纳米羟基磷灰石修复鼠下颌骨缺损
An experimental study on reconstruction of rat mandibular bone defects with nanohydroxyapatite
DONG QingShan, LI ZuBing, WANG HuZhong, GUO JiaPing
1Department of Stomatology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Command, Wuhan 430070, China, 2Department of Maxillofacial Surgery, College of Stomatatology, Wuhan University, Wuhan 430079, China
【Abstract】 AIM: To compare the osteogenic ability between hydroxyapatite (HA) and nanoHA in repairing mandibular bone defect and to investigate the advantage of using nanoHA. METHODS: Seventyfive adult SD rats were randomly assigned to five experimental groups, with 15 in each group. After a 4.0 mm×2.5 mm rectangular bone defect was produced at the bottom line of the mandibular, 4.0 mm×2.5 mm×1.5 mm nanoHA or HA was respectively used to repair the bone defect area. A control group was set up simultaneously. The animals were killed at 1, 2, 3, 4 and 8 weeks respectively after the operation and the specimens were obtained for macromorphological observation, light microscopic (LM) and immunohistochemical (TGFβ1) examination. The quantitative and statistical analyses were performed for the immunohistochemical results. RESULTS: Macromorphologic observation showed that the calluses of the bony defect area in nanoHA group were presented earlier and thicker than those in ordinary HA group. Under LM observation, active proliferation of osteocytes could be seen in the nanoHA group. Newly fibrous bone appeared at the first week, with slight inflammation reaction. Although there were also active proliferations of osteocytes in the ordinary HA group, inflammation reaction was more obvious and prolonged for as long as three weeks. Immunohistochemical examination showed that the TGFβ1 expression was located in osteoblasts, newly developed cartilage matrix of original calluses, mononuclear macrophage, multinuclear macrophage and interstitial cells of the granular tissue. At each experiment phase, nanoHA group showed a higher TGFβ1 expression than that in ordinary HA group and the TGFβ1 expression of both nanoHA group and HA group was higher than that in control group. CONCLUSION: HA is an ideal material for the reconstruction of mandibular bone defects. NanoHA is superior to ordinary HA in its biocompatibility and osteogenesis.
【Keywords】 mandibular defect; nanohydroxyapatite; immunohistochemistry
【摘要】 目的: 比较纳米羟基磷灰石(nanoHA)和HA修复下颌骨缺损的成骨能力，探讨nanoHA材料的优越性. 方法: 选择SD大鼠75只，随机分1, 2, 3, 4, 8 wk共5个时间段，每时间段15只，对大鼠下颌骨下缘作一4.0 mm×2.5 mm的矩形骨缺损区，分别用大小为1.5 mm×2.5 mm×4.0 mm的nanoHA材料、HA材料修复缺损区，另设一组空白对照组. 分期取出缺损区骨组织，进行肉眼观察、光镜和免疫组化(TGFβ1)检测，最后对免疫组化检测结果量化并进行统计学分析. 结果: 大体观察见nanoHA修复组缺损区骨痂出现早而厚. 光镜见nanoHA组骨细胞增生活跃，1 wk有新生骨形成，炎症反应轻；HA组骨修复细胞较活跃，炎症反应较明显，且术后3 wk才逐渐消退. 免疫组化结果显示：在原始骨痂中的成骨细胞、骨端骨细胞、新生成的软骨基质，以及肉芽组织中的单核巨噬细胞、多核巨噬细胞和间质细胞中均可见TGFβ1的表达. nanoHA组TGFβ1的表达值在各时间段均大于HA组，两者均大于空白对照组. 结论: nanoHA是修复骨缺损较理想的生物材料，nanoHA在生物相容性、促进骨修复再生等方面均优于普通HA.
【关键词】 下颌骨缺损； 纳米羟基磷灰石；免疫组化
0引言
临床上由于创伤、感染、肿瘤切除及发育异常等造成的颌骨缺损较常见，目前尽管有多种修复方法，但都有各自的缺陷. 自体骨移植成功率高、修复效果好，但受自身供体有限性的限制，且会增加手术创伤和风险，常不为患者接受；异体骨移植主要存在抗原性问题，且有传播疾病的潜在危险；而各种以金属、陶瓷或高分子制造的人工骨替代材料已用于临床，但也存在金属腐蚀性和材料机械性能等缺陷. 许多研究者已经认识到，研究的关键在于寻求与人体组织结构、生理功能等相近似的生物材料，使植入体与人体组织不仅有良好的生物相容性，而且能够与机体骨组织间形成骨性结合，植入材料能够长期发挥相应的生理功能. 近20余年的研究发现，羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)作为植入材料具有良好的生物相容性和骨传导性. 而纳米羟基磷灰石(nanohydroxyapatite，nanoHA)除了有普通HA材料的优越性外，还有以下优点：①nanoHA微结构类似于天然骨基质，可以被骨组织直接利用；②nanoHA与天然骨内无机矿物有相近的尺寸，更有助于人体细胞和大分子对其的识别，从而可提高材料的生物活性、利用度和生物相容性； ③释放的钙、磷等离子可能有更多的成分参与骨代谢，更好地促进骨形成；④有研究表明，nanoHA低结晶度和含碳酸根特征，使之本身便具有与骨键合的能力，用这种材料制成的骨植体表面可提供适宜的环境促进胶原和矿物的沉积以及成骨细胞的黏附[1]；⑤nanoHA也是一种可降解材料.
我们选择nanoHA作为下颌骨缺损修复材料，从组织形态学及免疫组化(TGFβ1)等方面观察骨缺损修复情况，初步研究该材料在动物体内组织反应过程，比较nanoHA与HA的优劣，为进一步探讨其性能、剂型和临床应用提供实验依据.
1材料和方法
1.1材料
健康成年雄性Wistar SD大鼠75只(湖北省医学科学院动物实验中心提供)，体质量300~400 g，随机分为A，B，C，D和E五个时间段，每个时间段15只，每个时间段均分nanoHA组、HA组和空白对照组，随机分配每组5只，分别于术后1，2，3，4和8 wk取15只检测. 微小颗粒状HA由武汉理工大学生物材料研究中心提供，颗粒大小1~2 μm. nanoHA由武汉大学口腔医学院口腔药物材料厂制作，颗粒大小20~80 nm. 两种HA均由华中科技大学材料系压模成圆盘状，厚约1.5 mm，再自行用刀片切割成1.5 mm×2.5 mm×4.0 mm方块. 压模后，nanoHA呈淡黄白色，HA呈雪白色. 材料在术前均用环氧乙烷消毒备用. 免疫组化选用羊抗兔IgG的mAb TGFβ1；SABC过氧化物酶免疫监测试剂盒；DAB显色试剂盒. 以上试剂均由武汉博士德生物工程有限公司提供.
1.2方法
实验动物用4 g/L戊巴比妥钠(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉，固定于手术板，术区备皮，沿下颌骨下缘划定位切口线，长约2.0 cm，活力碘消毒，切开皮肤、皮下、肌层，分离至下颌骨，将颊舌侧肌骨膜剥开，暴露下颌骨体部和下颌角. 用微型牙科电机、裂钻在下颌骨下缘造成4.0 mm×2.5 mm矩形缺损，将实验材料轻放于缺损区，肌骨膜层复位、缝合固定材料，再分别缝合皮下、皮肤. 空白对照组骨缺损区不放任何材料，伤口直接分层缝合. 术后伤口敞开不包扎，也未用抗生素，同术前喂养方法笼养. 分别于术后1,2,3,4和8 wk处死动物，即刻沿原切口分离至实验区，轻剥离周边肌肉，弃除松动的整块植入材料，沿缺损区外5 mm切断下颌骨. 将实验骨组织和新生肉芽组织一起取出固定于40 g/L甲醛液中. 再用100 mL/L硝酸脱钙24 h，经梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋，作3 μm厚切片，常规HE染色. 用羊抗兔IgG的mAb TGFβ1作一抗制片、染色.
用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统测定TGFβ1着色部位和程度，并进行量化和分析. 整套图像分析系统包括配有摄像装置的显微镜及与电子计算机相连的图像显示设备，选用免疫组化染色切片(每个时间段每种材料3张切片)置于光镜下，每张切片随机选4个测定区，测定TGFβ1阳性着色值，取12个测定区的均值作数据，计算机软件进行自动数据处理和统计学分析.
大体(肉眼)观察：动物生存情况、精神状态、活动能力、伤口情况以及缺损区解剖所见；普通光镜观察：对各组光镜下组织炎症反应、骨细胞增殖和修复等情况作描述性比较；免疫组化观察：检测缺损区骨组织TGFβ1表达情况，并作定量统计分析.
统计学处理：定量数据采用非参检验分析方法(SAS统计分析软件).
2结果
2.1大体观察所有实验动物有1例(术后1 wk组中的HA组)死亡，2例伤口感染(分别为术后1 wk组中的空白组和术后2 wk组中的HA组)，其余均成活，伤口一期愈合，动物精神状态和进食均正常.
取材时解剖所见：1 wk时，植入材料均固定良好，无溶解、吸收，周边软组织轻度瘢痕；空白组缺损区为新鲜肉芽组织填充. 2 wk时，nanoHA组织块完整未吸收，周边软组织松散包绕；HA组织块部分溶解分散，周边软组织质地偏硬；空白组缺损区为瘢痕组织较明显. 3 wk时，nanoHA组织块仍完整未吸收，周边软组织增厚变硬；HA组织块更多溶解、分散，周边软组织增厚明显，其间可见散布HA颗粒；空白组缺损区为稍硬瘢痕组织充填. 4 wk时，nanoHA组织块完整，周边纤维组织包裹更严密，可见纤维骨痂；HA组织块颗粒溶解分散，有吸收现象，软组织瘢痕较重；空白组缺损区瘢痕逐渐变硬. 8 wk时，nanoHA组织块表面有虫蚀样吸收，周边纤维组织与其黏连固定，已部分骨化；HA组织块大部分溶解、不规则吸收，周边纤维组织较硬，有轻度骨化；空白组缺损区未见明显骨化组织.
2.2光镜下组织形态学观察术后1 wk：HA组可见缺损区有少量新生骨痂形成，骨小梁边缘可见核深染的、增生的骨母细胞，还有增生的肉芽和纤维组织，周边有较明显炎性反应；nanoHA组可见新生编织骨小梁较多，活跃增生的骨细胞和骨母细胞，缺损区内炎性肉芽组织较少，周边炎细胞不明显(Fig 1)；空白组可见缺损区有出血、炎性肉芽组织和死骨片，也有极少量的新生骨痂，边缘也有增生的骨细胞.
术后2 wk：HA组可见新生骨小梁增多、活跃，骨母细胞多见，炎性反应减轻；nanoHA组可见有编织状骨小梁，骨细胞增生活跃，炎细胞较少；空白组可见仍为少量增生骨细胞.
术后3 wk：HA组可见有增生骨小梁多见，陈旧及新生骨小梁混合存在，炎细胞浸润不明显，有泡沫细胞及含铁血黄素巨噬聚集，肉芽组织增生明显(Fig 2)；nanoHA组可见骨小梁较成熟和新生骨小梁，有软骨化骨在骨痂内出现，间质炎症反应轻；空白组可见骨小梁较成熟，伴有肉芽组织增生，间质有少量炎细胞浸润.
术后4 wk：HA组可见新生骨小梁较为致密，开始出现骨改建，间质炎细胞反应较轻，邻近软组织内纤维母细胞增生明显；nanoHA组可见人工植入材料被纤维组织包绕，新生骨小梁明显，间质炎细胞较少，部分区域出现破骨细胞吸收死骨(Fig 3)；空白组可见有新生骨小梁，开始出现骨髓腔，少量炎细胞.
术后8 wk：HA组可见新生骨小梁较为成熟，融合成片，炎细胞反应基本消失，有骨髓腔出现；nanoHA组可见新生编织骨较成熟，有骨髓腔出现，与正常骨有融合、修复现象，无炎细胞浸润；空白组可见骨小梁大部分成熟，骨髓腔出现.
2.3TGFβ1免疫组化结果术后所有组均可见TGFβ1着色于成骨细胞、新生成的骨细胞胞质和骨间纤维细胞内，尤其是邻近缺损区骨质. 肉芽组织中也可见阳性着色. 早期阳性着色较明显，以后呈下降趋势，4 wk时肉芽组织中TGFβ1表达明显减少，而骨细胞中的TGFβ1表达仍存在，8 wk时nanoHA组TGFβ1表达值仍较高，另两组明显减弱(Fig 4～6).
2.4免疫组化图像量化统计分析结果见Tab 1.表1各时间段TGFβ1表达定量值(略)
3讨论
HA分子式为Ca10(PO4)6(OH)2，一般为白色砂粒状，自然界和人工合成的HA晶体组分与人体骨的无机质成分和结构均类似. HA作为骨修复材料具有良好的生物相容性，植入机体后能与组织的细胞膜表面的多糖和糖蛋白等通过氢键结合，最终形成骨性结合. 通常nanoHA是指颗粒处于1～100 nm大小的HA，而人体内生物矿化的HA是平均大小为50 nm×25 nm,厚度为2～3 nm的纳米级结构[2]. 从仿生角度讲，如果合成的nanoHA 在组成、晶体结构、结晶率及形状等方面与人体内生物矿化的HA更接近的话，就有更佳的骨结合性. 它为机体细胞提供的微环境使骨系细胞黏附、增殖功能得以充分发挥. 因此nanoHA颇为生物材料界关注. 本实验中nanoHA颗粒大小约20～80 nm，具有纳米材料的基本性能，在生物相容性等方面已初步显示出较HA的优越性，前者植入早期即少见炎性细胞，未见异物巨细胞和排斥反应的发生，后者术区早期炎症细胞较明显，2～3 wk才逐渐消退.
HA本身不含人体需要的生物活性成分，没有骨诱导性，只有骨引导性. 本实验发现早期骨缺损周边成骨细胞生长活跃，并随时间推移逐渐加强，伴随新生血管长入、炎性反应和材料的溶解反应，至3 wk时有编织骨形成，8 wk时新生骨成熟、矿化. nanoHA植骨块区周边表现出骨细胞生长开始于术后1和2 wk时即见编织骨形成，8 wk时骨矿化更明显，尚未见明显改建. Lewandrowski等[3]用nanoHA和小颗粒HA修复鼠胫骨缺损实验中，也发现术后3 wk时，材料的生物相容性和骨融合情况，纳米组最强，骨形成更明显，空白组最少. 分析认为纳米材料改善了自身和骨组织的生物活性，更合理地为骨细胞等生长提供传导通道，促使骨生长加速.
除了上述生物活性和优异的骨传导性能外，nanoHA也是一种生物可降解材料，一般认为HA的溶解、吸收有两种途径[1，4]：①体液介导的溶解过程，即HA溶于体液中；②细胞介导的吸收过程，即细胞的吞噬作用. HA生物降解率和降解量取决于其基本的物理、化学性质和机体内环境. 小颗粒者相对的比表面积大，比大颗粒者降解快；颗粒疏松者比致密者降解快；多孔型比无孔型降解快. 本实验中HA植块早期即有溶解、弥散现象，后期溶解、吸收现象较nanoHA更明显. 弥散颗粒进入缺损区纤维组织和骨组织内，光镜检查发现有异物巨细胞反应. 而nanoHA植骨块基本保持完整，说明材料剂型有待改进. 4 wk和8 wk组发现材料表面有散在虫蚀样孔隙，可能是材料被溶解和吸收.
骨缺损修复是一个复杂的骨再生过程，其组织学过程伴随着复杂的生物学调节机制，大量的细胞因子在不同的骨损伤修复阶段发挥不同的作用，调控骨再生. 目前的研究证实与骨折修复有密切关系的调节因子有：骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子β(TGFβ)和成纤维细胞生长因子(FGF)等. TGFβ属损伤局部产生的内源性细胞调节因子，主要功能是使软骨骨原细胞分化成熟，转化为软骨细胞和成骨细胞，并促进骨基质蛋白的合成、加速软骨内化骨过程. 而有关nanoHA修复骨缺损相关的TGFβ表达等方面研究报道较少. 本实验发现TGFβ1的表达分布在原始骨痂中的成骨细胞、骨端骨细胞、新生成的软骨基质中，以及肉芽组织中的单核巨噬细胞、多核巨噬细胞和间质细胞中. 术后1 wk时，以上骨细胞和肉芽组织TGFβ1均有较多表达，且呈上升趋势，2 wk有所下降，3 wk时又有上升，4 wk时肉芽组织中TGFβ1表达明显减少，而骨细胞中的TGFβ1表达仍存在. 此结果与文献报道有所差别，主要表现在TGFβ1表达出现较早，1～4 wk又有波动，而有文献报道TGFβ1表达高峰在2～3 wk左右，4 wk下降到较低水平[5]. 分析可能有几个原因：① 骨缺损实验与骨折实验形成的骨痂可能有差别；② 实验动物有差别；③ TGFβ1属损伤局部产生的内源性细胞调节因子，缺损区损伤较大，早期主要产生内源性TGFβ1较多；④ 3 wk时表达值又升高，可能是外源性因素开始起作用，即远距离相关细胞产生的TGFβ1通过“内分泌”的形式作用于骨再生局部细胞. 分析不同实验材料组发现，nanoHA组TGFβ1术后1 wk骨端细胞和肉芽组织中已表达到高峰，一直维持到术后8 wk仍有较高水平. HA组和空白组TGFβ1表达值1 wk时较高，以后呈减弱趋势，8 wk降至较低水平. 本实验也证实nanoHA较HA更能促进骨生长因子的表达，维持时限长，也间接说明了骨修复能力的差异，而普通组又较空白组有更强的骨修复能力.
【参考文献】
[1] 冯庆玲，崔福斋，张伟. 纳米羟基磷灰石/胶原骨修复材料[J]. 中国医学科学院学报，2002；24(2)：124-128.
Feng QL, Cui FZ, Zhang W. Nanohydroxyapatite/collagen composite for bone repair[J]. Acta Acad Med Sin , 2002；24(2)：124-128.
[2] Gibson IR, Ke S, Best SM, et al. Effect of powder characteristics on the sinterability of hydroxyapatite powders[J]. J Mater Sci Mater Med, 2001;12(2):163-171.
[3] Lewandrowski KU, Bondre SP, Wise DL, et al. Enhanced bioactivity of a poly (propylene fumarate) bone graft substitute by augmentation with nanohydro xyapatite[J]. Biomed Mater Eng，2003；13(2):115-124.
[4] 杨团民，刘淼，杨爱玲,等. 生物可吸收固定材料对实验性骨折愈合影响的超微结构观察[J]. 第四军医大学学报，2004；25(1)：8-11.
Yang TM, Liu M, Yang AL,et al. Ultrastructural observing the effect of bioabsorbable material internal fixation experimental fracture healing[J]. J Fourth Mil Med Uinv，2004；25(1)：8-11.
[5] 张永刚，卢世壁，王继芳,等. 骨形态发生蛋白和转化生长因子β及碱性成纤维细胞生长因子在骨折修复中的表达[J]. 中华创伤杂志，2000；16(3)：170-173.
Zhang YG, Lu SB, Wang JF,et al. Experimental study of expression of BMP, TGFβ and bFGF in fracture healing[J]. Chin J Traumatol, 2000；16(3)：170-173.
通讯作者：李祖兵. Tel.(027)87646313 Email.Lizubing@sina.com
作者简介：董青山(1971)，男(汉族)，湖北省武穴市人. 硕士，主治医师. Tel.(027)68878714Email.dqsdentist.@sina.com
(1广州军区武汉总医院口腔科，湖北 武汉 430070，2武汉大学口腔医学院口腔颌面外科，湖北 武汉 430079)
编辑袁天峰, 百拇医药(董青山，李祖兵，王虎中，郭家平)
DONG QingShan, LI ZuBing, WANG HuZhong, GUO JiaPing
1Department of Stomatology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Command, Wuhan 430070, China, 2Department of Maxillofacial Surgery, College of Stomatatology, Wuhan University, Wuhan 430079, China
【Abstract】 AIM: To compare the osteogenic ability between hydroxyapatite (HA) and nanoHA in repairing mandibular bone defect and to investigate the advantage of using nanoHA. METHODS: Seventyfive adult SD rats were randomly assigned to five experimental groups, with 15 in each group. After a 4.0 mm×2.5 mm rectangular bone defect was produced at the bottom line of the mandibular, 4.0 mm×2.5 mm×1.5 mm nanoHA or HA was respectively used to repair the bone defect area. A control group was set up simultaneously. The animals were killed at 1, 2, 3, 4 and 8 weeks respectively after the operation and the specimens were obtained for macromorphological observation, light microscopic (LM) and immunohistochemical (TGFβ1) examination. The quantitative and statistical analyses were performed for the immunohistochemical results. RESULTS: Macromorphologic observation showed that the calluses of the bony defect area in nanoHA group were presented earlier and thicker than those in ordinary HA group. Under LM observation, active proliferation of osteocytes could be seen in the nanoHA group. Newly fibrous bone appeared at the first week, with slight inflammation reaction. Although there were also active proliferations of osteocytes in the ordinary HA group, inflammation reaction was more obvious and prolonged for as long as three weeks. Immunohistochemical examination showed that the TGFβ1 expression was located in osteoblasts, newly developed cartilage matrix of original calluses, mononuclear macrophage, multinuclear macrophage and interstitial cells of the granular tissue. At each experiment phase, nanoHA group showed a higher TGFβ1 expression than that in ordinary HA group and the TGFβ1 expression of both nanoHA group and HA group was higher than that in control group. CONCLUSION: HA is an ideal material for the reconstruction of mandibular bone defects. NanoHA is superior to ordinary HA in its biocompatibility and osteogenesis.
【Keywords】 mandibular defect; nanohydroxyapatite; immunohistochemistry
【摘要】 目的: 比较纳米羟基磷灰石(nanoHA)和HA修复下颌骨缺损的成骨能力，探讨nanoHA材料的优越性. 方法: 选择SD大鼠75只，随机分1, 2, 3, 4, 8 wk共5个时间段，每时间段15只，对大鼠下颌骨下缘作一4.0 mm×2.5 mm的矩形骨缺损区，分别用大小为1.5 mm×2.5 mm×4.0 mm的nanoHA材料、HA材料修复缺损区，另设一组空白对照组. 分期取出缺损区骨组织，进行肉眼观察、光镜和免疫组化(TGFβ1)检测，最后对免疫组化检测结果量化并进行统计学分析. 结果: 大体观察见nanoHA修复组缺损区骨痂出现早而厚. 光镜见nanoHA组骨细胞增生活跃，1 wk有新生骨形成，炎症反应轻；HA组骨修复细胞较活跃，炎症反应较明显，且术后3 wk才逐渐消退. 免疫组化结果显示：在原始骨痂中的成骨细胞、骨端骨细胞、新生成的软骨基质，以及肉芽组织中的单核巨噬细胞、多核巨噬细胞和间质细胞中均可见TGFβ1的表达. nanoHA组TGFβ1的表达值在各时间段均大于HA组，两者均大于空白对照组. 结论: nanoHA是修复骨缺损较理想的生物材料，nanoHA在生物相容性、促进骨修复再生等方面均优于普通HA.
【关键词】 下颌骨缺损； 纳米羟基磷灰石；免疫组化
0引言
临床上由于创伤、感染、肿瘤切除及发育异常等造成的颌骨缺损较常见，目前尽管有多种修复方法，但都有各自的缺陷. 自体骨移植成功率高、修复效果好，但受自身供体有限性的限制，且会增加手术创伤和风险，常不为患者接受；异体骨移植主要存在抗原性问题，且有传播疾病的潜在危险；而各种以金属、陶瓷或高分子制造的人工骨替代材料已用于临床，但也存在金属腐蚀性和材料机械性能等缺陷. 许多研究者已经认识到，研究的关键在于寻求与人体组织结构、生理功能等相近似的生物材料，使植入体与人体组织不仅有良好的生物相容性，而且能够与机体骨组织间形成骨性结合，植入材料能够长期发挥相应的生理功能. 近20余年的研究发现，羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)作为植入材料具有良好的生物相容性和骨传导性. 而纳米羟基磷灰石(nanohydroxyapatite，nanoHA)除了有普通HA材料的优越性外，还有以下优点：①nanoHA微结构类似于天然骨基质，可以被骨组织直接利用；②nanoHA与天然骨内无机矿物有相近的尺寸，更有助于人体细胞和大分子对其的识别，从而可提高材料的生物活性、利用度和生物相容性； ③释放的钙、磷等离子可能有更多的成分参与骨代谢，更好地促进骨形成；④有研究表明，nanoHA低结晶度和含碳酸根特征，使之本身便具有与骨键合的能力，用这种材料制成的骨植体表面可提供适宜的环境促进胶原和矿物的沉积以及成骨细胞的黏附[1]；⑤nanoHA也是一种可降解材料.
我们选择nanoHA作为下颌骨缺损修复材料，从组织形态学及免疫组化(TGFβ1)等方面观察骨缺损修复情况，初步研究该材料在动物体内组织反应过程，比较nanoHA与HA的优劣，为进一步探讨其性能、剂型和临床应用提供实验依据.
1材料和方法
1.1材料
健康成年雄性Wistar SD大鼠75只(湖北省医学科学院动物实验中心提供)，体质量300~400 g，随机分为A，B，C，D和E五个时间段，每个时间段15只，每个时间段均分nanoHA组、HA组和空白对照组，随机分配每组5只，分别于术后1，2，3，4和8 wk取15只检测. 微小颗粒状HA由武汉理工大学生物材料研究中心提供，颗粒大小1~2 μm. nanoHA由武汉大学口腔医学院口腔药物材料厂制作，颗粒大小20~80 nm. 两种HA均由华中科技大学材料系压模成圆盘状，厚约1.5 mm，再自行用刀片切割成1.5 mm×2.5 mm×4.0 mm方块. 压模后，nanoHA呈淡黄白色，HA呈雪白色. 材料在术前均用环氧乙烷消毒备用. 免疫组化选用羊抗兔IgG的mAb TGFβ1；SABC过氧化物酶免疫监测试剂盒；DAB显色试剂盒. 以上试剂均由武汉博士德生物工程有限公司提供.
1.2方法
实验动物用4 g/L戊巴比妥钠(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉，固定于手术板，术区备皮，沿下颌骨下缘划定位切口线，长约2.0 cm，活力碘消毒，切开皮肤、皮下、肌层，分离至下颌骨，将颊舌侧肌骨膜剥开，暴露下颌骨体部和下颌角. 用微型牙科电机、裂钻在下颌骨下缘造成4.0 mm×2.5 mm矩形缺损，将实验材料轻放于缺损区，肌骨膜层复位、缝合固定材料，再分别缝合皮下、皮肤. 空白对照组骨缺损区不放任何材料，伤口直接分层缝合. 术后伤口敞开不包扎，也未用抗生素，同术前喂养方法笼养. 分别于术后1,2,3,4和8 wk处死动物，即刻沿原切口分离至实验区，轻剥离周边肌肉，弃除松动的整块植入材料，沿缺损区外5 mm切断下颌骨. 将实验骨组织和新生肉芽组织一起取出固定于40 g/L甲醛液中. 再用100 mL/L硝酸脱钙24 h，经梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋，作3 μm厚切片，常规HE染色. 用羊抗兔IgG的mAb TGFβ1作一抗制片、染色.
用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统测定TGFβ1着色部位和程度，并进行量化和分析. 整套图像分析系统包括配有摄像装置的显微镜及与电子计算机相连的图像显示设备，选用免疫组化染色切片(每个时间段每种材料3张切片)置于光镜下，每张切片随机选4个测定区，测定TGFβ1阳性着色值，取12个测定区的均值作数据，计算机软件进行自动数据处理和统计学分析.
大体(肉眼)观察：动物生存情况、精神状态、活动能力、伤口情况以及缺损区解剖所见；普通光镜观察：对各组光镜下组织炎症反应、骨细胞增殖和修复等情况作描述性比较；免疫组化观察：检测缺损区骨组织TGFβ1表达情况，并作定量统计分析.
统计学处理：定量数据采用非参检验分析方法(SAS统计分析软件).
2结果
2.1大体观察所有实验动物有1例(术后1 wk组中的HA组)死亡，2例伤口感染(分别为术后1 wk组中的空白组和术后2 wk组中的HA组)，其余均成活，伤口一期愈合，动物精神状态和进食均正常.
取材时解剖所见：1 wk时，植入材料均固定良好，无溶解、吸收，周边软组织轻度瘢痕；空白组缺损区为新鲜肉芽组织填充. 2 wk时，nanoHA组织块完整未吸收，周边软组织松散包绕；HA组织块部分溶解分散，周边软组织质地偏硬；空白组缺损区为瘢痕组织较明显. 3 wk时，nanoHA组织块仍完整未吸收，周边软组织增厚变硬；HA组织块更多溶解、分散，周边软组织增厚明显，其间可见散布HA颗粒；空白组缺损区为稍硬瘢痕组织充填. 4 wk时，nanoHA组织块完整，周边纤维组织包裹更严密，可见纤维骨痂；HA组织块颗粒溶解分散，有吸收现象，软组织瘢痕较重；空白组缺损区瘢痕逐渐变硬. 8 wk时，nanoHA组织块表面有虫蚀样吸收，周边纤维组织与其黏连固定，已部分骨化；HA组织块大部分溶解、不规则吸收，周边纤维组织较硬，有轻度骨化；空白组缺损区未见明显骨化组织.
2.2光镜下组织形态学观察术后1 wk：HA组可见缺损区有少量新生骨痂形成，骨小梁边缘可见核深染的、增生的骨母细胞，还有增生的肉芽和纤维组织，周边有较明显炎性反应；nanoHA组可见新生编织骨小梁较多，活跃增生的骨细胞和骨母细胞，缺损区内炎性肉芽组织较少，周边炎细胞不明显(Fig 1)；空白组可见缺损区有出血、炎性肉芽组织和死骨片，也有极少量的新生骨痂，边缘也有增生的骨细胞.
术后2 wk：HA组可见新生骨小梁增多、活跃，骨母细胞多见，炎性反应减轻；nanoHA组可见有编织状骨小梁，骨细胞增生活跃，炎细胞较少；空白组可见仍为少量增生骨细胞.
术后3 wk：HA组可见有增生骨小梁多见，陈旧及新生骨小梁混合存在，炎细胞浸润不明显，有泡沫细胞及含铁血黄素巨噬聚集，肉芽组织增生明显(Fig 2)；nanoHA组可见骨小梁较成熟和新生骨小梁，有软骨化骨在骨痂内出现，间质炎症反应轻；空白组可见骨小梁较成熟，伴有肉芽组织增生，间质有少量炎细胞浸润.
术后4 wk：HA组可见新生骨小梁较为致密，开始出现骨改建，间质炎细胞反应较轻，邻近软组织内纤维母细胞增生明显；nanoHA组可见人工植入材料被纤维组织包绕，新生骨小梁明显，间质炎细胞较少，部分区域出现破骨细胞吸收死骨(Fig 3)；空白组可见有新生骨小梁，开始出现骨髓腔，少量炎细胞.
术后8 wk：HA组可见新生骨小梁较为成熟，融合成片，炎细胞反应基本消失，有骨髓腔出现；nanoHA组可见新生编织骨较成熟，有骨髓腔出现，与正常骨有融合、修复现象，无炎细胞浸润；空白组可见骨小梁大部分成熟，骨髓腔出现.
2.3TGFβ1免疫组化结果术后所有组均可见TGFβ1着色于成骨细胞、新生成的骨细胞胞质和骨间纤维细胞内，尤其是邻近缺损区骨质. 肉芽组织中也可见阳性着色. 早期阳性着色较明显，以后呈下降趋势，4 wk时肉芽组织中TGFβ1表达明显减少，而骨细胞中的TGFβ1表达仍存在，8 wk时nanoHA组TGFβ1表达值仍较高，另两组明显减弱(Fig 4～6).
2.4免疫组化图像量化统计分析结果见Tab 1.表1各时间段TGFβ1表达定量值(略)
3讨论
HA分子式为Ca10(PO4)6(OH)2，一般为白色砂粒状，自然界和人工合成的HA晶体组分与人体骨的无机质成分和结构均类似. HA作为骨修复材料具有良好的生物相容性，植入机体后能与组织的细胞膜表面的多糖和糖蛋白等通过氢键结合，最终形成骨性结合. 通常nanoHA是指颗粒处于1～100 nm大小的HA，而人体内生物矿化的HA是平均大小为50 nm×25 nm,厚度为2～3 nm的纳米级结构[2]. 从仿生角度讲，如果合成的nanoHA 在组成、晶体结构、结晶率及形状等方面与人体内生物矿化的HA更接近的话，就有更佳的骨结合性. 它为机体细胞提供的微环境使骨系细胞黏附、增殖功能得以充分发挥. 因此nanoHA颇为生物材料界关注. 本实验中nanoHA颗粒大小约20～80 nm，具有纳米材料的基本性能，在生物相容性等方面已初步显示出较HA的优越性，前者植入早期即少见炎性细胞，未见异物巨细胞和排斥反应的发生，后者术区早期炎症细胞较明显，2～3 wk才逐渐消退.
HA本身不含人体需要的生物活性成分，没有骨诱导性，只有骨引导性. 本实验发现早期骨缺损周边成骨细胞生长活跃，并随时间推移逐渐加强，伴随新生血管长入、炎性反应和材料的溶解反应，至3 wk时有编织骨形成，8 wk时新生骨成熟、矿化. nanoHA植骨块区周边表现出骨细胞生长开始于术后1和2 wk时即见编织骨形成，8 wk时骨矿化更明显，尚未见明显改建. Lewandrowski等[3]用nanoHA和小颗粒HA修复鼠胫骨缺损实验中，也发现术后3 wk时，材料的生物相容性和骨融合情况，纳米组最强，骨形成更明显，空白组最少. 分析认为纳米材料改善了自身和骨组织的生物活性，更合理地为骨细胞等生长提供传导通道，促使骨生长加速.
除了上述生物活性和优异的骨传导性能外，nanoHA也是一种生物可降解材料，一般认为HA的溶解、吸收有两种途径[1，4]：①体液介导的溶解过程，即HA溶于体液中；②细胞介导的吸收过程，即细胞的吞噬作用. HA生物降解率和降解量取决于其基本的物理、化学性质和机体内环境. 小颗粒者相对的比表面积大，比大颗粒者降解快；颗粒疏松者比致密者降解快；多孔型比无孔型降解快. 本实验中HA植块早期即有溶解、弥散现象，后期溶解、吸收现象较nanoHA更明显. 弥散颗粒进入缺损区纤维组织和骨组织内，光镜检查发现有异物巨细胞反应. 而nanoHA植骨块基本保持完整，说明材料剂型有待改进. 4 wk和8 wk组发现材料表面有散在虫蚀样孔隙，可能是材料被溶解和吸收.
骨缺损修复是一个复杂的骨再生过程，其组织学过程伴随着复杂的生物学调节机制，大量的细胞因子在不同的骨损伤修复阶段发挥不同的作用，调控骨再生. 目前的研究证实与骨折修复有密切关系的调节因子有：骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子β(TGFβ)和成纤维细胞生长因子(FGF)等. TGFβ属损伤局部产生的内源性细胞调节因子，主要功能是使软骨骨原细胞分化成熟，转化为软骨细胞和成骨细胞，并促进骨基质蛋白的合成、加速软骨内化骨过程. 而有关nanoHA修复骨缺损相关的TGFβ表达等方面研究报道较少. 本实验发现TGFβ1的表达分布在原始骨痂中的成骨细胞、骨端骨细胞、新生成的软骨基质中，以及肉芽组织中的单核巨噬细胞、多核巨噬细胞和间质细胞中. 术后1 wk时，以上骨细胞和肉芽组织TGFβ1均有较多表达，且呈上升趋势，2 wk有所下降，3 wk时又有上升，4 wk时肉芽组织中TGFβ1表达明显减少，而骨细胞中的TGFβ1表达仍存在. 此结果与文献报道有所差别，主要表现在TGFβ1表达出现较早，1～4 wk又有波动，而有文献报道TGFβ1表达高峰在2～3 wk左右，4 wk下降到较低水平[5]. 分析可能有几个原因：① 骨缺损实验与骨折实验形成的骨痂可能有差别；② 实验动物有差别；③ TGFβ1属损伤局部产生的内源性细胞调节因子，缺损区损伤较大，早期主要产生内源性TGFβ1较多；④ 3 wk时表达值又升高，可能是外源性因素开始起作用，即远距离相关细胞产生的TGFβ1通过“内分泌”的形式作用于骨再生局部细胞. 分析不同实验材料组发现，nanoHA组TGFβ1术后1 wk骨端细胞和肉芽组织中已表达到高峰，一直维持到术后8 wk仍有较高水平. HA组和空白组TGFβ1表达值1 wk时较高，以后呈减弱趋势，8 wk降至较低水平. 本实验也证实nanoHA较HA更能促进骨生长因子的表达，维持时限长，也间接说明了骨修复能力的差异，而普通组又较空白组有更强的骨修复能力.
【参考文献】
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[5] 张永刚，卢世壁，王继芳,等. 骨形态发生蛋白和转化生长因子β及碱性成纤维细胞生长因子在骨折修复中的表达[J]. 中华创伤杂志，2000；16(3)：170-173.
Zhang YG, Lu SB, Wang JF,et al. Experimental study of expression of BMP, TGFβ and bFGF in fracture healing[J]. Chin J Traumatol, 2000；16(3)：170-173.
通讯作者：李祖兵. Tel.(027)87646313 Email.Lizubing@sina.com
作者简介：董青山(1971)，男(汉族)，湖北省武穴市人. 硕士，主治医师. Tel.(027)68878714Email.dqsdentist.@sina.com
(1广州军区武汉总医院口腔科，湖北 武汉 430070，2武汉大学口腔医学院口腔颌面外科，湖北 武汉 430079)
编辑袁天峰, 百拇医药(董青山，李祖兵，王虎中，郭家平)