研 究 报 告

    尼古丁对乳酸脱氢酶活性的影响

    甘震海 庄乾坤3

    张建勋 (北京大学化学学院 ,北京 100871) (河南新郑卷烟厂 ,新郑 451150)

    摘 要 用计时电流法成功地研究了尼古丁对乳酸脱氢酶活性的影响 ,测定了尼古丁存在与否时乳酸脱氢

    酶酶促反应的初速度 V0、酶促反应最大反应初速度 Vm 及米氏常数 Km。实验结果表明尼古丁对乳酸脱氢酶

    的活性有很大影响 ,但在高浓度的NADH存在下 ,尼古丁对乳酸脱氢酶活性的影响将得到大大降低。

    关键词 计时电流 ,乳酸脱氢酶 ,尼古丁 ,酶活性

    2001205230收稿;2001210208接受

    本文系国家自然科学基金(No. 20005001)和教育部回国人员启动基金资助项目

    1 引 言

    尼古丁又称烟碱,是烟草中含量最多的一种重要生物碱 ,对人体有强烈作用 ,是吸烟成瘾的物质基

    础。随着人类对吸烟与健康问题的日益关注 ,其含量大小及对人类健康的影响已成为烟草及其制品质

    量控制的重要指标。目前 ,其含量的测定已日益成熟1 ～3

    ,但有关尼古丁与酶的相互作用及其对酶活性

    的影响 ,国内外还未见报道。乳酸脱氢酶(LDH)广泛地存在于动物、植物和微生物中 ,是生物无氧呼吸

    中的一个关键酶 ,是所有生物均具有的产生能量的方式。本文用计时电流法成功地研究了尼古丁对乳

    酸脱氢酶活性的影响 ,结果表明尼古丁对乳酸脱氢酶的活性有很大影响 ,但在高浓度的 NADH存在下 ,尼古丁对乳酸脱氢酶活性的影响将得到大大降低。

    2 实验部分

    2. 1 仪器

    在 PAR273恒电位仪(美国 EGG公司)上应用M270 电化学分析系统对酶催化反应过程进行计时

    电流法实验 ,三电极系统采用玻碳电极为工作电极 ,铂丝和饱和甘汞电极分别为对电极和参比电极。每

    次实验前玻碳电极均用0. 3μm的Al2O3 抛光粉抛光 ,并用超声波清洗。实验溶液经高纯氮除氧15 min ,实验温度恒定为(25 ± 0. 5) ℃。

    2. 2 试剂

    乳酸脱氢酶(LDH ,兔肌肉中提取 ,美国 Sigma 公司) ,辅酶NADH和NAD+

    (纯度 98 % ,美国 Sigma 公

    司) ,烟碱(中国医疗公司北京采购供应站) 。其它试剂均为分析纯 ,实验溶液用石英亚沸重蒸三次水配

    制。

    3 结果与讨论

    3. 1 计时电流法测定LDH的活性

    LDH在辅酶NADH存在下催化丙酮酸转化为乳酸 ,酶促反应式如下:

    CH3COCOO-

    + NADH + H+ LDH

    CH3CH(OH) COO-

    + NAD+

    在0. 05 molP L 的 Tris2HCl 缓冲溶液中 ,NADH循环伏安曲线中NADH的氧化电位约为 + 0. 55 V ,因而在

    计时电流实验中保持电极电位跃迁在 0～ + 0. 8 V ,以保证电极表面的 NADH能完全被氧化 ,电流处于

    极限范围4。稳态搅拌的酶催化反应体系中 ,当计时电流达到稳态后 ,在时间 t0 时加入LDH ,酶促反应

    第30卷

    2002年4月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第4期

    385～387立即启动(图1箭头所示) ,本体溶液中的NADH迅速被氧化 ,浓度减小 ,相应的极限电流降低 ,记录该电

    流- 时间曲线即得“酶催化反应过程曲线” (如图 1) 。由于溶液体系处于稳态搅拌状态 ,加入的酶会迅

    速分散到溶液中 ,酶促反应立即以最大初速度开始 ,无时间延迟。反应开始后在极短的时间内( t - t0 ) ,NADH被氧化的量与时间 t 成正比 ,NADH浓度随时间线性降低 ,电流也随时间线性衰减。利用起始线

    性部分的斜率来计算时间( t - t0 )内NADH浓度变化速度 ,从而可得反应初速度 V0 :

    V0 = - (d ct ,NADHP d t) t = 0 ≈- ( ct ,NADH - c0 )P ( t - t0 ) = c0 (1 - itP i0 ) ( t - t0 )

    酶催化反应开始前 ,体系中已加入已知浓度的NADH溶液 ,初始浓度为 c0 ,实际上成为定量测定 NADH

    图1 酶催化反应中NADH的计时电流曲线

    Fig. 1 Chronoamperometric curve of nicotinamide adenine

    dinucleotide (NADH)

    0. 5 mmolP L 丙酮酸+ 0. 1 mmolP L NADH在50 mmolP L Tris缓冲

    液(pH 7. 5)中,加1. 9μg LHD启动酶催化反应,最后总体积为

    5 mL (0. 5 mmolP L pyruvlc acid + 0. 1 mmolP L NADH in 50 mmolP L

    Tris2HCl buffer (pH 7. 5) ,total volume is 5 mL , adding 1. 9μg LHD

    to start the reaction) ......