BCR/ABLOD结构域重组蛋白的表达和纯化
Expression and purification of fusion protein in BCR/ABLOD domain
YE ShengKai1，JIA HongXia1, LIN Yuan2，ZHOU Peng3, YANG Xi3，ZHANG Ping3, LI JunFeng3, LI Jun-Lin3, DONG Xiao3 , ZHANG
BingHua4,LIANG YingMin1
1Department of Hematology,Tangdu Hospital,Fourth Military Medical University,Xian 710038,China,2Department of Operative Dentistry & Endodontics，Qindu Stomatological College,3Department of Medical Genetics & Developmental Biology, School of Basic Medicine,Fourth Military Medical University, Xian 710033, China,4Department of Hematology ,No.323 Hospital of PLA,Xian 710054,China
【Abstract】AIM: To produce the BCR/ABLOD domain fusion protein. METHODS: The cDNA encoding BCR/ABLOD domain (oligomerization domain)was amplified by using RTPCR method and cloned into pET16b vector. The expression plasmid was introduced into E.coli strain BL21 and HisOD fusion protein accounted for over 75% of the total bacterial protein. HisOD fusion protein was purified from the cell lysates by NiNTA affinity chromatography and was analyzed by SDSPAGE gel. RESULTS: The recombinant HisOD fusion proteins were prepared with high purity (over 95%) and high recovery (about 75%). CONCLUSION: The recombinant HisOD fusion proteins will facilitate the structurefunction analysis of the OD domain of BCR/ABL fusion protein.
【Keywords】 fusion proteins,BCR/ABL；oligomerization domain； recombinant proteins
【摘要】目的： 制备BCR/ABLOD结构域-HIS的重组蛋白.方法： 用RT-PCR方法扩增BCR/ABLOD结构域的基因片段，测序正确后将其克隆入原核表达载体pET16b中，并进行酶切鉴定，鉴定正确后转化大肠杆菌BL21，构建表达His-OD融合蛋白的菌株.经IPTG诱导表达后，镍次氮基三乙酸(NiNTA)琼脂糖进行亲和层析纯化，用SDS-PAGE对该融合蛋白的表达产率及蛋白纯度进行了分析.结果： 获得了His-OD重组融合蛋白，纯度在95%以上，产物得率约75%.结论： 成功制备高纯度His-OD融合蛋白，为进一步研究OD结构域的生物学功能奠定了基础.
【关键词】 融合蛋白质类，BCR/ABL；寡聚化结构域；重组蛋白质类
0引言
慢性粒细胞白血病是起源于骨髓多能造血干细胞的恶性增殖性疾病，其细胞遗传学特征是具有 Ph染色体t( 9；22)( q34；q11)，形成BCR/ABL融合基因，该融合基因编码BCR/ABL癌蛋白,而 BCR/ABL癌蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，可抑制髓系细胞的粘附和凋亡，促使细胞不依赖于细胞生长因子而过度增殖，在体外就能使造血祖细胞发生转化[1].而导致正常造血干细胞发生恶性转化是慢性粒细胞白血病发病的关键[2,3].OD(oligomerization domain)区是BCR/ABL融合蛋白氮端的一个结构域，它能介导BCR/ABL融合蛋白多聚体的形成，而BCR/ABL融合蛋白形成多聚体以后就能更好地发挥酪氨酸激酶的活性[4].分析此结构域，即OD区的晶体结构发现，这个寡聚体形式是两个单体通过N末端螺旋易位，在C末端螺旋间形成反向卷曲螺旋进而形成二聚体，两个二聚体互相套叠形成四聚体.这种四聚体可以促使BCR蛋白形成寡聚化，进而激活通常是无活性的ABL蛋白发挥酪氨酸激酶活性[5].目前对OD结构域的结构和功能尚缺乏研究，为了探讨OD结构域对BCR/ABL融合蛋白酪氨酸激酶活性的影响及其在慢性粒细胞白血病细胞中的生物学功能，我们进行了OD结构域融合蛋白的表达和纯化.
1材料和方法
11材料引物由TAKALA公司合成；RNA提取试剂Trizol 购自INVITROGEN公司；反转录试剂盒及各种限制性内切酶、连接酶及Taq聚合酶均购自美国Promega公司 ；DNA酶和高纯质粒提取试剂盒购自华美公司；IPTG、次氮基三乙酸镍琼脂糖(NiNTA agarose)均购自Sigma公司.原核表达载体pET16b，K562细胞和大肠杆菌XL10、BL21由我室保存.
12方法
121OD基因片段的扩增培养K562细胞，按照Trizol操作指南提取总RNA,并以此为模板进行RTPCR(操作见试剂盒说明),扩增BCR/ABL融合基因氮端的1～206个碱基，即 OD结构域的cDNA片段,命名为OD,其引物序列如下: 5′端引物: 5′GTTAACATGGACCCGGTGG3′和3′端引物: 5′TTAGATATCCTTGGCCAGCAACGTCTG3′.48℃ 50 min反转录,95℃ 预变性5 min, 95℃ 变性30 s，57℃复性1 min,72℃ 延伸30 s 40个循环，72℃末延伸7 min.
122RTPCR产物的克隆和鉴定回收目的片段,将目的片段插入到克隆载体pMD18T,转化XL10大肠杆菌.提取质粒并进行酶切鉴定，所获得正确的阳性克隆命名为pMD18T-OD，送至基康公司进行测序.将测序正确的pMD18T-OD质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，切下目的片段补平后与用XhoⅠ和BamHⅠ酶切后补平的pET16b建立原核表达载体pET16b-OD.
123目的蛋白的诱导表达和纯化pET16b-OD转化的BL21大肠杆菌在含氨苄青霉素(100 mg/L)的LB培养基中培养过夜,然后按1∶10的接种比例进行转接,250 r/min,37℃摇菌至A600 nm=1,加入IPTG至终浓度为05 mmol/L,37℃ 继续培养3～4 h.取15 mL菌液,10 000 g离心30 s收集菌体,在菌体中加入20 μL去离子H2O，振荡混匀，再加入2×上样缓冲液20 μL ,100℃,10 min；16 875 g离心10 min；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的表达情况.大规模(1L)培养细菌，诱导表达目的蛋白，收集菌体，超声裂菌.离心后将上清和沉淀分别制样，进行SDS-PAGE电泳分析表达形式.摸索目的蛋白可溶性表达条件，用次氮基三乙酸镍琼脂糖(NiNTA agarose)亲和层析柱对可溶性的目的蛋白进行纯化.
2结果
21OD基因片段的扩增及序列测定用RT-PCR方法扩增BCR/ABL融合基因氮端碱基的cDNA，得到206 bp的片段(Fig 1).挑取含插入片段的阳性克隆pMD18-T-OD进行测序，测序结果表明，所扩增的基因片段与GenBank公布的OD结构域的碱基序列完全相符.
22表达载体的构建将测序正确的pMD18T-OD经过经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收目的片段补平后插入到用XhoⅠ和BamHⅠ 酶切后补平的pET16b中，构建原核表达载体pET16b-OD, 然后转化XL10大肠杆菌，挑选的阳性克隆子用NcoⅠ和BamHⅠ进行酶切鉴定，10 mL/L琼脂糖凝胶电泳分别在约4700和1600 bp处有两条带，与预期目的片段相同(Fig 2).
图1-图2 略
23重组蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化将pET16b-OD转化入E.coli BL21,IPTG诱导，SDSPAGE电泳表明工程菌表达了Mr28 000的His融合蛋白(Fig 3).对菌体总蛋白上清和沉淀蛋白分别进行电泳分析，发现pET16b-OD融合蛋白95%位于菌体蛋白的可溶性上清中，上清直接经过次氮基三乙酸镍琼脂糖(NiNTA agarose)亲和层析纯化，得到Mr分子量约28×103的目的蛋白(Fig 4).
图3-图4 略
3讨论
随着对BCR/ABL癌蛋白的结构和功能的不断研究，人们逐渐认识到，在不同水平对BCR/ABL癌蛋白的干预, 都可以抑制BCR/ABL蛋白酪氨酸激酶的活性.新近的研究发现BCR/ABL融合蛋白的寡聚化结构域OD区有促进CML发生的作用.以往研究表明，用插入诱变的方法破坏OD区的结构，能够明显抑制BCR/ABL蛋白的寡聚化作用，使BCR/ABL融合蛋白丧失激酶活性，进而其转化功能、诱发白血病能力大大降低[6].而SH3结构域点突变可以使其功能恢复.因此认为OD区可能通过阻断SH3介导的蛋白的自身抑制作用，从而激活BCR/ABL融合蛋白的酪氨酸激酶活性[7].OD区不仅可以作为新的药物靶点，而且新近的研究证明，干预OD区能够增加STI571的药物敏感性[8，9] .因此，我们合成OD结构域蛋白，并进一步探讨OD区蛋白对BCR/ABL融合蛋白酪氨酸激酶活性的影响，探索慢性粒细胞白血病新的治疗药物.
质粒pET16b在大肠杆菌BL21中能够高拷贝复制，并在诱导后高效表达.因表达的蛋白量过高，造成快速合成的蛋白分子来不及充分折叠，使其可溶性下降而形成包涵体，增加了纯化的难度.为简化纯化步骤和减少目的蛋白损失, 作者摸索了诱导表达条件，最后选用了非常少的IPTG用量和特定的诱导时间，降低重组目的蛋白的合成速度和总产量，使其有较充分的时间进行正确折叠.结果，大部分目的蛋白都以可溶性的表达形式存在于裂胞物的上清液中.
【参考文献】
[1] Charles L，Sawyers CL. Chronic myeloid leukemia [J]. N Engl J Med，1999；340(17)：1330-1340.
[2] Faderl S，Talpaz M，Estrov V，et al. The biology of chronic myeloid leukemia [J]. N Engl J Med，1999;165(3): 165-172.
[3] Wong S，Witte ON. Modeling Philadelphia chromosome positive leukemias[J]. Oncogene，2001；20(40)：5644-5659.
[4] Zhao X, Ghaffari S，Lodish H，et al. Structure of BCR-ABL oncoprotein oligomerization domain[J]. Nat Struct Boil，2002；9(2)：117-120.
[5] Arlinghaus RB. Bcr:A negative regulator of the BcrAbl oncoprotein in leukemia[J].Oncogene，2002；21(56)：8560-8567.
[6] McWhirter JR, Galasso DL，Wang JY. A coiledcoil oligomerization domain of Bcr is essential for the transforming function of BCR/ABL oncoproteins[J]. Mol Cell Biol，1993；13(12):7587-7595.
[7] Smith KM，Yacobi R，Van Etten RA. Autoinhibition of BCR/ABL through lts SH3 domain [J]. Mol Cell,2003；12(1):27-37.
[8] Beissert T，Puccetti E，Bianchini A，et al. Targeting of the Nterminal coiled coil oligomerization interface of BCR interferes with the transformation potential of BCRABL and increases sensitivity to STI571[J]. Blood，2003；102(8):2985-2993.
[9] Azam M，Latek RR，Daley GQ. Mechanisms of autoinhibition and STI571/lmatinib resistance revealed by mutagenesis of BCRABL[J].Cell，2003；112(6):831-843.
第四军医大学：1 唐都医院血液科， 陕西 西安710038，
2秦都口腔医学院牙体病科，
3基础部医学遗传学和发育生物学教研室，陕西 西安 710033，
4解放军323医院血液科，陕西 西安 710054
编辑王小仲, 百拇医药(叶盛开 贾洪霞 林媛 周鹏 杨曦 张萍 李军锋 李)
YE ShengKai1，JIA HongXia1, LIN Yuan2，ZHOU Peng3, YANG Xi3，ZHANG Ping3, LI JunFeng3, LI Jun-Lin3, DONG Xiao3 , ZHANG
BingHua4,LIANG YingMin1
1Department of Hematology,Tangdu Hospital,Fourth Military Medical University,Xian 710038,China,2Department of Operative Dentistry & Endodontics，Qindu Stomatological College,3Department of Medical Genetics & Developmental Biology, School of Basic Medicine,Fourth Military Medical University, Xian 710033, China,4Department of Hematology ,No.323 Hospital of PLA,Xian 710054,China
【Abstract】AIM: To produce the BCR/ABLOD domain fusion protein. METHODS: The cDNA encoding BCR/ABLOD domain (oligomerization domain)was amplified by using RTPCR method and cloned into pET16b vector. The expression plasmid was introduced into E.coli strain BL21 and HisOD fusion protein accounted for over 75% of the total bacterial protein. HisOD fusion protein was purified from the cell lysates by NiNTA affinity chromatography and was analyzed by SDSPAGE gel. RESULTS: The recombinant HisOD fusion proteins were prepared with high purity (over 95%) and high recovery (about 75%). CONCLUSION: The recombinant HisOD fusion proteins will facilitate the structurefunction analysis of the OD domain of BCR/ABL fusion protein.
【Keywords】 fusion proteins,BCR/ABL；oligomerization domain； recombinant proteins
【摘要】目的： 制备BCR/ABLOD结构域-HIS的重组蛋白.方法： 用RT-PCR方法扩增BCR/ABLOD结构域的基因片段，测序正确后将其克隆入原核表达载体pET16b中，并进行酶切鉴定，鉴定正确后转化大肠杆菌BL21，构建表达His-OD融合蛋白的菌株.经IPTG诱导表达后，镍次氮基三乙酸(NiNTA)琼脂糖进行亲和层析纯化，用SDS-PAGE对该融合蛋白的表达产率及蛋白纯度进行了分析.结果： 获得了His-OD重组融合蛋白，纯度在95%以上，产物得率约75%.结论： 成功制备高纯度His-OD融合蛋白，为进一步研究OD结构域的生物学功能奠定了基础.
【关键词】 融合蛋白质类，BCR/ABL；寡聚化结构域；重组蛋白质类
0引言
慢性粒细胞白血病是起源于骨髓多能造血干细胞的恶性增殖性疾病，其细胞遗传学特征是具有 Ph染色体t( 9；22)( q34；q11)，形成BCR/ABL融合基因，该融合基因编码BCR/ABL癌蛋白,而 BCR/ABL癌蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，可抑制髓系细胞的粘附和凋亡，促使细胞不依赖于细胞生长因子而过度增殖，在体外就能使造血祖细胞发生转化[1].而导致正常造血干细胞发生恶性转化是慢性粒细胞白血病发病的关键[2,3].OD(oligomerization domain)区是BCR/ABL融合蛋白氮端的一个结构域，它能介导BCR/ABL融合蛋白多聚体的形成，而BCR/ABL融合蛋白形成多聚体以后就能更好地发挥酪氨酸激酶的活性[4].分析此结构域，即OD区的晶体结构发现，这个寡聚体形式是两个单体通过N末端螺旋易位，在C末端螺旋间形成反向卷曲螺旋进而形成二聚体，两个二聚体互相套叠形成四聚体.这种四聚体可以促使BCR蛋白形成寡聚化，进而激活通常是无活性的ABL蛋白发挥酪氨酸激酶活性[5].目前对OD结构域的结构和功能尚缺乏研究，为了探讨OD结构域对BCR/ABL融合蛋白酪氨酸激酶活性的影响及其在慢性粒细胞白血病细胞中的生物学功能，我们进行了OD结构域融合蛋白的表达和纯化.
1材料和方法
11材料引物由TAKALA公司合成；RNA提取试剂Trizol 购自INVITROGEN公司；反转录试剂盒及各种限制性内切酶、连接酶及Taq聚合酶均购自美国Promega公司 ；DNA酶和高纯质粒提取试剂盒购自华美公司；IPTG、次氮基三乙酸镍琼脂糖(NiNTA agarose)均购自Sigma公司.原核表达载体pET16b，K562细胞和大肠杆菌XL10、BL21由我室保存.
12方法
121OD基因片段的扩增培养K562细胞，按照Trizol操作指南提取总RNA,并以此为模板进行RTPCR(操作见试剂盒说明),扩增BCR/ABL融合基因氮端的1～206个碱基，即 OD结构域的cDNA片段,命名为OD,其引物序列如下: 5′端引物: 5′GTTAACATGGACCCGGTGG3′和3′端引物: 5′TTAGATATCCTTGGCCAGCAACGTCTG3′.48℃ 50 min反转录,95℃ 预变性5 min, 95℃ 变性30 s，57℃复性1 min,72℃ 延伸30 s 40个循环，72℃末延伸7 min.
122RTPCR产物的克隆和鉴定回收目的片段,将目的片段插入到克隆载体pMD18T,转化XL10大肠杆菌.提取质粒并进行酶切鉴定，所获得正确的阳性克隆命名为pMD18T-OD，送至基康公司进行测序.将测序正确的pMD18T-OD质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，切下目的片段补平后与用XhoⅠ和BamHⅠ酶切后补平的pET16b建立原核表达载体pET16b-OD.
123目的蛋白的诱导表达和纯化pET16b-OD转化的BL21大肠杆菌在含氨苄青霉素(100 mg/L)的LB培养基中培养过夜,然后按1∶10的接种比例进行转接,250 r/min,37℃摇菌至A600 nm=1,加入IPTG至终浓度为05 mmol/L,37℃ 继续培养3～4 h.取15 mL菌液,10 000 g离心30 s收集菌体,在菌体中加入20 μL去离子H2O，振荡混匀，再加入2×上样缓冲液20 μL ,100℃,10 min；16 875 g离心10 min；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的表达情况.大规模(1L)培养细菌，诱导表达目的蛋白，收集菌体，超声裂菌.离心后将上清和沉淀分别制样，进行SDS-PAGE电泳分析表达形式.摸索目的蛋白可溶性表达条件，用次氮基三乙酸镍琼脂糖(NiNTA agarose)亲和层析柱对可溶性的目的蛋白进行纯化.
2结果
21OD基因片段的扩增及序列测定用RT-PCR方法扩增BCR/ABL融合基因氮端碱基的cDNA，得到206 bp的片段(Fig 1).挑取含插入片段的阳性克隆pMD18-T-OD进行测序，测序结果表明，所扩增的基因片段与GenBank公布的OD结构域的碱基序列完全相符.
22表达载体的构建将测序正确的pMD18T-OD经过经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收目的片段补平后插入到用XhoⅠ和BamHⅠ 酶切后补平的pET16b中，构建原核表达载体pET16b-OD, 然后转化XL10大肠杆菌，挑选的阳性克隆子用NcoⅠ和BamHⅠ进行酶切鉴定，10 mL/L琼脂糖凝胶电泳分别在约4700和1600 bp处有两条带，与预期目的片段相同(Fig 2).
图1-图2 略
23重组蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化将pET16b-OD转化入E.coli BL21,IPTG诱导，SDSPAGE电泳表明工程菌表达了Mr28 000的His融合蛋白(Fig 3).对菌体总蛋白上清和沉淀蛋白分别进行电泳分析，发现pET16b-OD融合蛋白95%位于菌体蛋白的可溶性上清中，上清直接经过次氮基三乙酸镍琼脂糖(NiNTA agarose)亲和层析纯化，得到Mr分子量约28×103的目的蛋白(Fig 4).
图3-图4 略
3讨论
随着对BCR/ABL癌蛋白的结构和功能的不断研究，人们逐渐认识到，在不同水平对BCR/ABL癌蛋白的干预, 都可以抑制BCR/ABL蛋白酪氨酸激酶的活性.新近的研究发现BCR/ABL融合蛋白的寡聚化结构域OD区有促进CML发生的作用.以往研究表明，用插入诱变的方法破坏OD区的结构，能够明显抑制BCR/ABL蛋白的寡聚化作用，使BCR/ABL融合蛋白丧失激酶活性，进而其转化功能、诱发白血病能力大大降低[6].而SH3结构域点突变可以使其功能恢复.因此认为OD区可能通过阻断SH3介导的蛋白的自身抑制作用，从而激活BCR/ABL融合蛋白的酪氨酸激酶活性[7].OD区不仅可以作为新的药物靶点，而且新近的研究证明，干预OD区能够增加STI571的药物敏感性[8，9] .因此，我们合成OD结构域蛋白，并进一步探讨OD区蛋白对BCR/ABL融合蛋白酪氨酸激酶活性的影响，探索慢性粒细胞白血病新的治疗药物.
质粒pET16b在大肠杆菌BL21中能够高拷贝复制，并在诱导后高效表达.因表达的蛋白量过高，造成快速合成的蛋白分子来不及充分折叠，使其可溶性下降而形成包涵体，增加了纯化的难度.为简化纯化步骤和减少目的蛋白损失, 作者摸索了诱导表达条件，最后选用了非常少的IPTG用量和特定的诱导时间，降低重组目的蛋白的合成速度和总产量，使其有较充分的时间进行正确折叠.结果，大部分目的蛋白都以可溶性的表达形式存在于裂胞物的上清液中.
【参考文献】
[1] Charles L，Sawyers CL. Chronic myeloid leukemia [J]. N Engl J Med，1999；340(17)：1330-1340.
[2] Faderl S，Talpaz M，Estrov V，et al. The biology of chronic myeloid leukemia [J]. N Engl J Med，1999;165(3): 165-172.
[3] Wong S，Witte ON. Modeling Philadelphia chromosome positive leukemias[J]. Oncogene，2001；20(40)：5644-5659.
[4] Zhao X, Ghaffari S，Lodish H，et al. Structure of BCR-ABL oncoprotein oligomerization domain[J]. Nat Struct Boil，2002；9(2)：117-120.
[5] Arlinghaus RB. Bcr:A negative regulator of the BcrAbl oncoprotein in leukemia[J].Oncogene，2002；21(56)：8560-8567.
[6] McWhirter JR, Galasso DL，Wang JY. A coiledcoil oligomerization domain of Bcr is essential for the transforming function of BCR/ABL oncoproteins[J]. Mol Cell Biol，1993；13(12):7587-7595.
[7] Smith KM，Yacobi R，Van Etten RA. Autoinhibition of BCR/ABL through lts SH3 domain [J]. Mol Cell,2003；12(1):27-37.
[8] Beissert T，Puccetti E，Bianchini A，et al. Targeting of the Nterminal coiled coil oligomerization interface of BCR interferes with the transformation potential of BCRABL and increases sensitivity to STI571[J]. Blood，2003；102(8):2985-2993.
[9] Azam M，Latek RR，Daley GQ. Mechanisms of autoinhibition and STI571/lmatinib resistance revealed by mutagenesis of BCRABL[J].Cell，2003；112(6):831-843.
第四军医大学：1 唐都医院血液科， 陕西 西安710038，
2秦都口腔医学院牙体病科，
3基础部医学遗传学和发育生物学教研室，陕西 西安 710033，
4解放军323医院血液科，陕西 西安 710054
编辑王小仲, 百拇医药(叶盛开 贾洪霞 林媛 周鹏 杨曦 张萍 李军锋 李)