酶催化动力学光度法测定汞

    柳畅先3

    吴美玉 吴士筠

    (中南民族学院化学系 ,武汉 430074)

    摘 要 基于醇脱氢酶催化乙醇和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的反应中 ,汞离子对于酶催化的抑制作用 ,通过测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸吸光度的变化率得出其酶促反应速度 ,对应于汞而制得标准曲线。检

    出限为0. 5μg L。讨论了pH值和共存离子对测定的影响。本方法具有快速、灵敏、干扰少的优点。

    关键词 汞 ,酶法 ,动力学光度法 ,乙醇 ,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

    2001204230收稿;2001209225接受

    本文系国家民族委员会自然科学基金“九五”重点项目

    1 引 言

    汞及其化合物属于剧毒物质,能在环境或动植物内蓄积 ,对人体健康产生长远的不良影响。天然水

    系中汞的污染来自于工业废水 ,因此汞是环境监测的一项重要指标。汞的分析方法主要有双硫腙光度

    法、冷原子吸收法 ,冷原子荧光法、伏安法、传感器法等1 ～4。双硫腙光度法操作步骤较复杂 ,灵敏度低 ,且受许多因素的影响 ,而冷原子吸收法和荧光法所用的仪器又比较昂贵。近年来酶法在分析测定方面

    得到了广泛的应用 ,该方法可测定在酶促反应中作为底物、辅酶、激活剂和抑制剂而存在的物质。用酶

    法测定汞已有报道5 ,6。

    本文基于醇脱氢酶(ADH)催化下列反应:

    乙醇 + NAD+

    乙醛 + NADH

    式中NAD+

    和NADH分别为氧化及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。汞离子的存在使醇脱氢酶的活

    性显著降低 ,所以NADH吸光度的变化率与抑制剂汞离子的浓度有关。无论抑制剂类型是属于竞争型

    抑制、非竞争型抑制或反竞争型抑制 ,抑制剂的浓度与酶促反应速度的倒数总是呈直线关系。因此可通

    过测定NADH吸光度的变化率得出其酶促反应速度 ,对应不同 Hg2 +

    浓度制得标准曲线 ,从而测出水样

    中汞离子含量。由于酶促反应的专属性 ,可以避免试样中众多共存组分的干扰。

    2 实验部分

    2. 1 仪器与试剂

    UV29100型分光光度计(深圳爱克分析仪器有限公司) ,光学读数分析天平(湘仪天平仪器厂) ,PHS 2

    3C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂) ,WH21型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂) 。

    汞标准储备液(100. 0 mg L) :称取 0. 1354 g氯化汞 ,溶解于(5 + 95)硝酸溶液中 ,加水定容为 1000

    mL。其它浓度标准液均用此溶液稀释。

    氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) :0. 05 mol L。三羟甲基氨基甲烷2盐酸缓冲溶液(Tris2HCl) :

    0105 mol L。醇脱氢酶(ADH) :10 g L (美国 Sigma 公司) 。

    212 实验方法

    于石英比色皿中加入3 mL 0. 05 mol L Tris2HCl 缓冲溶液 ,35μ L 17 mol L 乙醇溶液 ,50μ L 0. 1 mg L

    汞标准液以及40μ L 0. 05 mol L NAD+

    溶液后混匀 ,再加入10μ L 0. 1 g L ADH溶液 ,快速混匀后立即在

    所选定的波长处测定吸光度变化值(ΔA) , (每隔15 s读一次吸光度值 ,共读10次) 。计算反应速度( v) :

    v (μmol min) =

    ΔA ×反应液体积(mL)

    Δt (min) × ε(L mmol· cm) ×b (cm)

    动力学曲线见图1。

    根据在抑制剂作用下的米氏方程:

    第30卷

    2002年3月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第3期

    346～3481 v = k Hg 2 +

    + a

    k 和 a 在实验条件一定时为常数 ,因此由酶促反应速度可求出 Hg2 +

    的浓度。

    3 结果与讨论

    3. 1 NADH吸收光谱

    本方法是通过NADH吸光度的变化率测定反应速度 ,因此需进行NADH吸收波长实验 ,在无其它杂

    质干扰的情况下 ,可选择最大吸收波长 , 本实验选择 340 nm作为测定波长 ......