罗红霉素对LPS诱导的肺泡巨噬细胞NFκB活化及对TNFα，IL10释放的影响
【Abstract】 AIM: To evaluate the effects of roxithromycin on the activation of nuclear factorκB (NFκB) and the expression of tumor necrosis factorα(TNFα) and Interleukin10 (IL10) in pulmonary alveolar macrophages (PAM) induced by lipopolysaccharide (LPS). METHODS: PAM were collected from bronchoalveolar lavage fluid and cultured, and then they were divided into 3 groups: normal control group, model group (LPS 10 mg/L) and roxithromycin treatment group (roxithromycin 20 mg/L and LPS 10 mg/L). The activity of NFκB and the concentration of TNFα and IL10 in the supernatant were measured by electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and radioimmunoassay (RIA) respectively. RESULTS: The activity of NFκB in model group was higher than that in normal group. After roxithromycin treatment, the NFκB activity was higher than that in normal control group(P<0.05), but lower than that in model group(P<0.05). The concentration of TNFα in model group after exposure to LPS was higher than that in normal group. Compared with that in model group, TNFα in roxithromycin treatment group decreased significantly (P<0.05). The correlation between the activity of NFκB and the concentration of TNFα was significant (r=0.684, P<0.01). In model group, the concentration of IL10 augmented compared with that in normal group (P<0.05) and there was no effect on expression of IL10 after roxithromycin treatment (P>0.05). The ratio of TNFα and IL10 in normal group and roxithromycin treatment group remained constant, while the ratio in model group changed with the culture prolongation. CONCLUSION: Based on these results, we conclude that when PAM is stimulated by LPS, NFκB in the PAM will be activated, which can lead to transcription and expression of many inflammatory cytokine such as TNFα and antiinflammatory cytokine such as IL10. The equilibrium of inflammation and antiinflammation will be broken. Roxithromycin can regualte the ratio of TNFα and IL10 and decrease the concentration of TNFα by inhibiting the activation of NFκB to protect the lung from LPSinduced injury.
【Keywords】 pulmonary alveolar macrophages; nuclear factorκB; tumor necrosis factorα; interleukin10; roxithromycin
【摘要】 目的：探讨罗红霉素(RM)对内毒素(LPS)诱导下肺泡巨噬细胞(PAM)核因子κB(NFκB)活化及对肿瘤坏死因子α(TNFα)和IL10表达的调节作用. 方法：收集大鼠支气管肺泡灌洗液中PAM进行培养，分为正常对照组、模型组和RM治疗组. 用凝胶电泳迁移率改变分析(EMSA)法和放射免疫法分别测定各组核提取物中NFκB活性和细胞培养上清中TNFα，IL10含量. 结果：模型组NFκB活性明显高于正常对照组，用RM干预后NFκB活性高于正常对照组(P<0.05)，但比模型组低(P<0.05). LPS刺激1~4 h内TNFα含量高于正常对照组；RM(20 mg/L) 能够抑制培养上清液中TNFα的升高(P<0.05). NFκB活性与TNFα浓度有相关性(r=0.684，P<0.01). LPS刺激在观察早期IL10高于正常对照组(P<0.05)，使用RM干预后IL10无明显变化(P>0.05). 正常对照组与治疗组TNFα/IL10比值在观察期间无明显上升和下降，模型组TNFα/IL10比值变化明显. 结论：RM可能通过PAM NFκB活化的抑制，减少了TNFα的释放，调节TNFα/IL10的比例，对LPS诱导的急性肺损伤模型有保护作用.
【关键词】 肺泡巨噬细胞；核因子κB；肿瘤坏死因子α；白细胞介素10；罗红霉素
0引言
内毒素(LPS)诱导的急性肺损伤炎症早期，肺泡腔的炎性细胞以巨噬细胞为主. 肺泡巨噬细胞(PAM)释放TNFα等前炎症介质，引发失控性炎症反应，同时也释放以IL10等为主的炎症抑制因子，对炎症反应起调节作用[1]. 如果机体前炎症细胞因子大量释放，超过抗炎症因子调节能力，必然打破前炎症因子与抗炎症因子平衡，对机体造成炎性损伤. TNFα，L10等前炎症和抗炎因子通过NFκB的活化调节炎症反应[2]. 罗红霉素(roxithromycin, RM)是新型大环内酯类抗生素，不仅有抗菌作用，也有调节细胞因子，抑制无菌性炎症的作用[3]. RM对急性肺损伤发病过程中的炎症是否有作用？我们旨在探讨RM对PAM的NFκB活化及PAM合成分泌炎症细胞因子的影响及其机制.
1材料和方法
1.1材料健康SD大鼠40只，体质量(250±30) g，雌雄不限，由第四军医大学实验动物中心提供. 大肠杆菌脂多糖(LPS)为美国Sigma公司产品；RM(法国RousselVelaf公司)；TNFα放射免疫试剂盒和IL10放射免疫试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免所)；DNA聚合酶I klenow大片段(华美公司产品)γ32P dATP(亚辉公司产品).
1.2方法大鼠乌拉坦腹腔注射麻醉后，生理盐水灌洗肺并收集肺泡灌洗液，将灌洗液离心，沉淀细胞并悬浮于含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37℃，50 mL/L CO2孵箱培养2 h，收集贴壁PAM. 用瑞氏染色证实为巨噬细胞，纯度≥90%；苔盼蓝染色鉴定细胞活率≥95%. 将PAM接种于24孔培养板，每孔细胞数为1×106. 将细胞分为①正常对照组(N)：PAM中加无菌生理盐水；②模型组(M)：LPS 10 mg/L刺激PAM；③RM低剂量组(R1)：给予2 mg/L RM和LPS 10 mg/L同时刺激PAM；④RM中剂量组(R2)：PAM中加入LPS 10 mg/L和RM 20 mg/L同时刺激PAM；⑤RM高剂量组(R3)：给予RM 200 mg/L 和LPS 10 mg/L同时刺激PAM. 分别于刺激前(0 h)，刺激后(1，2，3，4 h)留取细胞及细胞培养上清，每个时点和实验组取4个复孔.
1.2.1NFκB活性检测参照文献[4]方法制备PAM细胞核提取物，Bradford法测定蛋白浓度；含κB序列(5′AGCTTCAGAGGGGACTTTCCGAGAGG3′ , 3′AGTCTCCCCTGAAAGGCTCTCCAGCT5′)的两条寡核苷酸单链由TaKaRa公司合成，退火后结合成双链探针，在DNA聚合酶I klenow大片段催化下，用γ32P dATP标记探针3′端，纯化后用凝胶电泳迁移率改变分析(EMSA)法测定NFκB的活性.
1.2.2培养上清中TNFα，IL10含量测定用放射免疫法(RIA)并参照TNFα，IL10试剂盒说明进行TNF，IL10含量测定. 将不同时间点的TNFα与IL10比值作为一个参数，观测其变化趋势.
统计学处理: 实验数据以x±s表示，用SPSS统计软件进行分析，方差齐时用方差分析(组间两两比较采用SNKq检验)，方差不齐时用秩和检验.
2结果
2.1PAM培养上清液中的TNFα含量LPS刺激后1～4 h内TNFα含量比正常组有明显上升，尤在刺激后1 h达高峰(P<0.05). 与模型组相比，R1组PAM细胞培养上清液中的TNFα无明显差异(P>0.05)，但仍明显高于正常组；R2组PAM细胞培养上清液中TNFα 1 h时下降[(21.7±2.1) μg/L vs (35.5±2.2) μg/L，P<0.05]，2 h时与模型组无明显差异；而3，4 h时TNFα水平与模型组相比浓度显著降(Fig 1).
图1PAM细胞培养上清液中TNFα的浓度 (略)
2.2PAM培养上清液中的IL10含量LPS刺激PAM 1，2，3和4 h后上清液中的IL10含量明显高于正常组(P<0.05). R1组IL10在1，2，3和4 h时与模型组无明显差异，但高于正常组(P<0.05). R2组与正常组相比，IL10在1，2 h明显高于正常组，3，4 h与正常组无明显差异. R3组与正常相比，IL10在1，2和3 h明显高于正常组(P<0.05)，4 h时R3组于正常组无明显差别(Tab 1).
2.3PAM NFκB活性变化LPS作用后1～4 h内NFκB活性均明显高于对照组，尤在1 h达高峰，平均值从(8.7±0.4)升至(36.9±0.9, P<0.05)，NFκB在2，3和4 h持续保持高水平，明显高于正常组(P<0.01，Tab 2).
表1PAM培养上清液中IL10含量 (略)
表2各组PAM核中NFκB活性变化 (略)
2.4PAM上清液中TNFα，IL10与NFκB活性的相关性将不同时间的PAM细胞NFκB相对活性与相对应的PAM上清液中的TNFα作相关分析，经SPSS软件Pearson相关分析相关系数为r=0.684，P<0.01，说明各组PAM细胞的NFκB活性与PAM上清液中TNFα浓度有显著相关性，回归方程为：y=9.224x+0.623(n=8)；同理，将不同时间的PAM细胞NFκB相应的活性与PAM上清液中的IL10作相关分析，经SPSS Pearson相关分析相关系数为r=0.794, P>0.05，各组PAM细胞的NFκB活性与PAM上清液中IL10浓度无显著相关性.
2.5PAM上清液中TNFα/IL10的变化正常组TNFα/IL10比值在4 h内保持在3左右，无明显上升和下降；模型组随着培养时间的延长TNFα/IL10比值上升，3 h达到最大，4 h时略有降低(Fig 2).
3讨论
PAM是肺泡腔内的常驻巨噬细胞，广泛分布于
图2各组PAM上清液中TNFα/IL10的比值变化 (略)
肺泡内及气道内，是肺部防御病源微生物和损伤的第一道防线，在急性肺损伤(ALI)的早期发病中起着重要角色. 有研究表明以10 mg/L LPS刺激细胞，能达到炎性细胞因子的最佳表达效果[5]. 致炎因子刺激效应细胞使细胞质内NFκB活化而发生核易位，其与核内的目的基因启动子或增强子上游特定κB位点结合，启动和调控一系列参与炎症反应的炎症因子表达[6]. 我们以LPS刺激细胞后，用γ32P dATP标记含κB片段的探针，此特异片段与NFκB结合活性强，经过放射自显影，用激光扫描成像系统测定相对密度均值即可反应NFκB的活性.
在ALI早期，TNFα是引起多种促炎细胞因子和炎症介质失控性释放的重要细胞因子，在ALI/ARDS炎症反应早期起关键性作用[2]，IL10曾被定义为“巨噬细胞灭活因子”，能抑制巨噬细胞抗原提呈，抑制巨噬细胞活化及继发的细胞免疫反应，对巨噬细胞细胞因子的合成与功能有广泛的抑制作用，同时IL10作为一种免疫抑制因子，可以抑制多种细胞合成炎症介质，具有强有力的抗炎作用[7]. 我们的研究显示,LPS刺激PAM后，细胞培养上清中TNFα含量显著升高，在刺激后1 h达高峰，同时观察到核内NFκB活性也明显增高，两者在峰值水平有明显相关性，表面LPS刺激体外PAM，可引起TNFα的大量释放，并有PAM NFκB的明显激活. 我们的实验表明LPS致PAM大量释放TNFα引发ALI早期炎症反应的机制与LPS的刺激可活化PAM中NFκB有关，上调TNFα基因转录与蛋白合成，从而激发逐级放大的瀑布样链锁反应. 由于LPS是ALI的主要诱发因素之一，故NFκB的活化可能在ALI的始发阶段具有重要作用. IL10是一个有力的抗炎因子，其抑制单核/巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞产生TNFα，IL1β，IL6，也抑制活化的中性粒细胞的趋化性；IL10抑制活化的单核细胞，粒细胞产生GMCSF，GCSF限制中性粒细胞的产生，抑制巨噬细胞产生氧自由基和金属蛋白酶，减少对组织细胞的损害[7]. 我们发现在LPS诱导PAM培养上清液中IL10在实验进行的1~4 h内明显升高，表明抗炎反应也被激活，通过TNFα/IL10作为反映炎症平衡的指标观察，我们发现虽然前炎症细胞因子和抗炎症细胞因子在ALI发病过程中均增高，但并非它们是同步增高，在ALI发病之初，由前炎症细胞较抗炎症细胞升高更为明显，使促炎反应占优，机体表现为过度炎症反应，随着促炎因素的作用，使机体炎症损伤出现和加重，导致出现一系列的病理生理改变.
有文献报道大环内酯类抗生素除了作用于细菌细胞70S核糖体50S亚单位，抑制细菌细胞内的蛋白质合成而发挥广泛的抑菌作用、促进胃动力、增强胃排空作用[3]. 最近发现大环内酯类还具有调节炎症反应的作用，而在ALI发病过程中炎症反应占很重要的地位，而其对炎症的调节机制研究不多，看法也各不相同. 周向东等[8]采用预先给予大环内酯抗生素可显著减少LPS损伤中多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte，PMN)的扣押量，并显著促进BALF中PMN的凋亡. 大环内酯类抗生素通过促进PMN的凋亡发挥抗炎作用. RM对LPS所致大鼠肺损伤后出现的肺系数增加，肺间质和肺泡水肿有影响，表现为肺系数下降，肺组织病理改变减轻 [9]，Takizawa等[10]认为红霉素通过抑制IL6 mRNA的转录及IL6的表达发挥抗炎作用，但对血浆中TNFα和IL10等其他炎症细胞因子的作用及机制并未提及. 我们用不同剂量的RM和LPS同时刺激PAM，结果提示：RM可部分抑制NFκB的活化，而从基因转录水平减少了TNFα的合成与释放. 本实验显示中剂量的RM能明显减轻LPS对 PAM的刺激，使TNFα的释放显著减少，而且NFκB可能是RM抑制TNFα转录的细胞内靶因子之一. 用LPS刺激的PAM上清液中IL10含量与N组相比在1，2 h略有升高(P<0.05)，但与L组无明显差别(P>0.05)，3 h后IL10有所降低. 中、高剂量RM治疗组IL10与TNFα的比率曲线与N组差别不明显，这也说明RM通过抑制NFκB的活性抑制炎症介质TNFα，因而RM可以将PAM由LPS作用下的促炎占优调节至TNFα与IL10相对平衡，对LPS诱导的急性肺损伤有保护作用.
【参考文献】
[1] Bone RC. Sir Isaac Newton, sepsis, SIRS, and CARS[J]. Crit Care Med, 1996; 24(7): 1125-1128.
[2] 郭振辉, 洪新, 毛宝龄, 等. 核因子κB活化在脓毒症急性肺损伤发病中的作用[J]. 中国危重急救医学, 2000; 12(6):334-337.Guo ZH, Hong X, Mao BL, et al. The role of nuclear factorκB activation in acute lung injury induced by sepsis[J]. Chin Critical Care Med, 2000;12(6):334-337.
[3] Coulie B, Tack J, Peeters T, et al. Involvement of two different pathways in the motor effects of erythromycin on the gastric antrum in humans[J]. Gut, 1998; 43(3):395-400.
[4] Schreiber E, Matthias P, Miller MM, et al. Rapid detection of octamer binding proteins with "miniextracts" prepared from small number of cells[J]. Nucleic Acide Res, 1989; 17:6419.
[5] Allen JN, Herzyek DJ, Allen ED, et al. Human whole blood interleukin1β production, kinetics, cell source and comparison with TNFα[J]. J Lab Clin Med, 1992; 119:538-546.
[6] Ulrike Z, Ralf S, Patrick A, et al. DNA binding of purified transcription factor NFκB[J]. J Biological Chemistry, 1991; 266(1):252-260.
[7] 邱洪波, 周韶霞, 陈德昌. 白介素10对肺泡巨噬细胞致炎效应的调节作用[J]. 中国危重急救医学, 2000; 12(16):353-355.
Qiu HB, Zhou SX, Chen DC. Effect of interleukin10 on inflammatory response by alveolar macrophages in mice[J]. Chin Critical Care Med, 2000;12(16):353-355.
[8] 周向东, 黄勇. 大环内酯抗生素促进急性肺损伤组织中性粒细胞凋亡的研究[J]. 中华创伤杂志, 1998; 14(3):160-162.
Zhou XD, Huang Y. Neutrophil apoptosis accelerated by macrolides in acutely injured pulmonary tissue[J]. Chin J Traumatol, 1998; 14(3):160-162.
[9] 王晓斌, 李志超, 贾斌,等. 罗红霉素对内毒素性急性肺损伤的保护作用[J]. 第四军医大学学报, 2002; 23(13):1181-1183.
Wang XB, Li ZC, Jia B, et al. Protective effects of roxithromycin on acute lung injury induced by lipopolysaccharide in rat[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2002; 23(13):1181-1183.
[10] Takizawa H, Desaki M, Ohtoshi T, et al. Erythromycin and clarithromycin attenuate cytokineinduced endothelin1 expression in human bronchial epithelial cells[J]. Eur Respir J, 1998; 12(1):57-63.
第四军医大学基础部病理生理学教研室，陕西 西安 710033
编辑王睿, 百拇医药(王晓斌 贾斌 赵澎涛 董明清 张莉莉 刘毅 林树新)
【Keywords】 pulmonary alveolar macrophages; nuclear factorκB; tumor necrosis factorα; interleukin10; roxithromycin
【摘要】 目的：探讨罗红霉素(RM)对内毒素(LPS)诱导下肺泡巨噬细胞(PAM)核因子κB(NFκB)活化及对肿瘤坏死因子α(TNFα)和IL10表达的调节作用. 方法：收集大鼠支气管肺泡灌洗液中PAM进行培养，分为正常对照组、模型组和RM治疗组. 用凝胶电泳迁移率改变分析(EMSA)法和放射免疫法分别测定各组核提取物中NFκB活性和细胞培养上清中TNFα，IL10含量. 结果：模型组NFκB活性明显高于正常对照组，用RM干预后NFκB活性高于正常对照组(P<0.05)，但比模型组低(P<0.05). LPS刺激1~4 h内TNFα含量高于正常对照组；RM(20 mg/L) 能够抑制培养上清液中TNFα的升高(P<0.05). NFκB活性与TNFα浓度有相关性(r=0.684，P<0.01). LPS刺激在观察早期IL10高于正常对照组(P<0.05)，使用RM干预后IL10无明显变化(P>0.05). 正常对照组与治疗组TNFα/IL10比值在观察期间无明显上升和下降，模型组TNFα/IL10比值变化明显. 结论：RM可能通过PAM NFκB活化的抑制，减少了TNFα的释放，调节TNFα/IL10的比例，对LPS诱导的急性肺损伤模型有保护作用.
【关键词】 肺泡巨噬细胞；核因子κB；肿瘤坏死因子α；白细胞介素10；罗红霉素
0引言
内毒素(LPS)诱导的急性肺损伤炎症早期，肺泡腔的炎性细胞以巨噬细胞为主. 肺泡巨噬细胞(PAM)释放TNFα等前炎症介质，引发失控性炎症反应，同时也释放以IL10等为主的炎症抑制因子，对炎症反应起调节作用[1]. 如果机体前炎症细胞因子大量释放，超过抗炎症因子调节能力，必然打破前炎症因子与抗炎症因子平衡，对机体造成炎性损伤. TNFα，L10等前炎症和抗炎因子通过NFκB的活化调节炎症反应[2]. 罗红霉素(roxithromycin, RM)是新型大环内酯类抗生素，不仅有抗菌作用，也有调节细胞因子，抑制无菌性炎症的作用[3]. RM对急性肺损伤发病过程中的炎症是否有作用？我们旨在探讨RM对PAM的NFκB活化及PAM合成分泌炎症细胞因子的影响及其机制.
1材料和方法
1.1材料健康SD大鼠40只，体质量(250±30) g，雌雄不限，由第四军医大学实验动物中心提供. 大肠杆菌脂多糖(LPS)为美国Sigma公司产品；RM(法国RousselVelaf公司)；TNFα放射免疫试剂盒和IL10放射免疫试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免所)；DNA聚合酶I klenow大片段(华美公司产品)γ32P dATP(亚辉公司产品).
1.2方法大鼠乌拉坦腹腔注射麻醉后，生理盐水灌洗肺并收集肺泡灌洗液，将灌洗液离心，沉淀细胞并悬浮于含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37℃，50 mL/L CO2孵箱培养2 h，收集贴壁PAM. 用瑞氏染色证实为巨噬细胞，纯度≥90%；苔盼蓝染色鉴定细胞活率≥95%. 将PAM接种于24孔培养板，每孔细胞数为1×106. 将细胞分为①正常对照组(N)：PAM中加无菌生理盐水；②模型组(M)：LPS 10 mg/L刺激PAM；③RM低剂量组(R1)：给予2 mg/L RM和LPS 10 mg/L同时刺激PAM；④RM中剂量组(R2)：PAM中加入LPS 10 mg/L和RM 20 mg/L同时刺激PAM；⑤RM高剂量组(R3)：给予RM 200 mg/L 和LPS 10 mg/L同时刺激PAM. 分别于刺激前(0 h)，刺激后(1，2，3，4 h)留取细胞及细胞培养上清，每个时点和实验组取4个复孔.
1.2.1NFκB活性检测参照文献[4]方法制备PAM细胞核提取物，Bradford法测定蛋白浓度；含κB序列(5′AGCTTCAGAGGGGACTTTCCGAGAGG3′ , 3′AGTCTCCCCTGAAAGGCTCTCCAGCT5′)的两条寡核苷酸单链由TaKaRa公司合成，退火后结合成双链探针，在DNA聚合酶I klenow大片段催化下，用γ32P dATP标记探针3′端，纯化后用凝胶电泳迁移率改变分析(EMSA)法测定NFκB的活性.
1.2.2培养上清中TNFα，IL10含量测定用放射免疫法(RIA)并参照TNFα，IL10试剂盒说明进行TNF，IL10含量测定. 将不同时间点的TNFα与IL10比值作为一个参数，观测其变化趋势.
统计学处理: 实验数据以x±s表示，用SPSS统计软件进行分析，方差齐时用方差分析(组间两两比较采用SNKq检验)，方差不齐时用秩和检验.
2结果
2.1PAM培养上清液中的TNFα含量LPS刺激后1～4 h内TNFα含量比正常组有明显上升，尤在刺激后1 h达高峰(P<0.05). 与模型组相比，R1组PAM细胞培养上清液中的TNFα无明显差异(P>0.05)，但仍明显高于正常组；R2组PAM细胞培养上清液中TNFα 1 h时下降[(21.7±2.1) μg/L vs (35.5±2.2) μg/L，P<0.05]，2 h时与模型组无明显差异；而3，4 h时TNFα水平与模型组相比浓度显著降(Fig 1).
图1PAM细胞培养上清液中TNFα的浓度 (略)
2.2PAM培养上清液中的IL10含量LPS刺激PAM 1，2，3和4 h后上清液中的IL10含量明显高于正常组(P<0.05). R1组IL10在1，2，3和4 h时与模型组无明显差异，但高于正常组(P<0.05). R2组与正常组相比，IL10在1，2 h明显高于正常组，3，4 h与正常组无明显差异. R3组与正常相比，IL10在1，2和3 h明显高于正常组(P<0.05)，4 h时R3组于正常组无明显差别(Tab 1).
2.3PAM NFκB活性变化LPS作用后1～4 h内NFκB活性均明显高于对照组，尤在1 h达高峰，平均值从(8.7±0.4)升至(36.9±0.9, P<0.05)，NFκB在2，3和4 h持续保持高水平，明显高于正常组(P<0.01，Tab 2).
表1PAM培养上清液中IL10含量 (略)
表2各组PAM核中NFκB活性变化 (略)
2.4PAM上清液中TNFα，IL10与NFκB活性的相关性将不同时间的PAM细胞NFκB相对活性与相对应的PAM上清液中的TNFα作相关分析，经SPSS软件Pearson相关分析相关系数为r=0.684，P<0.01，说明各组PAM细胞的NFκB活性与PAM上清液中TNFα浓度有显著相关性，回归方程为：y=9.224x+0.623(n=8)；同理，将不同时间的PAM细胞NFκB相应的活性与PAM上清液中的IL10作相关分析，经SPSS Pearson相关分析相关系数为r=0.794, P>0.05，各组PAM细胞的NFκB活性与PAM上清液中IL10浓度无显著相关性.
2.5PAM上清液中TNFα/IL10的变化正常组TNFα/IL10比值在4 h内保持在3左右，无明显上升和下降；模型组随着培养时间的延长TNFα/IL10比值上升，3 h达到最大，4 h时略有降低(Fig 2).
3讨论
PAM是肺泡腔内的常驻巨噬细胞，广泛分布于
图2各组PAM上清液中TNFα/IL10的比值变化 (略)
肺泡内及气道内，是肺部防御病源微生物和损伤的第一道防线，在急性肺损伤(ALI)的早期发病中起着重要角色. 有研究表明以10 mg/L LPS刺激细胞，能达到炎性细胞因子的最佳表达效果[5]. 致炎因子刺激效应细胞使细胞质内NFκB活化而发生核易位，其与核内的目的基因启动子或增强子上游特定κB位点结合，启动和调控一系列参与炎症反应的炎症因子表达[6]. 我们以LPS刺激细胞后，用γ32P dATP标记含κB片段的探针，此特异片段与NFκB结合活性强，经过放射自显影，用激光扫描成像系统测定相对密度均值即可反应NFκB的活性.
在ALI早期，TNFα是引起多种促炎细胞因子和炎症介质失控性释放的重要细胞因子，在ALI/ARDS炎症反应早期起关键性作用[2]，IL10曾被定义为“巨噬细胞灭活因子”，能抑制巨噬细胞抗原提呈，抑制巨噬细胞活化及继发的细胞免疫反应，对巨噬细胞细胞因子的合成与功能有广泛的抑制作用，同时IL10作为一种免疫抑制因子，可以抑制多种细胞合成炎症介质，具有强有力的抗炎作用[7]. 我们的研究显示,LPS刺激PAM后，细胞培养上清中TNFα含量显著升高，在刺激后1 h达高峰，同时观察到核内NFκB活性也明显增高，两者在峰值水平有明显相关性，表面LPS刺激体外PAM，可引起TNFα的大量释放，并有PAM NFκB的明显激活. 我们的实验表明LPS致PAM大量释放TNFα引发ALI早期炎症反应的机制与LPS的刺激可活化PAM中NFκB有关，上调TNFα基因转录与蛋白合成，从而激发逐级放大的瀑布样链锁反应. 由于LPS是ALI的主要诱发因素之一，故NFκB的活化可能在ALI的始发阶段具有重要作用. IL10是一个有力的抗炎因子，其抑制单核/巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞产生TNFα，IL1β，IL6，也抑制活化的中性粒细胞的趋化性；IL10抑制活化的单核细胞，粒细胞产生GMCSF，GCSF限制中性粒细胞的产生，抑制巨噬细胞产生氧自由基和金属蛋白酶，减少对组织细胞的损害[7]. 我们发现在LPS诱导PAM培养上清液中IL10在实验进行的1~4 h内明显升高，表明抗炎反应也被激活，通过TNFα/IL10作为反映炎症平衡的指标观察，我们发现虽然前炎症细胞因子和抗炎症细胞因子在ALI发病过程中均增高，但并非它们是同步增高，在ALI发病之初，由前炎症细胞较抗炎症细胞升高更为明显，使促炎反应占优，机体表现为过度炎症反应，随着促炎因素的作用，使机体炎症损伤出现和加重，导致出现一系列的病理生理改变.
有文献报道大环内酯类抗生素除了作用于细菌细胞70S核糖体50S亚单位，抑制细菌细胞内的蛋白质合成而发挥广泛的抑菌作用、促进胃动力、增强胃排空作用[3]. 最近发现大环内酯类还具有调节炎症反应的作用，而在ALI发病过程中炎症反应占很重要的地位，而其对炎症的调节机制研究不多，看法也各不相同. 周向东等[8]采用预先给予大环内酯抗生素可显著减少LPS损伤中多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte，PMN)的扣押量，并显著促进BALF中PMN的凋亡. 大环内酯类抗生素通过促进PMN的凋亡发挥抗炎作用. RM对LPS所致大鼠肺损伤后出现的肺系数增加，肺间质和肺泡水肿有影响，表现为肺系数下降，肺组织病理改变减轻 [9]，Takizawa等[10]认为红霉素通过抑制IL6 mRNA的转录及IL6的表达发挥抗炎作用，但对血浆中TNFα和IL10等其他炎症细胞因子的作用及机制并未提及. 我们用不同剂量的RM和LPS同时刺激PAM，结果提示：RM可部分抑制NFκB的活化，而从基因转录水平减少了TNFα的合成与释放. 本实验显示中剂量的RM能明显减轻LPS对 PAM的刺激，使TNFα的释放显著减少，而且NFκB可能是RM抑制TNFα转录的细胞内靶因子之一. 用LPS刺激的PAM上清液中IL10含量与N组相比在1，2 h略有升高(P<0.05)，但与L组无明显差别(P>0.05)，3 h后IL10有所降低. 中、高剂量RM治疗组IL10与TNFα的比率曲线与N组差别不明显，这也说明RM通过抑制NFκB的活性抑制炎症介质TNFα，因而RM可以将PAM由LPS作用下的促炎占优调节至TNFα与IL10相对平衡，对LPS诱导的急性肺损伤有保护作用.
【参考文献】
[1] Bone RC. Sir Isaac Newton, sepsis, SIRS, and CARS[J]. Crit Care Med, 1996; 24(7): 1125-1128.
[2] 郭振辉, 洪新, 毛宝龄, 等. 核因子κB活化在脓毒症急性肺损伤发病中的作用[J]. 中国危重急救医学, 2000; 12(6):334-337.Guo ZH, Hong X, Mao BL, et al. The role of nuclear factorκB activation in acute lung injury induced by sepsis[J]. Chin Critical Care Med, 2000;12(6):334-337.
[3] Coulie B, Tack J, Peeters T, et al. Involvement of two different pathways in the motor effects of erythromycin on the gastric antrum in humans[J]. Gut, 1998; 43(3):395-400.
[4] Schreiber E, Matthias P, Miller MM, et al. Rapid detection of octamer binding proteins with "miniextracts" prepared from small number of cells[J]. Nucleic Acide Res, 1989; 17:6419.
[5] Allen JN, Herzyek DJ, Allen ED, et al. Human whole blood interleukin1β production, kinetics, cell source and comparison with TNFα[J]. J Lab Clin Med, 1992; 119:538-546.
[6] Ulrike Z, Ralf S, Patrick A, et al. DNA binding of purified transcription factor NFκB[J]. J Biological Chemistry, 1991; 266(1):252-260.
[7] 邱洪波, 周韶霞, 陈德昌. 白介素10对肺泡巨噬细胞致炎效应的调节作用[J]. 中国危重急救医学, 2000; 12(16):353-355.
Qiu HB, Zhou SX, Chen DC. Effect of interleukin10 on inflammatory response by alveolar macrophages in mice[J]. Chin Critical Care Med, 2000;12(16):353-355.
[8] 周向东, 黄勇. 大环内酯抗生素促进急性肺损伤组织中性粒细胞凋亡的研究[J]. 中华创伤杂志, 1998; 14(3):160-162.
Zhou XD, Huang Y. Neutrophil apoptosis accelerated by macrolides in acutely injured pulmonary tissue[J]. Chin J Traumatol, 1998; 14(3):160-162.
[9] 王晓斌, 李志超, 贾斌,等. 罗红霉素对内毒素性急性肺损伤的保护作用[J]. 第四军医大学学报, 2002; 23(13):1181-1183.
Wang XB, Li ZC, Jia B, et al. Protective effects of roxithromycin on acute lung injury induced by lipopolysaccharide in rat[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2002; 23(13):1181-1183.
[10] Takizawa H, Desaki M, Ohtoshi T, et al. Erythromycin and clarithromycin attenuate cytokineinduced endothelin1 expression in human bronchial epithelial cells[J]. Eur Respir J, 1998; 12(1):57-63.
第四军医大学基础部病理生理学教研室，陕西 西安 710033
编辑王睿, 百拇医药(王晓斌 贾斌 赵澎涛 董明清 张莉莉 刘毅 林树新)