中药复方消癌根对肿瘤生长的影响
材料与方法
一、实验动物 昆明种小鼠60只，4～6周龄，体重18～22g，雄性，购于南方医科大学动物中心。分笼饲养，自由摄食、饮水，鼠房保持通风。
二、细胞株 细胞株为小鼠腹水型肝癌细胞株A180细胞，皮下接种可生成肉瘤。购于中山医科大学肿瘤研究所，常规复苏传代培养。
三、主要药物、试剂和仪器
纯中药复方消癌根，由董草原医生提供。
环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号02071121。
PCNA一抗：武汉博士德生物工程有限公司产品；VEGF一抗：武汉博士德生物工程有限公司产品；生物素化兔抗山羊二抗试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司产品。
, 百拇医药
试剂盒中内容：
H2O2浓缩液 4ml
封闭液Ⅰ 既用型 4ml
封闭液Ⅱ 既用型 4ml
生物素化兔抗山羊IgG 既用型 4ml
抗原冷修复液 既用型 4ml
DAB显色剂试剂盒武汉博士德生物工程有限公司产品
试剂盒中内容：
显色剂A DAB×20 3ml
显色剂B H2O2×20 3ml
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显色剂C TBS×20 3ml
四、主要溶液的配制：
0.01MPBS缓冲液(pH7.2～7.4)：1000ml双蒸水中，加氯化钠9g，NaH2PO4·12H2O
6g，NaH2PO4·2H2O 0.4g，调整pH值至7.2～7.4。
0.1M枸橼酸冲液(pH6.0)：1000ml双蒸水中加枸橼酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)3g，枸橼酸(C6H8O7
3% H2O2甲醇或0.01MPBS，97ml加入3ml市售的30% H2O2既得3% H2O2。
五、消癌根药液的制备(同第一部分)
, http://www.100md.com 六、荷瘤小鼠模型的建立(同第一部分)
七、实验分组和给药(同第一部分)
连续用药15天后停药，处死小鼠后剥离瘤块，10%甲醛固定。
八、取材的处理(固定、脱水、浸蜡、包蜡、切片)
组织块在甲醛里固定6个小时后取出用流水冲洗，滤纸吸去多余水分。注意遵守以下原则：(1)取材时避开瘤体中央液化坏死区，避免在瘤体外周取材，取材部位应介于两者之间。(2)从剥离瘤体、切取组织块到抽入固定液，要尽量迅速，以尽量保持材料的新鲜，一般在1分钟内把组织块浸入固定液。(3)所用的固定液及容器必须预冷，以降低离体细胞内水解酶的活性，尽可能减少细胞自溶。(4)切割组织的刀必须锋利干净，操作时必须避免拉、锯、压等动作以免造成细胞损伤。
1.脱水：
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70%乙醇 4℃ 1h
80%乙醇 4℃ 1h
90%乙醇 4℃ 1h
95%乙醇 4℃ 过夜
100%乙醇Ⅰ 4℃ 30min
100%乙醇Ⅱ 4℃ 30min
100%乙醇Ⅲ 4℃ 30min
二甲苯Ⅰ 4℃ 30min
二甲苯Ⅱ 4℃ 30min
二甲苯Ⅲ 4℃ 30min
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石蜡Ⅰ 4℃ 30min
石蜡Ⅱ 4℃ 30min
石蜡Ⅲ 4℃ 30min
石蜡Ⅳ 4℃ 30min
包蜡 ﹤60℃
2.切片前载玻片涂黏附剂：将待涂载玻片放在玻片架上浸入APES与丙酮混合液(比例：1：50)中，常温下晾干备用。
3.切片：厚度一般在4～6μm。
烤片：切片附黏后置60℃烤箱中2个小时。
保存：备用切片置4℃冰箱中保存。
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九、免疫组化染色
1.石蜡切片常规脱蜡至水
二甲苯Ⅰ 5min
二甲苯Ⅱ 5min
二甲苯Ⅲ 5min
无水乙醇Ⅰ 1min
无水乙醇Ⅱ 1min
95%酒精 30s
90%酒精 30s
80%酒精 30s
2.30% H2O2加蒸馏水10份混合，室温放置10min～1h以灭活内源性过氧化物酶活性，蒸馏水洗，2min×3次。
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3.热修复抗原：将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃～98℃之间并持续10～15分钟。取出容器，室温冷却10～20min，蒸馏水冲洗2次，PBS洗，2min×3次。
4.抗原修复液Ⅰ：滴加在切片上室温5～10min后，PBS洗，2min×3次。
5.滴加正常山羊血清封闭液，室温30min，甩去多余液体，不洗。
6.滴加PCNA/VEGF一抗，37℃孵育1h左右，或4℃过夜，PBS洗，3min×5次。
7.滴加生物素化二抗，37℃20min，PBS洗，3min×5次。
8.滴加试剂SABC，37℃20min，PBS洗，4min×5次。
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9.DAB显色：取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至切片。室温显色，控制反应时间，一般5～30min(显色的具体情况而定)，蒸馏水洗涤，3min×5次。
10.苏木素轻度复染，约60s。
11.中性树胶封片。设阴性对照切片，用PBS代替特异性第一抗体。
十、HE染色
染色方法：
二甲苯Ⅰ 5min
二甲苯Ⅱ 5min
二甲苯Ⅲ 5min
无水乙醇Ⅰ 1min
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无水乙醇Ⅱ 1min
95%酒精 30s
90%酒精 30s
80%酒精 30s
苏木清 10min
(蒸馏水洗数秒)
1%盐酸酒精分化 20s
流水冲洗(返蓝) 5min
伊红 1min30s
80%酒精 5s
90%酒精 5s
, 百拇医药
95%酒精 5min
无水乙醇Ⅰ 5min
无水乙醇Ⅱ 5min
无水乙醇Ⅲ 5min
二甲苯石炭酸 5min
二甲苯Ⅰ 5min
二甲苯Ⅱ 5min
十一、结果判断
1.肿瘤内微血管计数(microvessel density count , MDC)：于每只荷瘤小鼠瘤体内的5个不同部位取材，每块5mm×5mm×2mm，排除肿瘤出血区及边缘反应区。应用HE染色，低倍镜(×40)观察确定每例切片中3个血管计数最高区域，然后在高倍镜(×100)下记数热点区域(hot
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spots)内每高掊镜视野的MDC，为了避免较大血管对计数的干扰，对管壁有较厚平滑肌包绕或管腔﹥8个细胞面积的血管不予计数。其平均值即为该例肿瘤的MDC值。
2.PCNA的阳性判断标准，细胞核染成棕黄色或棕褐色为阳性反应，每个标本随机观察10个高倍镜视野(×100)，计算每个高倍镜视野100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其平均值作为PCNA的阳性细胞数。VEGF以细胞浆内出现棕黄色为阳性，算阳性区域面积占瘤细胞总面积的百分率表示。
结果
一、 消癌根对肿瘤组织微血管计数(MDC)的影响
如表1所示：与阴性组相比较，消癌根高剂量组和消癌根低剂量组的MDC均明显降低(P﹤0.05)。而环磷酰胺组的MDC与阴性对照组比较无显著性差异(P﹥0.05)。消癌根高剂量的MDC明显低于消癌根低剂量组的MDC(P﹤0.05)。
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二、消癌根对肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)的影响
对于VEGF的表达，消癌根高剂量组和消癌根低剂量组均显著弱于阴性对照组(P﹤0.05)。消癌根高剂量组和消癌根低剂量组VEGF的表达明显减弱，与环磷酰胺组相比较有显著性差异(P﹤0.05)。消癌根高剂量组与消癌根低剂量组比较，其VEGF的表达亦明显减弱(P﹤0.05)(如表2所示)。
三、消癌根对肿瘤组织增殖细胞核抗原(PCNA)的影响
如表3所示，对于PCNA的表达，消癌根高剂量组和消癌根低剂量组与阴性对照组比较均显著减弱(P﹤0.01)。与环磷酰胺组相比较，消癌根高剂量组和消癌根低剂量组PCNA的表达均明显减弱(P﹤0.01)。消癌根高剂量组的PCNA的表达明显弱于消癌根低剂量组(P﹤0.01)。
讨论
由于肿瘤血管生成在肿瘤生成及肿瘤侵袭转移中的重要作用，以及VEGF对肿瘤血管形成的促进作用已在多种肿瘤中得以证实，VEGF可作为抗癌治疗的新靶点，针对VEGF及其受体的抗血管治疗，为肿瘤防治开辟另一新途径。
本实验以S180荷瘤小鼠为研究对象，分别以环膦酰胺和蒸馏水为阳性对照和阴性对照，来研究消癌根的抑瘤情况及其可能的机理。结果表明消癌根高剂量组抑瘤率达到35.2%，低剂量组亦达到22.1%。说明该药具有一定的抗肿瘤效果。其机理可能是通过抑制VEGF、PCNA的表达来实现的。, 百拇医药(H2O)0.4g。调pH至6.0。)
一、实验动物 昆明种小鼠60只，4～6周龄，体重18～22g，雄性，购于南方医科大学动物中心。分笼饲养，自由摄食、饮水，鼠房保持通风。
二、细胞株 细胞株为小鼠腹水型肝癌细胞株A180细胞，皮下接种可生成肉瘤。购于中山医科大学肿瘤研究所，常规复苏传代培养。
三、主要药物、试剂和仪器
纯中药复方消癌根，由董草原医生提供。
环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号02071121。
PCNA一抗：武汉博士德生物工程有限公司产品；VEGF一抗：武汉博士德生物工程有限公司产品；生物素化兔抗山羊二抗试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司产品。
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试剂盒中内容：
H2O2浓缩液 4ml
封闭液Ⅰ 既用型 4ml
封闭液Ⅱ 既用型 4ml
生物素化兔抗山羊IgG 既用型 4ml
抗原冷修复液 既用型 4ml
DAB显色剂试剂盒武汉博士德生物工程有限公司产品
试剂盒中内容：
显色剂A DAB×20 3ml
显色剂B H2O2×20 3ml
, 百拇医药
显色剂C TBS×20 3ml
四、主要溶液的配制：
0.01MPBS缓冲液(pH7.2～7.4)：1000ml双蒸水中，加氯化钠9g，NaH2PO4·12H2O
6g，NaH2PO4·2H2O 0.4g，调整pH值至7.2～7.4。
0.1M枸橼酸冲液(pH6.0)：1000ml双蒸水中加枸橼酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)3g，枸橼酸(C6H8O7
3% H2O2甲醇或0.01MPBS，97ml加入3ml市售的30% H2O2既得3% H2O2。
五、消癌根药液的制备(同第一部分)
, http://www.100md.com 六、荷瘤小鼠模型的建立(同第一部分)
七、实验分组和给药(同第一部分)
连续用药15天后停药，处死小鼠后剥离瘤块，10%甲醛固定。
八、取材的处理(固定、脱水、浸蜡、包蜡、切片)
组织块在甲醛里固定6个小时后取出用流水冲洗，滤纸吸去多余水分。注意遵守以下原则：(1)取材时避开瘤体中央液化坏死区，避免在瘤体外周取材，取材部位应介于两者之间。(2)从剥离瘤体、切取组织块到抽入固定液，要尽量迅速，以尽量保持材料的新鲜，一般在1分钟内把组织块浸入固定液。(3)所用的固定液及容器必须预冷，以降低离体细胞内水解酶的活性，尽可能减少细胞自溶。(4)切割组织的刀必须锋利干净，操作时必须避免拉、锯、压等动作以免造成细胞损伤。
1.脱水：
, 百拇医药
70%乙醇 4℃ 1h
80%乙醇 4℃ 1h
90%乙醇 4℃ 1h
95%乙醇 4℃ 过夜
100%乙醇Ⅰ 4℃ 30min
100%乙醇Ⅱ 4℃ 30min
100%乙醇Ⅲ 4℃ 30min
二甲苯Ⅰ 4℃ 30min
二甲苯Ⅱ 4℃ 30min
二甲苯Ⅲ 4℃ 30min
, 百拇医药
石蜡Ⅰ 4℃ 30min
石蜡Ⅱ 4℃ 30min
石蜡Ⅲ 4℃ 30min
石蜡Ⅳ 4℃ 30min
包蜡 ﹤60℃
2.切片前载玻片涂黏附剂：将待涂载玻片放在玻片架上浸入APES与丙酮混合液(比例：1：50)中，常温下晾干备用。
3.切片：厚度一般在4～6μm。
烤片：切片附黏后置60℃烤箱中2个小时。
保存：备用切片置4℃冰箱中保存。
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九、免疫组化染色
1.石蜡切片常规脱蜡至水
二甲苯Ⅰ 5min
二甲苯Ⅱ 5min
二甲苯Ⅲ 5min
无水乙醇Ⅰ 1min
无水乙醇Ⅱ 1min
95%酒精 30s
90%酒精 30s
80%酒精 30s
2.30% H2O2加蒸馏水10份混合，室温放置10min～1h以灭活内源性过氧化物酶活性，蒸馏水洗，2min×3次。
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3.热修复抗原：将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃～98℃之间并持续10～15分钟。取出容器，室温冷却10～20min，蒸馏水冲洗2次，PBS洗，2min×3次。
4.抗原修复液Ⅰ：滴加在切片上室温5～10min后，PBS洗，2min×3次。
5.滴加正常山羊血清封闭液，室温30min，甩去多余液体，不洗。
6.滴加PCNA/VEGF一抗，37℃孵育1h左右，或4℃过夜，PBS洗，3min×5次。
7.滴加生物素化二抗，37℃20min，PBS洗，3min×5次。
8.滴加试剂SABC，37℃20min，PBS洗，4min×5次。
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9.DAB显色：取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至切片。室温显色，控制反应时间，一般5～30min(显色的具体情况而定)，蒸馏水洗涤，3min×5次。
10.苏木素轻度复染，约60s。
11.中性树胶封片。设阴性对照切片，用PBS代替特异性第一抗体。
十、HE染色
染色方法：
二甲苯Ⅰ 5min
二甲苯Ⅱ 5min
二甲苯Ⅲ 5min
无水乙醇Ⅰ 1min
, http://www.100md.com
无水乙醇Ⅱ 1min
95%酒精 30s
90%酒精 30s
80%酒精 30s
苏木清 10min
(蒸馏水洗数秒)
1%盐酸酒精分化 20s
流水冲洗(返蓝) 5min
伊红 1min30s
80%酒精 5s
90%酒精 5s
, 百拇医药
95%酒精 5min
无水乙醇Ⅰ 5min
无水乙醇Ⅱ 5min
无水乙醇Ⅲ 5min
二甲苯石炭酸 5min
二甲苯Ⅰ 5min
二甲苯Ⅱ 5min
十一、结果判断
1.肿瘤内微血管计数(microvessel density count , MDC)：于每只荷瘤小鼠瘤体内的5个不同部位取材，每块5mm×5mm×2mm，排除肿瘤出血区及边缘反应区。应用HE染色，低倍镜(×40)观察确定每例切片中3个血管计数最高区域，然后在高倍镜(×100)下记数热点区域(hot
, http://www.100md.com
spots)内每高掊镜视野的MDC，为了避免较大血管对计数的干扰，对管壁有较厚平滑肌包绕或管腔﹥8个细胞面积的血管不予计数。其平均值即为该例肿瘤的MDC值。
2.PCNA的阳性判断标准，细胞核染成棕黄色或棕褐色为阳性反应，每个标本随机观察10个高倍镜视野(×100)，计算每个高倍镜视野100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其平均值作为PCNA的阳性细胞数。VEGF以细胞浆内出现棕黄色为阳性，算阳性区域面积占瘤细胞总面积的百分率表示。
结果
一、 消癌根对肿瘤组织微血管计数(MDC)的影响
如表1所示：与阴性组相比较，消癌根高剂量组和消癌根低剂量组的MDC均明显降低(P﹤0.05)。而环磷酰胺组的MDC与阴性对照组比较无显著性差异(P﹥0.05)。消癌根高剂量的MDC明显低于消癌根低剂量组的MDC(P﹤0.05)。
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二、消癌根对肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)的影响
对于VEGF的表达，消癌根高剂量组和消癌根低剂量组均显著弱于阴性对照组(P﹤0.05)。消癌根高剂量组和消癌根低剂量组VEGF的表达明显减弱，与环磷酰胺组相比较有显著性差异(P﹤0.05)。消癌根高剂量组与消癌根低剂量组比较，其VEGF的表达亦明显减弱(P﹤0.05)(如表2所示)。
三、消癌根对肿瘤组织增殖细胞核抗原(PCNA)的影响
如表3所示，对于PCNA的表达，消癌根高剂量组和消癌根低剂量组与阴性对照组比较均显著减弱(P﹤0.01)。与环磷酰胺组相比较，消癌根高剂量组和消癌根低剂量组PCNA的表达均明显减弱(P﹤0.01)。消癌根高剂量组的PCNA的表达明显弱于消癌根低剂量组(P﹤0.01)。
讨论
由于肿瘤血管生成在肿瘤生成及肿瘤侵袭转移中的重要作用，以及VEGF对肿瘤血管形成的促进作用已在多种肿瘤中得以证实，VEGF可作为抗癌治疗的新靶点，针对VEGF及其受体的抗血管治疗，为肿瘤防治开辟另一新途径。
本实验以S180荷瘤小鼠为研究对象，分别以环膦酰胺和蒸馏水为阳性对照和阴性对照，来研究消癌根的抑瘤情况及其可能的机理。结果表明消癌根高剂量组抑瘤率达到35.2%，低剂量组亦达到22.1%。说明该药具有一定的抗肿瘤效果。其机理可能是通过抑制VEGF、PCNA的表达来实现的。, 百拇医药(H2O)0.4g。调pH至6.0。)