研 究 简 报

    毛细管电泳法测定猪体组织中甜菜碱含量

    胡彩虹3

    汪以真 许梓荣

    (浙江大学饲料科学研究所 , 杭州 310029)

    摘 要 建立了毛细管电泳法快速测定猪体组织中甜菜碱含量的方法。甜菜碱首先转化为苯甲酰甲基

    酯后直接上样测定。pH为3. 0的磷酸缓冲溶液使甜菜碱酯化物和甜菜碱结构类似物酯化物之间以及

    酯化物和酯化剂之间都能很好地分离 ,这也省去了反应混合液的前处理。该法标准曲线的线性范围为4

    ～600 mgP L ,相关系数 r为0. 9999 ,最低检测限为1 mgP L ,相对标准偏差为 2. 2 %～4. 7 % ,标准加入回收

    率为9519 %～98. 4 %。

    关键词 甜菜碱 ,猪 ,毛细管电泳 ,体组织

    2000212225收稿;2001205220接受

    本文系国家自然科学基金农业重点倾斜项目(No. 39870593)和浙江省自然科学基金项目(No. 398276)

    1 引 言

    甜菜碱(三甲基甘氨酸)的结构式为(CH3 ) 3N+

    CH2COO- 〔 1〕,它的基本功能是作为甲基供体 ,其甲基

    代谢主要发生在肝脏、肾脏 ,其次是肌肉〔 2〕。在动物体内 ,甜菜碱的内源性来源是胆碱经胆碱氧化酶系

    催化而来 ,该酶系主要出现在肝细胞和肾细胞线粒体中〔 3〕。Mei2Heng等报道 ,鼠体肝脏和胎盘中甜菜碱

    的含量分别为70μgP g和306μgP g

    〔 4〕,猪体组织中甜菜碱的含量还未见报道。在日粮中添加甜菜碱能明

    显降低肥育猪的背膘厚 ,明显提高猪肉中肌红蛋白、肌内脂肪和肌苷酸含量〔 5〕,甜菜碱作为饲料添加剂

    已在畜禽养殖业中得到广泛应用。

    国外对于动物组织中甜菜碱含量的测定方法包括分光光度法〔 6〕、甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶

    法〔 7〕和高效液相色谱法〔 4 ,8 ,9〕,前两种方法灵敏度较低 ,而高效液相色谱法虽可检测到 1 nmol 的甜菜碱 ,但前处理较繁琐。目前尚未见毛细管电泳法测定动物组织中甜菜碱含量的报道。作者试图建立一种灵

    敏度高、快速、简单的毛细管电泳法测定猪体中甜菜碱的含量 ,为研究在日粮中添加甜菜碱是否促进畜

    禽体组织中甜菜碱的沉积提供研究基础。

    2 实验部分

    2. 1 仪器与试剂

    PP ACE 2100毛细管电泳系统(美国Beckman公司) ,配紫外检测器 ,未涂层石英毛细管柱75 μm(id) ×

    57 cm ,分离长度50 cm。

    主要试剂与溶液:182冠醚26 :1 mg 182冠醚26溶于1 mL 乙腈中; 酯化剂:20 mg对溴代苯甲酰甲基溴

    ( p2bromophenacyl bromide)溶于1 mL 乙腈中;甜菜碱标准品(Sigma 公司 ,纯度 9919 %) ,配制成0. 6 gP L 的

    原液备用; 电解质溶液:25 mmolP L 磷酸和 25 mmolP L 磷酸二氢钠溶液按不同比例组成的缓冲体系。试

    剂均为分析纯。

    2. 2 实验方法

    取适当浓度的甜菜碱标准溶液 0. 1 mL 至 10 mL 试管中 ,然后加入 50μ L 催化剂混合液(0. 1 molP L

    KHCO3∶ 0. 1 molP L KH2 PO4∶ 182冠醚26 = 1∶ 1∶ 4) ,振荡并加入 300μ L 酯化剂 ,加盖 ,80℃水浴 75 min ,冷却

    到室温 ,然后向试管内加入2. 5 mL 0. 1 molP L H2 SO4 和2 mL 氯仿 ,振荡 ,3000 rP min离心5 min ,取上层硫

    第29卷

    2001年11月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第11期

    1269～1272

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.酸相进样测定。电泳温度:25℃;电泳电压:15 kV ;压力进样 34. 5 kPa· s ;214 nm紫外检测。溶液进入毛

    细管之前 ,均用0. 22μm微孔滤膜过滤 ,两次进样间毛细管用水及缓冲溶液各冲洗3 min。

    3 结果与讨论

    3. 1 酯化反应的收率

    甜菜碱与对溴代苯甲酰甲基溴的酯化反应式见图1。用紫外分光光度计在262 nm测定甜菜碱酯化

    物的吸光度 ,甜菜碱酯化物的吸光系数ε= 1. 97 × 10

    4

    L· mol

    - 1

    · cm- 1

    ,由甜菜碱酯化物吸光度及其吸光系

    数算得酯化反应的收率为78 %。

    (CH3) 3N+

    CH2COO-

    + Br COCH2Br (CH3) 3N+

    CH2COOCH2CO Br

    甜菜碱 Betaine

    对溴代苯甲酰甲基溴 p2Bromophenacyl bromide

    甜菜碱酯化物 Betaine ester

    图1 甜菜碱酯化反应式

    Fig. 1 Reaction scheme of betaine and p2bromophenacyl bromide

    3. 2 电解质溶液 pH值的选择

    毛细管的分离性能与温度、电压和pH值有密切的关系。本实验研究了pH对甜菜碱酯化物和对溴

    代苯甲酰甲基溴的分离的影响(见图2) 。在高pH条件下 ,电渗流起主要作用 ,甜菜碱酯化物和未反应

    的对溴代苯甲酰甲基溴不能分离;但在pH 4以下 ,电渗流几乎可以不计 ,持有正电荷的物质泳动 ,甜菜

    碱酯化物和酯化剂分离良好。因此 ,我们选用pH = 3 的 25 mmolP L 磷酸225 mmolP L 磷酸二氢钠缓冲溶

    液。

    3. 3 甜菜碱及其结构类似物的分离

    动物组织内存在甜菜碱的结构类似物 ......