研 究 报 告

    固载蛋白 A交联聚甲基丙烯酸缩水甘油酯

    连续床亲合色谱柱的制备及性能考察

    罗权舟 邹汉法3

    汪海林 毛希琴 孔 亮 倪坚毅

    (中国科学院大连化学物理研究所 , 国家色谱研究分析中心 , 大连 116012)

    摘 要 采用沉淀聚合法“原位” (in2situ)聚合合成了交联聚甲基丙烯酸缩水甘油酯连续床色谱柱 ,对其

    进行化学改性后 ,分别得到含有11个碳原子间隔臂以及不含间隔臂键合了蛋白 A的高效亲合色谱柱。

    考察了这两种色谱介质的性能 ,结果表明含有间隔臂的介质有一定的疏水性;对传统制备蛋白配基的亲

    合色谱介质的合成路线进行了改进;采用不含间隔臂的亲合柱测定了人血浆中人免疫球蛋白 G(HIgG)

    的含量 ,所测得的定量标准曲线线性相关系数达到 0. 999 ;考察了流速对所合成的连续床色谱柱柱压的

    影响 ,当流速高达9. 0 mL min时 ,柱压也仅为6. 5MPa ;采用pH梯度对 HIgG的不同亚基进行了分离。

    关键词 亲合色谱法 , 聚合物 , 连续床色谱柱 , 蛋白A , 人免疫球蛋白 G

    2000206220收稿;2000212228接受

    1 引 言

    蛋白A(protein A)与免疫球蛋白的 Fc 区之间具有很强的特异性亲合作用 ,因而固载蛋白 A 的亲合

    介质可用于免疫球蛋白及单克隆抗体的分离纯化〔 1 ,2〕。亲合色谱是生物工程下游领域中用于分离纯化

    生物大分子的最有效的技术之一 ,高效亲合介质的制备至为重要。目前应用最为广泛的是直径在几十

    至几百微米之间的球型凝胶颗粒 ,但这些介质易压缩变形的缺陷限制了其在实际应用中的快速纯化和

    生产效率〔 3 ,4〕。Afeyan等发展的灌流色谱基质是一种较为理想的生物大分子色谱填料 ,但由于价格昂贵

    而限制了其广泛应用〔 5 ,6〕。膜色谱结合了膜分离技术与柱色谱的优点 ,溶质在膜色谱中以对流传质为

    主 ,因而特别适合于生物大分子的分离分析〔 7 ,8〕。80 年代末出现的刚性连续床聚合物色谱填料具有合

    成过程简单 ,柱压低 ,传质速度快等优点 ,可用于生物大分子的快速分离〔 9 ,10〕。本文选用甲基丙烯酸缩

    水甘油酯(GMA)为单体 ,亚乙基二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂原位聚合制得含有 11 个碳原子间隔

    臂和不含间隔臂的蛋白A连续床高效亲合色谱柱〔 11〕,对传统制备蛋白配基的亲合色谱介质的合成路线

    进行了改进 ,比较了这两种色谱填料的性能 ,用不含间隔臂的蛋白 A 色谱柱测定了人血浆中人免疫球

    蛋白 G(HIgG)的含量。并尝试采用pH梯度对 HIgG的不同亚基进行了分离。

    2 实验部分

    2. 1 材料与试剂

    Waters 515高压液相色谱泵2台 , Waters 2487双波长检测器一台 ,WDL297色谱工作站(国家色谱研

    究分析中心) 。蛋白A ,HIgG均购自 Sigma 公司 ,人血浆购自大连妇产医院 , 其它化学试剂均为分析纯。

    2. 2 色谱条件

    色谱柱(50 × 4mm I.D) ;流动相为50 mmol L 磷酸缓冲液含 0. 15 mol L NaCl (pH = 7. 0) (上样液)和

    012 mol L 甘氨酸2盐酸缓冲液(pH = 2. 3) (洗脱液) ;检测波长280 nm ,灵敏度 0. 5Aufs。先用上样液平衡

    柱子 ,上样后改用洗脱液冲洗。

    2. 3 实验方法

    第29卷

    2001年5月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第5期

    497～5012. 3. 1 交联聚甲基丙烯酸缩水甘油酯连续床亲合色谱柱的制备 将含有适当比例 GMA ,EDMA ,十二

    醇 ,环己醇以及适量引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)的混合溶液通氮气除氧 15 min 后 ,加入空管柱中密封

    两端 ,恒温至反应完成。将色谱柱接泵用50 mL 四氢呋喃冲洗除去致孔剂及其它可溶性化合物。将合

    成好的基质分别与己二胺 ,戊二醛反应 ,最后再与蛋白A作用得到含有 11 个碳原子间隔臂的蛋白A高

    效亲合色谱柱;将合成好的基质直接水解 ,再用新配制的高碘酸钠氧化 ,最后与蛋白A 作用制得不含间

    隔臂的蛋白A高效亲合色谱柱。

    2. 3. 2 非特异性吸附的测量 准确称量牛血清白蛋白(BSA)冻干标准品 ,用上样液配置成 5 g L 的溶

    液 ,准确吸取20μ L 进样 ,通过色谱工作站采集谱图。

    2. 3. 3 标准曲线的制作 准确称量 HIgG冻干标准品 ,用上样液配成 1. 134 g L 的溶液 ,分别准确吸取

    10、 15、 20、 25、 30 μ L 该标准溶液进样 ,通过色谱工作站采集数据并对谱图积分得出峰面积 ,以峰面积对进

    样量作线性拟合 ,得到定量标准曲线。

    2. 3. 4 血浆样品的测定 实验前将冷冻保存的血浆样品室温解冻 ,离心后吸取上清液用上样液稀释 2

    倍 ,准确吸取20μ L 进样 ,通过色谱工作站采集数据并对谱图积分得出峰面积 ,在标准曲线的线性范围

    内用峰面积外标法定量。

    2. 3. 5 柱负载的测定 将预处理的血浆样品用上样液稀释250倍后,将该溶液以1. 0 mL min的流速流

    过色谱柱使其达到饱和吸附 ,再用洗脱液将饱和吸附的 HIgG洗脱下来 ,收集洗脱的 HIgG溶液调节其

    pH值为7. 0 ,准确吸取该溶液20μ L 进样 ,通过色谱工作站采集数据并对谱图积分得出峰面积 ,在标准

    曲线的线性范围内用峰面积外标法定量 ,进而求得吸附量。

    3 结果与讨论

    3. 1 高效亲合连续床色谱柱的制备

    文献报道的亲合色谱填料的制备 ,无论有无间隔臂一般都采用在基质上首先键合醛基 ,再使醛基与

    目标蛋白反应生成席夫碱(schiff base) ,剩余的醛基与含有胺基的小分子化合物如甘氨酸乙脂反应。由

    于席夫碱不稳定易断裂 ,因此最后需要用还原剂将其还原为单键〔 12〕。用于分离分析生物大分子的色谱

    介质表面应具有强的亲水性 ,以保证被分离蛋白有较高的活性回收率。本文在制备连续床亲合色谱填

    料时直接使用还原剂将残余醛基还原为羟基 ,避免了使用含有胺基的小分子化合物与残余醛基的“封

    尾”反应 ,这样不仅简化了制备过程 ,缩短了反应时间 ,而且还可以通过生成羟基提高分离介质表面的亲

    水性。另外 ,小分子化合物与残余羟基的“封尾”反应还会取代部分已经以酰胺键键合到载体表面的目

    标蛋白 ,因此 ,省去封尾反应还能提高目标蛋白的键合量。本文合成的蛋白 A 亲合柱具有良好的稳定

    性 ,在使用半年后性能基本未发生改变。

    3. 2 两种亲合介质非特异性吸附的比较

    含有己二胺间隔臂和不含间隔臂的两种亲合介质对BSA 的非特异性吸附的谱图如图 1 所示 ......