慢性低氧性肺动脉高压大鼠体内血管活性物质表达的变化及意义
Expressions of ANP and CGRP in plasma of rats with chronic hypoxic pulmonary hypertension and their clinical significance
PENG LiJing1, LI ZhiChao1, LI Wei2, LI ZhiBin1, YAN ZhiQiang1, ZHANG Qi1, LIU Yi1, LUO Ying1
1Department of Pathophysiology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China,
2Department of Medical Affairs, PLA 451 Hospital, Xian 710054, China
【Abstract】 AIM: To observe the expression of such vasoactive peptides as atrial natriuretic peptide (ANP) and calcitonin generelated peptide (CGRP) in the plasma of rats with chronic hypoxic pulmonary hypertension (HPH). METHODS: Twelve chronic HPH rat models were established in lowpressure and hypoxic conditions and divided evenly into 2 groups: hypoxic 2week group and hypoxic 3week group. Another 6 rats as control group were fed under normal pressure and normoxia conditions. The expressions of ANP and CGRP in the plasma of HPH rats were detected by radioimmunoassay (RIA) method. RESULTS: RIA results showed that compared with the concentrations of ANP and CGRP in plasma of control group, the concentrations of ANP and CGRP in plasma of hypoxic 2week group decreased while those of hypoxic 3week group increased. The tendency was hypoxic 3week group>control group>hypoxic 2week group. Compared with those in hypoxic 2week group, the expressions of ANP and CGRP were higher in hypoxic 3week group (P<0.05). CONCLUSION: In the process of chronic HPH, the expressions of ANP and CGRP in plasma decrease first and then increase. ANP and CGRP may play a regulative role in pulmonary hypertension and pulmonary arterial reconstruction in chronic HPH rats. There is a correlation between the lowpressure and hypoxia induced HPH and the increased ANP and CGRP in rats.
【Keywords】 hypoxic; pulmonary artery; smooth muscle; ANP; CGRP; rats
【摘要】 目的: 观察慢性低氧性肺动脉高压(HPH)大鼠血浆中心房钠尿肽(ANP)和降钙素基因相关肽(CGRP)的表达变化. 方法: 用低压、低氧的方法复制大鼠慢性HPH模型，放射免疫法检测血浆中血管活性物质ANP和CGRP表达的变化. 结果: 慢性HPH大鼠血浆中血管活性物质ANP和CGRP的表达均发生了变化，呈现先降低后增高的表现， 即低氧3 wk>正常>低氧2 wk. 结论: 在慢性HPH形成过程中，随着肺小动脉壁的增厚，血浆中血管活性物质ANP和CGRP的表达先降低后增高. 其变化可能与慢性HPH过程中肺动脉压升高和肺小动脉壁的结构重建有一定关系.
【关键词】 低氧；肺动脉；平滑肌；心房钠尿肽；降钙素基因相关肽；大鼠
0引言
低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是临床上常见的呼吸系统疾病，常继发于久居高原或胸、肺和心脏疾病. 其中，肺小血管收缩和肺小血管结构重建是其发病的基本病理过程. 急性HPH多以肺小血管收缩为主，而慢性HPH的形成是以肺小血管重建为主[1-2]. 血管活性物质心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)和降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)均是体内的舒血管因子和细胞增长的负调控因子. 我们采用放射免疫法测定ANP和CGRP在慢性HPH发生过程中的变化，以探讨慢性HPH不同阶段ANP和CGRP的水平变化及其之间的相互关系.
1材料和方法
1.1材料健康雄性SD大鼠18只(由第四军医大学实验动物中心提供)，体质量180～260 g. ANP放免药盒和CGRP放免药盒(解放军总医院科技开发中心放射免疫所)；乌拉坦(中国医药集团上海化学试剂公司).
1.2方法
1.2.1动物分组及制模将动物随机分为3组，即正常对照组、低氧2 wk组和低氧3 wk组，每组6只. 在本实验室动物房饲养2 d后给予低氧、低压处理. 正常对照组于常压常氧下饲养，低氧组采用间断性低压低氧处理，即将动物放进低压低氧舱后，3 min左右将舱内压力升至相当于海拔高度2000米，再使压力缓慢上升至相当于海拔5000米高度，使氧浓度保持在100 mL/L左右，每日持续8 h，根据实验设计分别持续2 wk(低氧2 wk组)和3 wk(低氧3 wk组).
1.2.2取材和组织准备动物在最后一次低氧完成后次日用200 g/L乌拉坦腹腔麻醉(4 mL/kg)，打开腹腔，从下腔静脉取静脉血2 mL，注入含100 g/L的EDTA二钠30 μL和抑肽酶40 μL的试管中，混匀，4℃，3000 r/min离心10 min，分离血浆，置-20℃保存. 测定前使样本置于室温或冷水中复融，再次4℃，3000 r/min离心5 min，取上清测定. 取出心脏，用纱布沾去血迹，剪去心房组织，沿室间隔边缘剪下右心室，分别称量右心室和左室加室间隔的质量，以右室质量/(左室质量+室间隔质量)[R/(L+S)]和右室质量/体质量(R/BW)来反映右心室质量的变化，确定有无右室肥厚.
1.2.3病理检查及血浆ANP，CGRP浓度测量打开动物胸腔，取左肺下部的部分组织，在生理盐水中快速漂洗去血液后，放入Bousin液中固定，其上用一小块纱布压住以保证肺组织全部浸泡在固定液中，24 h后移入700 mL/L乙醇中，梯度脱水、抽气、透明，石蜡包埋后，做成石蜡切片. 常规HE染色，显微镜下观察. 按说明书用放射免疫法测量血浆ANP，CGRP浓度.统计学处理：所有实验数据均采用x±s表示，采用SPSS 10.0统计软件处理系统进行统计分析. 各组间比较采用方差分析.
2结果
2.1右心质量变化低氧2 wk后大鼠右心质量即有明显增加，R/(L+S)和R/BW均较正常对照组增多(P<0.01). 低氧3 wk后增加更为显著，但低氧2 wk组和缺氧3 wk组之间无统计学差异(表1).
表1低氧不同时间大鼠右心质量变化(略)
2.2病理检查HE染色可见正常大鼠肺组织结构正常，肺小动脉内膜完整平滑，肌层无肥厚. 低氧2 wk后可见肺小动脉壁厚度增加，动脉壁中层肥厚，管腔出现部分狭窄. 低氧3 wk后肺小动脉壁增厚更为显著，出现明显肥厚的肌层，管腔亦明显狭窄(图1).
图1各组肺组织HE染色结果HE ×250
2.3血浆ANP，CGRP浓度低氧2 wk后大鼠血浆ANP和CGRP的浓度较正常对照组减少，但无统计学意义. 低氧3 wk后两者浓度均显著升高，与低氧2 wk组相比有统计学意义(P<0.05). 总体呈现先降低后增高的趋势(表2).
3讨论
HPH常引起严重的呼吸血流功能紊乱且治疗困难，因而一直是临床研究的重点. 本研究结果表明低氧2 wk后大鼠右心室质量即有明显改变，同时肺组织病理切片显示，低氧2 wk后肺小动脉管壁增厚，管腔部分狭窄. 低氧3 wk后变化更为显著，可见明显增厚的动脉壁中层，说明本实验模型复制成功. 在慢性HPH的形成过程中，心脏发生器质性病变，肺小动脉壁发生了细胞增殖，结构重建，肺动脉高压已经形成. 同时验证慢性低压低氧不仅造成肺血管系统功能的改变，还导致肺小动脉结构的重建.
表2低氧后大鼠血浆ANP，CGRP变化(n=6, ng/L, x±s)
组别〖〗ANP〖〗CGRP正常对照〖〗492±123〖〗79±40低氧2 wk〖〗384±83〖〗45±17低氧3 wk〖〗625±67a〖〗167±77aaP<0.05 vs低氧2 wk组. ANP: 心房钠尿肽；CGRP：降钙素基因相关肽.
ANP主要在心房合成、储存和分泌，具有较强的利钠利尿、扩血管降压、调节细胞生长和对抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)、内皮素(Endothelin，ET)和交感系统等作用. 朱妙章等[3]、吕顺艳等[4]报道ANP可以抑制多种来源细胞的增殖，尤其可以抑制低氧引起的心肌细胞过度增殖. 王培勇等[5]实验表明，低氧24 h血管内皮细胞和平滑肌细胞分泌ANP减少. CGRP是体内最强的扩血管物质之一，可以显著对抗ET的作用，起到降低血压、减少血管阻力、抑制平滑肌细胞增殖、保护心肌的作用. 李晓艳等[6]研究结果表明，CGRP可以减少人主动脉平滑肌细胞的3HTdR掺入量及DNA合成，说明CGRP可以抑制人主动脉平滑肌细胞增殖，抑制细胞周期进程. Chattergoon等[7]报道CGRP可以有效抑制PASMC增殖，并推测细胞凋亡诱导因子p53在其中可能有一定的作用.在HPH时，ANP和CGRP在血浆中的变化已引起部分学者的关注，结果不尽相同，但大多数结果表明，在肺动脉高压后期血浆中ANP和CGRP都是升高的[7-8]. 然而对于二者的动态观察却鲜有报道，本实验观察到在慢性HPH的发生发展中，ANP和CGRP在血浆中的含量呈现先降低后增高的现象，其本质是机体的一种适应代偿性机制. 在低氧刺激后，机体表现为低氧和氧分压减少，为适应这一变化，机体发生多种代偿性反应，主要表现为呼吸加深加快，从而使肺泡通气量增加. 而在循环系统则表现为心输出量增加、血流减少，静脉血掺杂，提高动脉血氧分压[9]. 肺血管的收缩和肺动脉壁的增厚与体内舒血管物质如ANP，CGRP的减少有一定的关系，推测此时舒血管物质的减少与其过度消耗有关. 至低氧3 wk时，由于低氧时间的增长，肺动脉已经发生了显著肥厚性变化，此时肺动脉压的显著增加，右心室的明显肥厚均可以刺激机体合成和分泌ANP和CGRP增多，导致二者在血浆中的浓度出现显著增高，其生理意义在于调节过高的肺动脉压力和抑制肺动脉平滑肌细胞的过度增殖. ANP和CGRP含量的变化与其合成分泌和消耗有关，低氧时血浆中ANP和CGRP含量变化的确切机制尚需进一步探讨.
【参考文献】
[1] Mehran M，YuanCheng B，Fung WH，et al. Cellular and molecular mechanisms of pulmonary vascular remodeling：role in the development of pulmonary hypertension[J]. Microvasc Res， 2004, (68)：75-103.
[2] Marc H，Nicholas WM，Stephen LA，et al. Cellular and molecular pathobiology of pulmonary arterial hypertension[J]. J Am Coll Cardiol, 2004,43(12)：13S-24S.
[3] 朱妙章，吕顺艳，于军. 血管钠肽抑制心肌增殖与机制的研究[J]. 心脏杂志，2002,14(5)：374-376.
[4] 吕顺艳，朱妙章，郭海涛，等. 血管钠肽抑制低氧诱导的心肌成纤维细胞的增殖和胶原合成[J].第四军医大学学报，2002,23(10)：884-886.
[5] 王培勇，刘健，许蜀闽，等. 缺氧对肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞分泌血管活性肽的影响[J].解放军医学杂志，1998,23(1)：32-34.
[6] 李晓艳, 黄从新，孙有刚，等. 降钙素基因相关肽对人血管平滑肌细胞增殖的抑制作用[J]. 中国病理生理杂志, 2000,16(1)：24-26.
[7] Chattergoon NN，DSouza FM，Deng W，et al. Antiproliferative effects of calcitonin generelated peptide in aortic and pulmonary artery smooth muscle cells[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005,288(1)： 202-211.
[8] 陈胜，王琳, 冯华松，等. CGRP在慢性缺氧大鼠心室的表达[J]. 细胞与分子免疫学杂志，1998,14(1)： 56.
[9] 金惠铭. 病理生理学[M]. 5版，北京：人民卫生出版社. 2001：84-87.
编辑王睿
(1第四军医大学基础部病理生理学教研室，陕西 西安 710033，2解放军第451医院医务处，陕西 西安 710054), http://www.100md.com(彭利静，李志超，李伟，李志斌，闫志强，张齐，刘毅，)
PENG LiJing1, LI ZhiChao1, LI Wei2, LI ZhiBin1, YAN ZhiQiang1, ZHANG Qi1, LIU Yi1, LUO Ying1
1Department of Pathophysiology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China,
2Department of Medical Affairs, PLA 451 Hospital, Xian 710054, China
【Abstract】 AIM: To observe the expression of such vasoactive peptides as atrial natriuretic peptide (ANP) and calcitonin generelated peptide (CGRP) in the plasma of rats with chronic hypoxic pulmonary hypertension (HPH). METHODS: Twelve chronic HPH rat models were established in lowpressure and hypoxic conditions and divided evenly into 2 groups: hypoxic 2week group and hypoxic 3week group. Another 6 rats as control group were fed under normal pressure and normoxia conditions. The expressions of ANP and CGRP in the plasma of HPH rats were detected by radioimmunoassay (RIA) method. RESULTS: RIA results showed that compared with the concentrations of ANP and CGRP in plasma of control group, the concentrations of ANP and CGRP in plasma of hypoxic 2week group decreased while those of hypoxic 3week group increased. The tendency was hypoxic 3week group>control group>hypoxic 2week group. Compared with those in hypoxic 2week group, the expressions of ANP and CGRP were higher in hypoxic 3week group (P<0.05). CONCLUSION: In the process of chronic HPH, the expressions of ANP and CGRP in plasma decrease first and then increase. ANP and CGRP may play a regulative role in pulmonary hypertension and pulmonary arterial reconstruction in chronic HPH rats. There is a correlation between the lowpressure and hypoxia induced HPH and the increased ANP and CGRP in rats.
【Keywords】 hypoxic; pulmonary artery; smooth muscle; ANP; CGRP; rats
【摘要】 目的: 观察慢性低氧性肺动脉高压(HPH)大鼠血浆中心房钠尿肽(ANP)和降钙素基因相关肽(CGRP)的表达变化. 方法: 用低压、低氧的方法复制大鼠慢性HPH模型，放射免疫法检测血浆中血管活性物质ANP和CGRP表达的变化. 结果: 慢性HPH大鼠血浆中血管活性物质ANP和CGRP的表达均发生了变化，呈现先降低后增高的表现， 即低氧3 wk>正常>低氧2 wk. 结论: 在慢性HPH形成过程中，随着肺小动脉壁的增厚，血浆中血管活性物质ANP和CGRP的表达先降低后增高. 其变化可能与慢性HPH过程中肺动脉压升高和肺小动脉壁的结构重建有一定关系.
【关键词】 低氧；肺动脉；平滑肌；心房钠尿肽；降钙素基因相关肽；大鼠
0引言
低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是临床上常见的呼吸系统疾病，常继发于久居高原或胸、肺和心脏疾病. 其中，肺小血管收缩和肺小血管结构重建是其发病的基本病理过程. 急性HPH多以肺小血管收缩为主，而慢性HPH的形成是以肺小血管重建为主[1-2]. 血管活性物质心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)和降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)均是体内的舒血管因子和细胞增长的负调控因子. 我们采用放射免疫法测定ANP和CGRP在慢性HPH发生过程中的变化，以探讨慢性HPH不同阶段ANP和CGRP的水平变化及其之间的相互关系.
1材料和方法
1.1材料健康雄性SD大鼠18只(由第四军医大学实验动物中心提供)，体质量180～260 g. ANP放免药盒和CGRP放免药盒(解放军总医院科技开发中心放射免疫所)；乌拉坦(中国医药集团上海化学试剂公司).
1.2方法
1.2.1动物分组及制模将动物随机分为3组，即正常对照组、低氧2 wk组和低氧3 wk组，每组6只. 在本实验室动物房饲养2 d后给予低氧、低压处理. 正常对照组于常压常氧下饲养，低氧组采用间断性低压低氧处理，即将动物放进低压低氧舱后，3 min左右将舱内压力升至相当于海拔高度2000米，再使压力缓慢上升至相当于海拔5000米高度，使氧浓度保持在100 mL/L左右，每日持续8 h，根据实验设计分别持续2 wk(低氧2 wk组)和3 wk(低氧3 wk组).
1.2.2取材和组织准备动物在最后一次低氧完成后次日用200 g/L乌拉坦腹腔麻醉(4 mL/kg)，打开腹腔，从下腔静脉取静脉血2 mL，注入含100 g/L的EDTA二钠30 μL和抑肽酶40 μL的试管中，混匀，4℃，3000 r/min离心10 min，分离血浆，置-20℃保存. 测定前使样本置于室温或冷水中复融，再次4℃，3000 r/min离心5 min，取上清测定. 取出心脏，用纱布沾去血迹，剪去心房组织，沿室间隔边缘剪下右心室，分别称量右心室和左室加室间隔的质量，以右室质量/(左室质量+室间隔质量)[R/(L+S)]和右室质量/体质量(R/BW)来反映右心室质量的变化，确定有无右室肥厚.
1.2.3病理检查及血浆ANP，CGRP浓度测量打开动物胸腔，取左肺下部的部分组织，在生理盐水中快速漂洗去血液后，放入Bousin液中固定，其上用一小块纱布压住以保证肺组织全部浸泡在固定液中，24 h后移入700 mL/L乙醇中，梯度脱水、抽气、透明，石蜡包埋后，做成石蜡切片. 常规HE染色，显微镜下观察. 按说明书用放射免疫法测量血浆ANP，CGRP浓度.统计学处理：所有实验数据均采用x±s表示，采用SPSS 10.0统计软件处理系统进行统计分析. 各组间比较采用方差分析.
2结果
2.1右心质量变化低氧2 wk后大鼠右心质量即有明显增加，R/(L+S)和R/BW均较正常对照组增多(P<0.01). 低氧3 wk后增加更为显著，但低氧2 wk组和缺氧3 wk组之间无统计学差异(表1).
表1低氧不同时间大鼠右心质量变化(略)
2.2病理检查HE染色可见正常大鼠肺组织结构正常，肺小动脉内膜完整平滑，肌层无肥厚. 低氧2 wk后可见肺小动脉壁厚度增加，动脉壁中层肥厚，管腔出现部分狭窄. 低氧3 wk后肺小动脉壁增厚更为显著，出现明显肥厚的肌层，管腔亦明显狭窄(图1).
图1各组肺组织HE染色结果HE ×250
2.3血浆ANP，CGRP浓度低氧2 wk后大鼠血浆ANP和CGRP的浓度较正常对照组减少，但无统计学意义. 低氧3 wk后两者浓度均显著升高，与低氧2 wk组相比有统计学意义(P<0.05). 总体呈现先降低后增高的趋势(表2).
3讨论
HPH常引起严重的呼吸血流功能紊乱且治疗困难，因而一直是临床研究的重点. 本研究结果表明低氧2 wk后大鼠右心室质量即有明显改变，同时肺组织病理切片显示，低氧2 wk后肺小动脉管壁增厚，管腔部分狭窄. 低氧3 wk后变化更为显著，可见明显增厚的动脉壁中层，说明本实验模型复制成功. 在慢性HPH的形成过程中，心脏发生器质性病变，肺小动脉壁发生了细胞增殖，结构重建，肺动脉高压已经形成. 同时验证慢性低压低氧不仅造成肺血管系统功能的改变，还导致肺小动脉结构的重建.
表2低氧后大鼠血浆ANP，CGRP变化(n=6, ng/L, x±s)
组别〖〗ANP〖〗CGRP正常对照〖〗492±123〖〗79±40低氧2 wk〖〗384±83〖〗45±17低氧3 wk〖〗625±67a〖〗167±77aaP<0.05 vs低氧2 wk组. ANP: 心房钠尿肽；CGRP：降钙素基因相关肽.
ANP主要在心房合成、储存和分泌，具有较强的利钠利尿、扩血管降压、调节细胞生长和对抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)、内皮素(Endothelin，ET)和交感系统等作用. 朱妙章等[3]、吕顺艳等[4]报道ANP可以抑制多种来源细胞的增殖，尤其可以抑制低氧引起的心肌细胞过度增殖. 王培勇等[5]实验表明，低氧24 h血管内皮细胞和平滑肌细胞分泌ANP减少. CGRP是体内最强的扩血管物质之一，可以显著对抗ET的作用，起到降低血压、减少血管阻力、抑制平滑肌细胞增殖、保护心肌的作用. 李晓艳等[6]研究结果表明，CGRP可以减少人主动脉平滑肌细胞的3HTdR掺入量及DNA合成，说明CGRP可以抑制人主动脉平滑肌细胞增殖，抑制细胞周期进程. Chattergoon等[7]报道CGRP可以有效抑制PASMC增殖，并推测细胞凋亡诱导因子p53在其中可能有一定的作用.在HPH时，ANP和CGRP在血浆中的变化已引起部分学者的关注，结果不尽相同，但大多数结果表明，在肺动脉高压后期血浆中ANP和CGRP都是升高的[7-8]. 然而对于二者的动态观察却鲜有报道，本实验观察到在慢性HPH的发生发展中，ANP和CGRP在血浆中的含量呈现先降低后增高的现象，其本质是机体的一种适应代偿性机制. 在低氧刺激后，机体表现为低氧和氧分压减少，为适应这一变化，机体发生多种代偿性反应，主要表现为呼吸加深加快，从而使肺泡通气量增加. 而在循环系统则表现为心输出量增加、血流减少，静脉血掺杂，提高动脉血氧分压[9]. 肺血管的收缩和肺动脉壁的增厚与体内舒血管物质如ANP，CGRP的减少有一定的关系，推测此时舒血管物质的减少与其过度消耗有关. 至低氧3 wk时，由于低氧时间的增长，肺动脉已经发生了显著肥厚性变化，此时肺动脉压的显著增加，右心室的明显肥厚均可以刺激机体合成和分泌ANP和CGRP增多，导致二者在血浆中的浓度出现显著增高，其生理意义在于调节过高的肺动脉压力和抑制肺动脉平滑肌细胞的过度增殖. ANP和CGRP含量的变化与其合成分泌和消耗有关，低氧时血浆中ANP和CGRP含量变化的确切机制尚需进一步探讨.
【参考文献】
[1] Mehran M，YuanCheng B，Fung WH，et al. Cellular and molecular mechanisms of pulmonary vascular remodeling：role in the development of pulmonary hypertension[J]. Microvasc Res， 2004, (68)：75-103.
[2] Marc H，Nicholas WM，Stephen LA，et al. Cellular and molecular pathobiology of pulmonary arterial hypertension[J]. J Am Coll Cardiol, 2004,43(12)：13S-24S.
[3] 朱妙章，吕顺艳，于军. 血管钠肽抑制心肌增殖与机制的研究[J]. 心脏杂志，2002,14(5)：374-376.
[4] 吕顺艳，朱妙章，郭海涛，等. 血管钠肽抑制低氧诱导的心肌成纤维细胞的增殖和胶原合成[J].第四军医大学学报，2002,23(10)：884-886.
[5] 王培勇，刘健，许蜀闽，等. 缺氧对肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞分泌血管活性肽的影响[J].解放军医学杂志，1998,23(1)：32-34.
[6] 李晓艳, 黄从新，孙有刚，等. 降钙素基因相关肽对人血管平滑肌细胞增殖的抑制作用[J]. 中国病理生理杂志, 2000,16(1)：24-26.
[7] Chattergoon NN，DSouza FM，Deng W，et al. Antiproliferative effects of calcitonin generelated peptide in aortic and pulmonary artery smooth muscle cells[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005,288(1)： 202-211.
[8] 陈胜，王琳, 冯华松，等. CGRP在慢性缺氧大鼠心室的表达[J]. 细胞与分子免疫学杂志，1998,14(1)： 56.
[9] 金惠铭. 病理生理学[M]. 5版，北京：人民卫生出版社. 2001：84-87.
编辑王睿
(1第四军医大学基础部病理生理学教研室，陕西 西安 710033，2解放军第451医院医务处，陕西 西安 710054), http://www.100md.com(彭利静，李志超，李伟，李志斌，闫志强，张齐，刘毅，)