第27 卷第1 期

    2005 年2 月 大 连 医 科 大 学 学 报

    Journal of Dal ian Medical University

    Vol . 27 No. 1

    Feb. 2005

    E1B - 55KD 基因缺陷腺病毒配合热疗治疗转移性肿瘤X X X X X X

    张晓东,张 阳,韩秀敏 (大连医科大学 第二临床学院,辽宁 大连 116027)

    摘要: [目的] 研究 E1B - 55 KD基因缺陷腺病毒联合微波热疗是否可以产生协同作用杀伤转移性

    肿瘤 ,并探讨其可能的作用机制。[方法]将 40 只近交系 615 小鼠随机分为腺病毒治疗组(A) ,热

    疗组(B) ,腺病毒 +热疗组(C) ,对照组(D) ,每组 10 只。建立荷肝癌细胞模型 ,双侧腋下接种肝癌

    细胞 ,对右侧瘤灶进行药物注射及/或微波热疗 ,观察左侧瘤灶的变化。[结果] B、 C组热休克蛋白

    产生量明显增多;A、 B、 C 组瘤体积较 D 组均有减小 ,C 组与 D 组间比较具有显著性差异( P <

    0. 05) ;A、 B、 C组瘤重较D组均减小 ,具有显著性差异( P < 0. 01) ;右侧腋窝淋巴结转移数测定:A、B、 C组与D组比较 ,转移淋巴结数均少 ,具有统计学意义 ,以 C组最为显著( P < 0. 01) ;细胞毒性 T

    淋巴细胞计数(CD8 +)在 C组有显著增加。[结论] E1B - 55 KD 基因缺陷腺病毒基因治疗辅以微

    波热疗对转移性肿瘤具有协同抗肿瘤作用;该种腺病毒基因治疗联合微波热疗 ,通过激活机体抗肿

    瘤免疫来杀伤远处转移肿瘤细胞。

    关键词:E1B - 55 KD基因缺陷腺病毒;热疗;热休克蛋白;免疫;转移性肿瘤

    中图分类号:R73 - 3 文献标识码:A 文章编号:1671 - 7295 (2005) 01 - 0001 - 04

    转移性肿瘤是肿瘤临床治疗中的难点问题。九

    十年代中期以来 ,国外有人开始设计新一代基因工

    程腺病毒制剂来治疗肿瘤 ,利用正常细胞与肿瘤细

    胞间 P53 功能状态的不同 ,采用基因工程方法删除

    了人野生型 5 型腺病毒的 E1B - 55 KD 基因 ,使得

    构建的腺病毒能选择性地在肿瘤细胞中复制、增殖 ,最后导致肿瘤细胞裂解死亡 ,而对正常细胞无明显

    影响。因此 ,它也被称为溶瘤性腺病毒。本研究在

    基因工程腺病毒治疗的基础上配合微波热疗 ,通过

    肿瘤细胞热应激产生热休克蛋白70 (heat shock pro2

    tein , HSP) ,探讨热应激产生的 HSP70 与腺病毒溶

    瘤产生的裂解产物是否可以诱导和增强细胞毒性 T

    淋巴细胞 (cytotoxitic T lymphocyte , CTL)的活性 ,以杀伤转移性肿瘤细胞。

    1 材料和方法

    1. 1 材 料

    1. 1. 1 实验动物:国产近交系 615 小鼠 ,4 周龄 ,雌

    雄各半 ,体重 20～22 g ,大连医科大学病理室提供。

    1. 1. 2 肿瘤细胞株:小鼠肝癌高转移细胞株 HCa -

    (F) ,大连医科大学病理教研室提供。

    1. 1. 3 实验药物: E1B - 55 KD 基因缺陷腺病毒注

    射液;HSP70 单抗;CD4 - FITC;CD8 - PE等。

    1. 1. 4 实验仪器:MH - I型微波热疗机;离心机;

    流式细胞仪等。

    1. 2 方 法

    1. 2. 1 动物模型的建立:将小鼠肝癌细胞株 HCa -

    (F)于小鼠腹腔传代后 ,于小鼠双侧腋下约 2 cm 处

    皮下接种 2 ×106

    小鼠肿瘤细胞 ,5 d后 ,选择瘤体直

    径约 5 cm的小鼠 40 只开始实验。

    1. 2. 2 实验动物分组:将 40 只荷瘤小鼠随机分为

    4组 ,每组 10 只 ,雌雄各半。分别为腺病毒治疗组

    (A) ,热疗组(B) ,腺病毒 +热疗联合治疗组(C) ,生

    理盐水注射作为对照组(D) 。

    X

    X X

    X X X 作者简介:张晓东(1974 - ) ,男 ,鞍山人 ,医师 ,硕士。

    收稿日期:2003 - 04 - 14 ;修回日期:2004 - 11 - 05。

    省教委科研基金项目:20022123

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.图 1 免疫组化热休克蛋白 HSP70染色结果

    1. 2. 3 实验方法:实验周期为21 d ,实验第1～3 天

    对B、 C两组小鼠右侧瘤体进行微波热疗。将两组

    小鼠分别用乙醚麻醉后 ,置于容器中 ,右侧瘤体朝

    上 ,将热疗机加热探头置于瘤体上方 ,以 10W 功率

    加热 15 min ,1 次/ d。热疗后每组取出 2 只小鼠行

    免疫组化染色 ,以检测热疗后瘤体内的 HSP70 的生

    成情况及加热与否对 HSP70 产生的影响。从第 4

    天开始 ,对 A、 C 两组小鼠右侧瘤体内注射 E1B -

    55 KD基因缺陷腺病毒注射液 ,注射剂量为 1 ×1010

    pfu ,选 5 个不同方向注入瘤体内 ,连续 3 d ,1 次/ d ;

    B、 D组以同样方法注射生理盐水。

    1. 3 观察与检测指标

    (1)肿瘤瘤体测定:于给药后 ,对4 组小鼠每3 d

    测1 次左侧肿瘤的最大直径及其垂直径 ,计算瘤体

    体积 ,肿瘤体积( TV)的计算公式为: TV = 1/ 2 ×a

    ×b2

    (a、 b 分别表示肿瘤长径、短径) 。(2)实验结束

    处死小鼠称瘤重。(3)应用 HE 染色对右侧腋窝淋

    巴结转移进行计数。(4)流式细胞仪检测各组血中

    CD4 +

    、 CD8 +

    百分比及 CD4/ CD8 的比值。

    1. 4 统计学处理

    采用 SPSS8. 0 统计软件进行肿瘤重量、肿瘤体

    积、转移淋巴结数及 CTL 值等样本均数的检验 , P

    < 0. 05 为有显著性差异。

    2 结 果

    2. 1 HSP70 免疫组化染色

    B、 C两组小鼠肿瘤组织经加热后(左图) ,细胞

    浆内的热休克蛋白较未加热的 A、 D 组两组(右图)

    明显增加。图 1 显示热疗组产生大量热休克蛋白。

    2. 2 肿瘤体积

    A、 B、 C组肿瘤体积较D组均有减少 ,提示与对

    照组相比 ,各治疗组均有不同程度的肿瘤抑制作用 ,而 C组小鼠肿瘤生长受抑最为明显。应用公式计

    算各组肿瘤体积 ,并计算出均值 ,A、 B、 C 组分别与

    D 组比较 ,其 P值分别为0. 072、 0. 093、 0. 01 ,其中C

    组与D组相比具有显著性意义 ,A 组、 B 组与 D 组

    相比虽无统计学差异 ,但从各组瘤体体积均值变化

    情况来看较对照组均有减少(见表 1) 。

    2. 3 肿瘤重量测定

    A、 B、 C 组瘤重分别与 D 组比较 ,结果均有减

    少 ,其中 C组减少最为明显。提示各种治疗方法对

    肿瘤细胞均具有一定的抑制作用 ,而联合治疗抑瘤

    效果最佳。A、 B、 C各组与 D 组均数方差分析 , P <

    0. 01 ,均具有统计学意义(见表 2) 。

    表 1 各组小鼠瘤体体积均值变化情况及差异性比较

    (cm3)

    分组 观 察 日 期 (d)

    6 9 12 15 18 21 P

    A 0. 61 1. 02 1. 44 1. 94 2. 10 2. 28 > 0. 05

    B 0. 63 0. 88 1. 24 1. 61 2. 03 2. 33 > 0. 05

    C 0. 39 0. 51 0. 71 0. 85 0. 93 1. 10 < 0. 05

    D 0. 90 1. 42 2. 49 3. 25 4. 09 5. 20

    表 2 小鼠瘤重均值及差异性比较 (g)

    分 组 瘤体重量( x ±s) P

    A 2. 21 ±0. 27 < 0. 01

    B 2. 25 ±0. 40 < 0. 01

    C 1. 04 ±0. 29 < 0. 01

    D 5. 13 ±0. 36

    2. 4 淋巴结转移数测定

    小鼠右侧腋窝淋巴结计数结果显示 ,对照组腋

    窝淋巴结转移数最多 ,联合治疗组最少 ......