芯片式流通池顺序注射可更新

    表面反射光谱法用于酶反应检测

    王建雅 方肇伦3

    徐淑坤 (东北大学分析科学研究中心 , 沈阳 110004)

    摘 要 将芯片式流通池顺序注射可更新表面反射光谱法用于酶反应检测。HRP催化 H2O2 氧化 BPR底物

    的反应用于对 H2O2 的检测。此反应体系与葡萄糖氧化酶联用 ,用于对血清中葡萄糖的检测。

    关键词 芯片式流通池 ,顺序注射可更新表面 ,反射光谱 ,酶反应

    2001204220收稿;2001208210接受

    本文系教育部科学技术研究重点项目(No. 2000031)

    1 引 言

    将固体微珠做为试剂的载体, 通过流动注射或顺序注射系统将微珠注入检测系统并随后排废的流

    动注射可更新表面技术(FI 2RST ,flow injection renewable surface technique)是流动注射分析的前沿领域之

    一1

    ,该技术在痕量分析及生物分析中仍处于发展初期。具有可对微珠进行截留和排放功能的流通池

    是 FI - RST系统的关键部件 ,适合于不同检测方法的流通池已见报道2 ～7。本文提出了一种加工简便、结构简单的新型芯片式流通池 ,将其用于流动注射可更新表面反射光谱法检测。以过氧化物酶催化 ,显

    色的氢授体底物与 H2O2 反应的分光光度法检测 H2O2 已被广泛地用于生物分析中。近来文献报道了无

    偶联剂的偶氮萘酚衍生物8

    作为氢授体用于此类检测。本文将溴代邻苯三酚红( bromopyrogallol red ,BPR) 、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase , HRP) 、 H2O2 催化反应体系用于对 H2O2 的检测 ,并与葡萄

    糖氧化酶(glucose oxidase , GOD)催化体系联用 , 用于检测葡萄糖。

    2 实验部分

    2. 1 试剂

    辣根过氧化物酶(E. C. 1. 11. 1. 7 , 268 U mg , RZ > 3. 1 , Sigma) 。葡萄糖氧化酶(115 U mg , Toyobo

    Co. , Ltd . , Japan) 。血糖试剂盒(GLU Kit , 北京北化精细化学品公司) 。溴代邻苯三酚红(上海试剂三

    厂) 。Polysorb ACT 21 C218微珠(Transgenomic , Omaha , USA) , 微珠直径 20～60μm。实验中所用试剂均

    为分析纯 ,去离子水经脱气处理。

    2. 2 仪器

    顺序注射(SI)系统由ASD210注射泵(Bodenseewerk , Perkin2Elmer , Uberlingen , Germany)和 10 位选择

    阀(Valco , Houston , TX , USA)组成 ,配5 mL 针筒。选择阀和注射泵的操作由计算机同步控制。自制直

    径20 mm铜芯加热棒 ,30 W,XMT 2数显控温仪(CHNT Group Corporation ,China)控温 ±1. 0℃,加热棒密闭

    于套管中。722型光栅分光光度计(山东高密分析仪器厂) 。LM142164型记录仪(上海大华仪表厂) 。自

    制的芯片式流通池(详见文献9)通过一根多股双岔光纤与检测器相耦合 ,流通池固定在分光光度计的

    液槽室中。可更新反应表面的反射光在556 nm处检测。流通池采用3层组合结构 ,上层有机玻璃片上

    设出入孔 , 与内径0. 75 mm的聚四氟乙烯导管相接。中间层500μm厚的硅橡胶膜刻有宽 1. 8 mm流通

    池通道 ,通道中部嵌入孔径20μm的多孔滤层。多股双岔反射式光纤一臂将光源 556 nm入射光导至流

    通池中微珠所在检测区 ,另一臂将微珠表面反射光导至检测器。流通池与 SI系统用 25 cm长、 0. 7 mm

    i . d.的聚四氟乙烯管相连接。贮存管 HC直径 0. 96 mm ,长 150 cm ,体积为 1100μ L。废液贮存管 WHC

    直径0. 96 mm ,长56 cm ,体积为400μ L。多位阀与微珠悬浮液储瓶连接的管道直径为0. 7 mm ,长20 cm。

    第30卷

    2002年3月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第3期

    307～311 图1 流动注射可更新表面检测系统

    Fig. 1 Flow injection renewable surface assay system

    a. SI 2RST系统示意图( schematic diagram of the sequential injection2

    renewable surface technique (SI 2RST) system) 。C. 载流(H2O carrier) ;

    SP.泵( syringe pump ) ; HC. 贮存管 ( holding coil ) ; Heater. 加热棒

    (heating rod ) ; MPV. 多位阀 (multiposition valve ) ; VSP. 注入阀

    (syringe valve ) ; FC. 流通池 (microchip flow cell ) ; REC. 记录仪

    (recorder) ;L.卤素灯(light) ;D.检测器(detector) ; WHC.废液贮存

    管(waste holding coil) ; Bead. 微珠(2. 4 g L bead suspension) 。b. 样

    带顺序(schematic diagramof the sequence of zones in HCwhen step 12 of

    Table 1) Pho. 缓冲溶液 (phosphate buffer ) ; BHP. 试剂 (mixture of

    bromopyrogallol red (BPR) , horseradish peroxidase (HRP) and buffer) 。

    与其它试液储瓶间连接管道直径为 0. 5 mm。微

    珠悬浮液储瓶置于 45°倾角保持旋转以维持微珠

    的悬浮。

    2. 3 实验方法

    2. 3. 1 溶液的配制 HRP储备液40 U mL , GOD

    储备液 11. 5 U mL , BPR 储备液 2 ×10 - 4

    mol L ,均在 4 ℃冰箱中保存。H2O2 储备液以 KMnO4 标

    定 ,H2O2 溶液使用时新配。磷酸盐缓冲溶液配

    制:34. 0 g KH2PO4 溶于 500 mL H2O ,加入 90 mL

    0. 5 mol L KOH并调节至pH 6. 2。C218 微珠悬浮

    液的配制:先将微珠以少量乙醇润湿 ,然后加水稀

    释成2. 4 × 10 - 3

    g mL。

    2. 3. 2 SI 2RST检测系统及检测过程 SI 2RST检

    测系统结构见图 1a。SI 系统从流通池入口端将

    微珠悬浮液、试剂、试样等注入流通池 ,检测器实

    时监测微珠表面并记录。检测结束后 SI泵以反

    向流将微珠及废液从此端吸出流通池并排废。SI

    系统计算机控制程序见表 1。反应液吸入 HC中

    区带排列顺序见图 1b。检测过程中实时记录的

    吸光度2时间曲线见图 2。酶反应底物 BPR 在微

    珠表面的吸附线性范围的测定过程按表 1 进行 ,但省去6222步 ,加一步吸入BPR试样。

    表1 SI系统操作程序

    Table 1 Sequence of operation of the sequential injection system ......