肌浆网内钙容量减少对心肌细胞钙释放的影响
Regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+ content depletion on cardiac Ca2+ release
SHEN JianXin, CHEN YaoWen, WANG HaiYan, HAN TaiZhen
1Department of Physiology, Medical College,Shantou University, Shantou 515041, China, 2Department of Physiology, Medical College, Xian Jiaotong University, Xian 710061, China, 3Central Lab, Shantou University, Shantou 515063, China, 4Department of Pathophysiology, Shantou University Medical College, Shantou 515041, China
【Abstract】 AIM: To systematically investigate the effects of sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ content depletion on cardiac Ca2+ release. METHODS: Thapsigargin, a potent SR Ca2+ pump inhibitor, was used to deplete the SR Ca2+ content. The SR Ca2+ content was estimated by traditional caffeine puff. The global Ca2+ release was evoked by local field stimulation and the intracellular Ca2+ signal was recorded by the laser scanning confocal microscope. RESULTS: The results showed that thapsigargin decreased the SR Ca2+ content in a dosedependent and nonlinear timedependent manner. The intracellular Ca2+ release decreased with the depletion of SR Ca2+. But these two decreases were not parallel to each other. A slight depletion of SR Ca2+ could lead to a significant decrease of Ca2+ release. When SR Ca2+ depleted to a certain degree (though still much higher Ca2+ in SR than in plasma), only little or no Ca2+ release could be triggered by field stimulation. CONCLUSION: The results suggest that SR Ca2+ content has some important nonlinear regulatory effect on intracellular Ca2+ release.
【Keywords】 Ca2+ release; microscopy, confocal; sarcoplasmic reticulum; myocardium/cytology
【摘要】 目的： 较系统地研究肌浆网(SR)内钙容量的减少对心肌细胞钙释放的影响. 方法： 采用肌浆网膜的钙泵抑制剂thapsigargin(TG)耗减SR内钙容量，以喷咖啡因的方法估测SR内钙容量，以局部场刺激的方法诱发全细胞的钙释放. 胞内钙信号的变化均采用激光共聚焦显微镜的方法记录. 结果： SR钙泵抑制剂TG以剂量依赖和非线性的时间依赖方式引致心肌细胞SR内钙容量的耗减，而钙容量的耗减可相应地引起全细胞水平的钙释放减少. 但二者的变化不完全平行，SR内钙容量的少量减少即可引起胞内钙释放的显著减少，而当SR内钙耗减到一定程度后(虽然此时SR内Ca2+仍远高于胞质内钙)，场刺激已很难或无法引致钙释放. 结论： 心肌细胞SR内钙容量对胞内钙释放具有重要的非线性调节作用.
【关键词】 钙释放；显微镜检查，共焦；肌浆网；心肌/细胞学
0引言
在心肌细胞中，胞内钙的大量释放负责启动粗细肌丝的相对滑行，进而导致细胞收缩，是兴奋收缩耦联过程中的关键环节[1]. 钙释放量在很大程度上决定于肌浆网内钙容量的多少[1,2]. 在生理条件下，心肌细胞产生的钙瞬变(calcium transients)中，约有92%的钙来自肌浆网(sarcoplasmic reticulum, SR)[2]. SR内钙增多可提高SR释放钙的敏感性从而增加钙释放量[3]. 但SR钙容量减少对钙释放的影响则未见系统研究. 我们采用肌浆网膜的钙泵抑制剂thapsigargin(TG)耗减SR内钙容量，以喷咖啡因的方法估测SR内钙容量，以局部场刺激的方法诱发全细胞的钙释放，较系统地研究了SR内钙容量减少对心肌细胞钙释放的影响如下.
1材料和方法
1.1材料
心室肌单细胞，取自成年SD大鼠，2~3 mo龄，体质量200~300 g. 采用通用的标准酶解分离技术[4]分离.
1.2方法
心肌单细胞与钙荧光指示剂fluo4AM (15 μmol/L)(Molecular Probes, Inc.)共同孵育5 min后以正常胞外液灌流10 min，除去胞外多余的荧光染料并使进入胞内的fluo4AM除去AM基团. 适合进行实验的细胞具有如下特点： 横纹清晰，呈杆状，表面干净平整，无自发收缩[4]. 加载好荧光染料的细胞置于Zeiss LSM410倒置共聚焦显微镜系统的载物台上. 共聚焦显微镜的成像方式为线扫描，采样速率为2.09 ms/线，空间分辨率为0.31 μm/像素. 扫描线位于细胞长轴纵向正中切面的中央(注意避开细胞核). 在有TG存在的情况下，任何一个选定的细胞都只受到一次局部场刺激或被喷一次咖啡因，同时以线扫描的方式记录一幅钙瞬变图像. 所有实验均在室温23~25℃下进行. 在减少SR内钙容量的实验过程中，钙泵抑制thapsigargin(TG, 购自CalbiochemNovabiochem Corp)随细胞外灌流液作用于心肌细胞. 灌流液的成分为(mmol/L)： 137 NaCl, 1 CaCl2, 4.9 KCl, 1 MgCl2, 1.2 NaH2PO4, 15 glucose和20 HEPES；pH用NaOH调至7.4[4]. SR内钙容量可通过喷射咖啡因(caffeine puff)的方法估测[5]. 咖啡因(Sigma Corp)浓度为20 mmol/L，喷射时程为500 ms. 喷射装置为一尖端直径约4 μm 的微玻管，其另一端与微量喷射器(Picospritzer, General Valve Co., NJ, USA)相连. 微玻管先置于目标细胞下游约200 μm 处，喷射前则快速移至目标细胞下游100 μm处(Fig 1A). 共聚焦线扫描在喷射咖啡因前200 ms即开始，起始部分作为喷射前的本底对照.
本研究中采用局部场刺激诱发心肌细胞胞内钙释放[5]. 场刺激由电子刺激器通过一对白金刺激电极以1.5倍于阈强度(约15 V)的脉冲电刺激加于心肌细胞的两侧(Fig 2A)，细胞受刺激产生动作电位，进而触发细胞产生钙瞬变. 共聚焦线扫描在局部场刺激开始前200 ms 即开始，起始部分作为刺激前的本底对照. 实验获得图像(典型结果见Fig 1B, Fig 2B)用自编的IDL(Research Systems, Inc.)程序处理. 钙瞬变的大小以标准荧光强度(normalized fluorescence)即F/F0表示，其中F0表示静息状态的荧光强度[6].
统计学处理: 数据以x±s表示. 用SPSS10.0统计软件作单因素方差分析(one way ANOVA). P<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1TG对心肌细胞SR内钙容量的耗减作用静息状态下SR内钙容量可通过喷咖啡因诱发的钙瞬变(caffeineinduced Ca2+ transients， CCT)来衡量. 当TG浓度为100 nmol/L时(Fig 3, 4)CCT平均峰值随着TG灌流时间的延长而减小(P<0.01)；当TG作用时间较短(≤20 min)时TG对SR内钙的耗减作用不明显(P>0.05)，但TG作用时间较长时CCT的平均峰值有减小趋势，其平均减小速率为0.029(F/F0)/min；当TG作用时间超过20 min后，CCT平均峰值明显下降(P<0.01)，其平均减小速率为0.222(F/F0)/min. 可见，在所观察的时间全程中，TG对SR内钙容量的耗减效应为非线性的时间依赖效应. 类似的结果在TG浓度为50 nmol/L和1 μmol/L时也可见到. 另外，经过相同的作用时间，高浓度TG(1 μmol/L)对CCT的耗减效应明显强于低浓度TG(100 nmol/L或50 nmol/L)的效应，呈剂量依赖特性(Fig 4B).
2.2TG作用下心肌细胞内的钙释放在TG浓度固定为100 nmol/L不变时(Fig 3, 4)，ACT平均峰值随着TG灌流时间的延长而减小(P<0.01)；当TG作用时间较短(≤10 min)时P>0.05，TG对SR内钙释放的影响不明显，但TG作用时间较长时ACT平均峰值有减小趋势，其平均减小速率为0.066(F/F0)/min；而随着作用时间的延长，ACT平均峰值明显下降(P<0.01)，其平均减小速率为0.33(F/F0)/min(10~17 min). 可见，在所观察的一定时间内，TG导致的全细胞水平的钙释放的减少效应也为非线性的时间依赖效应. 但当TG作用时间长到一定程度(≥25 min)后，ACT的平均峰值即趋稳定. 类似的结果在TG浓度为50 nmol/L和1 μmol/L时也可见到(Fig 3, 4). 另外，经过相同的作用时间，高浓度TG(1 μmol/L)对ACT的减少效应明显强于低浓度TG(100 nmol/L或50 nmol/L)的效应，呈剂量依赖特性(Fig 4A).
2.3SR内钙容量减少对胞内钙释放的影响正常情况下或TG效应不太强时，ACT平均峰值均小于相应CCT平均峰值(Fig 3). 这与心肌细胞胞内钙释放主要来源于SR内储存的钙的事实是一致的[2,7]. 而随着TG耗减SR内钙容量效应的不断增强，ACT平均峰值可逐渐接近进而超过相应的CCT平均峰值. 其中ACT平均峰值在TG效应较强时也能保持一定水平，而不会减小至0. 这是因为ACT中包含了对SR钙容量耗减不敏感的钙内流成分[5]. SR内钙容量的较小下降即可引起全细胞钙释放量的显著减弱. 表明，SR内钙容量对全细胞钙释放的影响是非线性的. 以CCT的平均峰值为横坐标，以相应的ACT的平均峰值为纵坐标作散点图(Fig 5)，可见其趋势类一陡峭的“J”形曲线. ACT与CCT的关系趋势也表明，SR内钙减少至一定程度后，虽然此时SR内钙浓度仍远高于胞质的钙浓度，但AP的刺激已不能或不容易触发SR的钙释放.
3讨论
局部场刺激心肌细胞可使后者产生动作电位(action potential, AP)，接着AP诱发一次全细胞的钙瞬变，产生细胞收缩[1]. 在这个兴奋收缩耦联过程中，大鼠心肌细胞内增多的钙总量中约有92%来自SR,其余7%~8%主要来自细胞膜上电压依赖性L型钙通道开放所产生的钙内流. 我们的结果表明，在正常情况下，ACT小于相应的CCT(Fig 3). 即在正常心动周期中，钙释放量只是SR中可释放钙量的一部分[2,7]. 心肌细胞中，胞内钙释放受SR内钙容量的调节，而SR内钙容量的多少主要决定于SR膜上的钙泵对胞质钙的摄取[1,2]. 研究表明，用5 μmol/L TG灌流完整的心肌细胞，60 s内可阻断约95%的钙泵功能，而90 s可完全阻断SR的摄钙能力[8]. 可见TG是SR钙泵的一种强力抑制剂. TG对钙泵的高亲和力(Kd<2 pmol/L)[5]导致TG的作用实质上是不可逆的. 因此，灌流TG后一个细胞只作一次实验,记录一幅图像. 本结果表明，TG以剂量依赖和非线性的时间依赖方式引起心肌细胞SR内钙容量的耗减，而钙容量的耗减进而导致全细胞水平钙释放的减少. 这可能意味着SR内钙的耗减速率会因TG浓度的增大和作用时间的延长而加速.
本结果也显示，ACT与CCT的关系趋势曲线呈“J”型(Fig 5)，左侧的平整部分反映了对SR钙容量耗减不敏感的、通过L型钙通道内流的钙成分[5]； 右侧斜率较大表明，在心肌细胞兴奋收缩耦联过程中，SR内钙容量的少量耗减即可导致钙释放量的显著减弱. 这说明SR内钙容量对胞内钙释放具有重要的非线性调节作用. 但钙容量减少到一定程度后SR即不能因AP触发而释放钙. 具体机制也仍有待进一步研究.
致谢得到北京大学生命科学学院膜与膜生物工程国家重点实验室程和平和王世强博士的支持!
【参考文献】
[1]Bers DM. Cardiac excitationcontraction coupling [J]. Nature, 2002;415(6868):198-205.
[2]Gyorke S, Gyorke I, Lukyanenko V, et al. Regulation of sarcoplasmic reticulum calcium release by luminal calcium in cardiac muscle [J]. Front Biosci, 2002;7:d1454-1463.
[3]Bers DM. Sarcoplasmic reticulum Ca release in intact ventricular myocytes [J]. Front Biosci, 2002;7:d1697-711.
[4]Shen JX, Wang SQ, Cheng HP, et al. Ca2+ sparks evoked by Loosepatch Method [J]. J Fourth Mil Med Univ, 2004;25(4).
[5]Shen JX, Wang SQ, Cheng HP, et al. Timedependent effects of thapsigargin on cardiac intracellular Ca2+ release and sarcoplasmic reticulum Ca2+ content [J]. J SUN Yatsen Univ (Med Sci), 2004;25(1):23-27.
[6]Wang SQ, Song LS, Lakatta EG, et al. Ca2+ signalling between single Ltype Ca2+ channels and ryanodine receptors in heart cells [J]. Nature, 2001;410(6828):592-596.
[7]Shannon TR, Ginsburg KS, Bers DM. Potentiation of fractional sarcoplasmic reticulum calcium release by total and free intrasarcoplasmic reticulum calcium concentration [J]. Biophys J, 2000;78(1):334-343.
[8]Bassani JW, Yuan W, Bers DM. Fractional SR Ca2+ release is regulated by trigger Ca2+ and SR Ca2+ content in cardiac myocytes [J]. Am J Physiol Cell Physiol, 1995;268:C1313-1319.
项目基金：国家自然科学基金资助(30470900)；广东省自然科学基金资助(04020253)；汕头大学研究与发展基金资助(L00015)
通讯作者：沈建新(1969)，广东省潮安人. 博士. Tel. (0754)8900451Email. jxshen@stu.edu.cn
(1汕头大学医学院生理学教研室, 广东 汕头 515041， 2西安交通大学医学院生理学教研室, 陕西 西安710061， 3汕头大学中心实验室,广东 汕头 515063， 4汕头大学医学院病理生理学教研室，广东 汕头 515041)
编辑何扬举, http://www.100md.com(沈建新，陈耀文，王海燕，韩太真)
SHEN JianXin, CHEN YaoWen, WANG HaiYan, HAN TaiZhen
1Department of Physiology, Medical College,Shantou University, Shantou 515041, China, 2Department of Physiology, Medical College, Xian Jiaotong University, Xian 710061, China, 3Central Lab, Shantou University, Shantou 515063, China, 4Department of Pathophysiology, Shantou University Medical College, Shantou 515041, China
【Abstract】 AIM: To systematically investigate the effects of sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ content depletion on cardiac Ca2+ release. METHODS: Thapsigargin, a potent SR Ca2+ pump inhibitor, was used to deplete the SR Ca2+ content. The SR Ca2+ content was estimated by traditional caffeine puff. The global Ca2+ release was evoked by local field stimulation and the intracellular Ca2+ signal was recorded by the laser scanning confocal microscope. RESULTS: The results showed that thapsigargin decreased the SR Ca2+ content in a dosedependent and nonlinear timedependent manner. The intracellular Ca2+ release decreased with the depletion of SR Ca2+. But these two decreases were not parallel to each other. A slight depletion of SR Ca2+ could lead to a significant decrease of Ca2+ release. When SR Ca2+ depleted to a certain degree (though still much higher Ca2+ in SR than in plasma), only little or no Ca2+ release could be triggered by field stimulation. CONCLUSION: The results suggest that SR Ca2+ content has some important nonlinear regulatory effect on intracellular Ca2+ release.
【Keywords】 Ca2+ release; microscopy, confocal; sarcoplasmic reticulum; myocardium/cytology
【摘要】 目的： 较系统地研究肌浆网(SR)内钙容量的减少对心肌细胞钙释放的影响. 方法： 采用肌浆网膜的钙泵抑制剂thapsigargin(TG)耗减SR内钙容量，以喷咖啡因的方法估测SR内钙容量，以局部场刺激的方法诱发全细胞的钙释放. 胞内钙信号的变化均采用激光共聚焦显微镜的方法记录. 结果： SR钙泵抑制剂TG以剂量依赖和非线性的时间依赖方式引致心肌细胞SR内钙容量的耗减，而钙容量的耗减可相应地引起全细胞水平的钙释放减少. 但二者的变化不完全平行，SR内钙容量的少量减少即可引起胞内钙释放的显著减少，而当SR内钙耗减到一定程度后(虽然此时SR内Ca2+仍远高于胞质内钙)，场刺激已很难或无法引致钙释放. 结论： 心肌细胞SR内钙容量对胞内钙释放具有重要的非线性调节作用.
【关键词】 钙释放；显微镜检查，共焦；肌浆网；心肌/细胞学
0引言
在心肌细胞中，胞内钙的大量释放负责启动粗细肌丝的相对滑行，进而导致细胞收缩，是兴奋收缩耦联过程中的关键环节[1]. 钙释放量在很大程度上决定于肌浆网内钙容量的多少[1,2]. 在生理条件下，心肌细胞产生的钙瞬变(calcium transients)中，约有92%的钙来自肌浆网(sarcoplasmic reticulum, SR)[2]. SR内钙增多可提高SR释放钙的敏感性从而增加钙释放量[3]. 但SR钙容量减少对钙释放的影响则未见系统研究. 我们采用肌浆网膜的钙泵抑制剂thapsigargin(TG)耗减SR内钙容量，以喷咖啡因的方法估测SR内钙容量，以局部场刺激的方法诱发全细胞的钙释放，较系统地研究了SR内钙容量减少对心肌细胞钙释放的影响如下.
1材料和方法
1.1材料
心室肌单细胞，取自成年SD大鼠，2~3 mo龄，体质量200~300 g. 采用通用的标准酶解分离技术[4]分离.
1.2方法
心肌单细胞与钙荧光指示剂fluo4AM (15 μmol/L)(Molecular Probes, Inc.)共同孵育5 min后以正常胞外液灌流10 min，除去胞外多余的荧光染料并使进入胞内的fluo4AM除去AM基团. 适合进行实验的细胞具有如下特点： 横纹清晰，呈杆状，表面干净平整，无自发收缩[4]. 加载好荧光染料的细胞置于Zeiss LSM410倒置共聚焦显微镜系统的载物台上. 共聚焦显微镜的成像方式为线扫描，采样速率为2.09 ms/线，空间分辨率为0.31 μm/像素. 扫描线位于细胞长轴纵向正中切面的中央(注意避开细胞核). 在有TG存在的情况下，任何一个选定的细胞都只受到一次局部场刺激或被喷一次咖啡因，同时以线扫描的方式记录一幅钙瞬变图像. 所有实验均在室温23~25℃下进行. 在减少SR内钙容量的实验过程中，钙泵抑制thapsigargin(TG, 购自CalbiochemNovabiochem Corp)随细胞外灌流液作用于心肌细胞. 灌流液的成分为(mmol/L)： 137 NaCl, 1 CaCl2, 4.9 KCl, 1 MgCl2, 1.2 NaH2PO4, 15 glucose和20 HEPES；pH用NaOH调至7.4[4]. SR内钙容量可通过喷射咖啡因(caffeine puff)的方法估测[5]. 咖啡因(Sigma Corp)浓度为20 mmol/L，喷射时程为500 ms. 喷射装置为一尖端直径约4 μm 的微玻管，其另一端与微量喷射器(Picospritzer, General Valve Co., NJ, USA)相连. 微玻管先置于目标细胞下游约200 μm 处，喷射前则快速移至目标细胞下游100 μm处(Fig 1A). 共聚焦线扫描在喷射咖啡因前200 ms即开始，起始部分作为喷射前的本底对照.
本研究中采用局部场刺激诱发心肌细胞胞内钙释放[5]. 场刺激由电子刺激器通过一对白金刺激电极以1.5倍于阈强度(约15 V)的脉冲电刺激加于心肌细胞的两侧(Fig 2A)，细胞受刺激产生动作电位，进而触发细胞产生钙瞬变. 共聚焦线扫描在局部场刺激开始前200 ms 即开始，起始部分作为刺激前的本底对照. 实验获得图像(典型结果见Fig 1B, Fig 2B)用自编的IDL(Research Systems, Inc.)程序处理. 钙瞬变的大小以标准荧光强度(normalized fluorescence)即F/F0表示，其中F0表示静息状态的荧光强度[6].
统计学处理: 数据以x±s表示. 用SPSS10.0统计软件作单因素方差分析(one way ANOVA). P<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1TG对心肌细胞SR内钙容量的耗减作用静息状态下SR内钙容量可通过喷咖啡因诱发的钙瞬变(caffeineinduced Ca2+ transients， CCT)来衡量. 当TG浓度为100 nmol/L时(Fig 3, 4)CCT平均峰值随着TG灌流时间的延长而减小(P<0.01)；当TG作用时间较短(≤20 min)时TG对SR内钙的耗减作用不明显(P>0.05)，但TG作用时间较长时CCT的平均峰值有减小趋势，其平均减小速率为0.029(F/F0)/min；当TG作用时间超过20 min后，CCT平均峰值明显下降(P<0.01)，其平均减小速率为0.222(F/F0)/min. 可见，在所观察的时间全程中，TG对SR内钙容量的耗减效应为非线性的时间依赖效应. 类似的结果在TG浓度为50 nmol/L和1 μmol/L时也可见到. 另外，经过相同的作用时间，高浓度TG(1 μmol/L)对CCT的耗减效应明显强于低浓度TG(100 nmol/L或50 nmol/L)的效应，呈剂量依赖特性(Fig 4B).
2.2TG作用下心肌细胞内的钙释放在TG浓度固定为100 nmol/L不变时(Fig 3, 4)，ACT平均峰值随着TG灌流时间的延长而减小(P<0.01)；当TG作用时间较短(≤10 min)时P>0.05，TG对SR内钙释放的影响不明显，但TG作用时间较长时ACT平均峰值有减小趋势，其平均减小速率为0.066(F/F0)/min；而随着作用时间的延长，ACT平均峰值明显下降(P<0.01)，其平均减小速率为0.33(F/F0)/min(10~17 min). 可见，在所观察的一定时间内，TG导致的全细胞水平的钙释放的减少效应也为非线性的时间依赖效应. 但当TG作用时间长到一定程度(≥25 min)后，ACT的平均峰值即趋稳定. 类似的结果在TG浓度为50 nmol/L和1 μmol/L时也可见到(Fig 3, 4). 另外，经过相同的作用时间，高浓度TG(1 μmol/L)对ACT的减少效应明显强于低浓度TG(100 nmol/L或50 nmol/L)的效应，呈剂量依赖特性(Fig 4A).
2.3SR内钙容量减少对胞内钙释放的影响正常情况下或TG效应不太强时，ACT平均峰值均小于相应CCT平均峰值(Fig 3). 这与心肌细胞胞内钙释放主要来源于SR内储存的钙的事实是一致的[2,7]. 而随着TG耗减SR内钙容量效应的不断增强，ACT平均峰值可逐渐接近进而超过相应的CCT平均峰值. 其中ACT平均峰值在TG效应较强时也能保持一定水平，而不会减小至0. 这是因为ACT中包含了对SR钙容量耗减不敏感的钙内流成分[5]. SR内钙容量的较小下降即可引起全细胞钙释放量的显著减弱. 表明，SR内钙容量对全细胞钙释放的影响是非线性的. 以CCT的平均峰值为横坐标，以相应的ACT的平均峰值为纵坐标作散点图(Fig 5)，可见其趋势类一陡峭的“J”形曲线. ACT与CCT的关系趋势也表明，SR内钙减少至一定程度后，虽然此时SR内钙浓度仍远高于胞质的钙浓度，但AP的刺激已不能或不容易触发SR的钙释放.
3讨论
局部场刺激心肌细胞可使后者产生动作电位(action potential, AP)，接着AP诱发一次全细胞的钙瞬变，产生细胞收缩[1]. 在这个兴奋收缩耦联过程中，大鼠心肌细胞内增多的钙总量中约有92%来自SR,其余7%~8%主要来自细胞膜上电压依赖性L型钙通道开放所产生的钙内流. 我们的结果表明，在正常情况下，ACT小于相应的CCT(Fig 3). 即在正常心动周期中，钙释放量只是SR中可释放钙量的一部分[2,7]. 心肌细胞中，胞内钙释放受SR内钙容量的调节，而SR内钙容量的多少主要决定于SR膜上的钙泵对胞质钙的摄取[1,2]. 研究表明，用5 μmol/L TG灌流完整的心肌细胞，60 s内可阻断约95%的钙泵功能，而90 s可完全阻断SR的摄钙能力[8]. 可见TG是SR钙泵的一种强力抑制剂. TG对钙泵的高亲和力(Kd<2 pmol/L)[5]导致TG的作用实质上是不可逆的. 因此，灌流TG后一个细胞只作一次实验,记录一幅图像. 本结果表明，TG以剂量依赖和非线性的时间依赖方式引起心肌细胞SR内钙容量的耗减，而钙容量的耗减进而导致全细胞水平钙释放的减少. 这可能意味着SR内钙的耗减速率会因TG浓度的增大和作用时间的延长而加速.
本结果也显示，ACT与CCT的关系趋势曲线呈“J”型(Fig 5)，左侧的平整部分反映了对SR钙容量耗减不敏感的、通过L型钙通道内流的钙成分[5]； 右侧斜率较大表明，在心肌细胞兴奋收缩耦联过程中，SR内钙容量的少量耗减即可导致钙释放量的显著减弱. 这说明SR内钙容量对胞内钙释放具有重要的非线性调节作用. 但钙容量减少到一定程度后SR即不能因AP触发而释放钙. 具体机制也仍有待进一步研究.
致谢得到北京大学生命科学学院膜与膜生物工程国家重点实验室程和平和王世强博士的支持!
【参考文献】
[1]Bers DM. Cardiac excitationcontraction coupling [J]. Nature, 2002;415(6868):198-205.
[2]Gyorke S, Gyorke I, Lukyanenko V, et al. Regulation of sarcoplasmic reticulum calcium release by luminal calcium in cardiac muscle [J]. Front Biosci, 2002;7:d1454-1463.
[3]Bers DM. Sarcoplasmic reticulum Ca release in intact ventricular myocytes [J]. Front Biosci, 2002;7:d1697-711.
[4]Shen JX, Wang SQ, Cheng HP, et al. Ca2+ sparks evoked by Loosepatch Method [J]. J Fourth Mil Med Univ, 2004;25(4).
[5]Shen JX, Wang SQ, Cheng HP, et al. Timedependent effects of thapsigargin on cardiac intracellular Ca2+ release and sarcoplasmic reticulum Ca2+ content [J]. J SUN Yatsen Univ (Med Sci), 2004;25(1):23-27.
[6]Wang SQ, Song LS, Lakatta EG, et al. Ca2+ signalling between single Ltype Ca2+ channels and ryanodine receptors in heart cells [J]. Nature, 2001;410(6828):592-596.
[7]Shannon TR, Ginsburg KS, Bers DM. Potentiation of fractional sarcoplasmic reticulum calcium release by total and free intrasarcoplasmic reticulum calcium concentration [J]. Biophys J, 2000;78(1):334-343.
[8]Bassani JW, Yuan W, Bers DM. Fractional SR Ca2+ release is regulated by trigger Ca2+ and SR Ca2+ content in cardiac myocytes [J]. Am J Physiol Cell Physiol, 1995;268:C1313-1319.
项目基金：国家自然科学基金资助(30470900)；广东省自然科学基金资助(04020253)；汕头大学研究与发展基金资助(L00015)
通讯作者：沈建新(1969)，广东省潮安人. 博士. Tel. (0754)8900451Email. jxshen@stu.edu.cn
(1汕头大学医学院生理学教研室, 广东 汕头 515041， 2西安交通大学医学院生理学教研室, 陕西 西安710061， 3汕头大学中心实验室,广东 汕头 515063， 4汕头大学医学院病理生理学教研室，广东 汕头 515041)
编辑何扬举, http://www.100md.com(沈建新，陈耀文，王海燕，韩太真)