亮黄2曲通 X 2100体系共振瑞利散射法测定蛋白质

    冯宁川3 3

    龚国权3

    (兰州大学化学化工学院 ,兰州 730000)

    摘 要 基于在 Triton X 2100存在下 ,蛋白质对有机染料亮黄瑞利光散射的增强作用 ,拟定了测定蛋白质的瑞

    利光散射法。由于添加了 Triton X 2100 ,对不同的蛋白质 ,测定的灵敏度提高了5～11. 8倍 ,线性范围在0～5. 0

    mgP L 之间 ,最低检测限为10. 2μgP L。

    关键词 曲通 X 2100 ,亮黄 ,蛋白质 ,瑞利光散射

    2001205212收稿;2001209223接受

    本文系甘肃省自然科学基金资助项目(ZS9912A2520012Z)

    3 3宁夏医学院化学教研室

    1 引 言

    近年来 ,运用散射光技术对核酸和蛋白质等生物大分子进行定量测定的研究已有许多报道[1～4 ]。

    但以表面活性剂作增敏剂 ,用于散射光法测定蛋白质 ,尚未见报道。实验发现 ,蛋白质对亮黄散射光的

    提高作用 ,非离子表面活性剂 Triton X2100有显著的增敏效应。据此 ,我们研究了亮黄2蛋白质2Triton X2

    100体系的反应条件及共存物质的影响 ,拟定了测定蛋白质的新散射光法。

    2 实验部分

    2. 1 仪器与试剂

    RF2540型荧光分光光度计(日本岛津公司) ,SPM210A数字酸度计(浙江萧山仪器标准件厂) 。

    牛血清白蛋白(BSA) 、人血清白蛋白(HAS) (北京百泰生化技术公司) ,人血丙种球蛋白(γ 2G) 、牛血

    红蛋白(Hb) (中科院上海生化研究所) 。将上述蛋白质配成0. 5 gP L 水溶液 ,置于1～4 ℃冰箱中 ,使用时

    稀释为10 mgP L 工作溶液。亮黄(brilliant yellow , BY) (北京化学试剂研究所) ,0. 01 %水溶液;Triton X2100

    (上海化学试剂公司) ,0. 1 %( VP V) 水溶液。其它试剂均为分析纯 ,实验用水为二次去离子水。用

    Britton2Robison(BR)缓冲溶液控制溶液的pH值。

    2. 2 实验方法

    在10 mL 比色管中依次加入0. 5 mL 亮黄溶液 ,2. 0 mL pH 2. 5的BR缓冲溶液 ,一定量的蛋白质或

    样品溶液 ,1. 2 mL Triton X 2100 溶液 ,加水定容 ,摇匀。30 min 后 ,在荧光分光光度计上以激发波长λex等

    于发射波长λem同步扫瞄 ,得体系散射光谱。定量测定时 ,固定λex =λem = 495 nm ,测定体系散射光强度

    I。测定条件:灵敏高度 ,纵坐标 × 1 ,狭缝5 nm。

    3 结果与讨论

    3. 1 散射光谱特征

    按实验方法制备试液和空白溶液(其中各有一份不加 Triton X2100) ,同步扫描激发与发射波长得体

    系瑞利光散射(RLS)光谱 ,结果如图1所示。可见 ,Triton X2100的加入对空白溶液的散射强度几乎没有

    影响 ,但显著地提高了测定体系的散射强度。最大散射峰位于 495 nm。从图中还可看出 ,散射强度的

    提高随BSA浓度的增大而增强。

    3. 2 反应时间和稳定性

    亮黄2BSA2Triton X2100体系的反应在室温下需30 min ,散射强度在3 h内稳定不变。

    3. 3 酸度的影响

    实验了pH对体系散射强度的影响。pH在2～3范围内相对散射强度ΔI 值达到最大且保持稳定。

    第30卷

    2002年4月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第4期

    425～427

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 图1 散射光谱

    Fig. 1 Rayleigh light scattering spectra

    1. Brilliant yellow (BY) ; 2. BY+ Triton X 2100 ;

    3. BY + bovine serum albumin (BSA) ( 2. 0

    mgP L) ;4. BY+ BSA(1. 5mgP L) + Triton X 2100 ;

    5. BY + BSA ( 2. 0 mgP L) + Triton X 2100 ; pH

    215 , BY: 0. 005 % , Triton X 2100 : 0. 012 %。

    实验选择pH 2. 5的BR缓冲溶液控制溶液的酸度。

    3. 4 亮黄浓度的影响

    亮黄浓度影响测定的灵敏度和线性范围。表 1 列出了亮黄

    在不同浓度下 ,测定BSA 的标准回归方程。可见 ,随亮黄浓度增

    加 ,标准曲线的线性范围变宽 ,灵敏度(标准回归方程的斜率)下

    降 ......