 mol L HCI调至所需pH值。一定量的羟丙基甲基纤维素溶于 TBE缓冲液中

    图 1 毛细管电泳分离 DNA 标准片段 pBR322 Hinf I

    的电泳谱图

    Fig. 1 Electropherograms of pBR322 Hinf I by capillary

    electrophoresis

    筛分介质( seiving matrix) :a. 0. 5 % hydroxypropyl2methyl cellulose

    (HPMC) ; b. 0. 5 % HPMC + 10 %葡萄糖 ( glucose ) 。电泳条件

    (conditions) :进样(injection) 10 kV× 5s ,运行电压(running at) 8 kV

    ( - →+ ) ,检测(UV detection) 254 nm,温度(capillary temperature)

    25℃。

    形成 HPMC筛分介质。

    3 结果与讨论

    3. 1 葡萄糖对 HPMC筛分介质分离性能的影响

    以0. 5 %( W V) HPMC为筛分介质分离 DNA 标

    准片段pBR322 Hinf I ,改变 0. 5 %( W V) HPMC中葡

    萄糖的浓度 ,研究葡萄糖对分离的影响 ......