SEN病毒D亚型ORF1C端基因的克隆、表达和鉴定
Gene cloning, expression and characterization of ORF1C terminal protein of SEN virus D subtype
MU ShiJie1, DU Juan2, CHEN Rui3, WANG QuanLi2, ZHAO WenMing1
1School of Life Sciences and Technology, Xian Jiaotong University, Xian 710048, China, 2Institute of Field Transfusion Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China, 3Department of Blood Transfusion, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To obtain the gene sequence of ORF1C terminal protein of SENVD and then to express the molecule, which lays the foundation for further research, diagnosis and therapy applications. METHODS: The SENVDORF1 Cterminal gene was obtained by PCR from SENV positive serum. After sequencing, the gene was subcloned into pQE30SEND expression vector and transferred into E.coli M15. After IPTG induction, the expressed protein was analyzed by Western blot. RESULTS: The gene sequence of SENVD ORF1C terminal protein, as well as the (Mr ) 38×103 expressed molecule, was successfully obtained. The expressed protein could be recognized very well by the specific antibody from the patients serum. CONCLUSION: The SENVDORF1 Cterminal protein is successfully expressed and can be recognized by the specific antibody from the positive serum in Western Blot. It can be used in the detection of SENVD antibody, which is very useful in monitoring the epidemic situation and detecting the infected patient at early stage.
【Keywords】 SEN; sequence analysis; gene cloning; expression
【摘要】 目的： 获得SENVD亚型ORF1C端蛋白基因序列，并进行表达，为进一步研究及诊断、治疗应用奠定基础. 方法: 用PCR法从SENV阳性血清中获得SENVDORF1C端基因，测序验证后，构建了pQE30SENVD重组表达质粒，并经过转化E.coli M15，IPTG诱导表达，Western blot分析表达结果. 结果: 获得了正确序列的SENVD亚型ORF1C端蛋白基因序列，表达出Mr 约为38×103的蛋白. 表达蛋白能与患者血清中相应的抗体结合，发生抗原抗体反应. 结论: 成功获得并表达了SENVDORF1C端蛋白，并经Western blot印迹法证实能与阳性血清中的抗体发生抗原抗体反应，有可能用于检测SENVD抗体. 为今后进一步研究有助于疫情监测及早期发现感染者的抗体奠定了坚实的基础.
【关键词】 SEN病毒；序列分析；基因克隆； 表达
0引言
病毒性肝炎是传播很广的传染病,严重威胁人类的健康.除了已明确致病性的甲、乙、丙、丁、戊五型肝炎病毒外,1999年Primi发现了一种新的DNA病毒,将其称为SEN病毒[1]. SEN病毒为一单链环状、无包膜DNA病毒,其基因组为负链长3.7 kb[2]. 目前对SENV感染的实验室检测方法还很不成熟,要全面了解人体内SENV感染以及机体对其产生的免疫反应的情况,需要对病毒的蛋白进行体外表达,建立基于抗原抗体反应的检测方法. 本研究针对SEN病毒的ORF1C端蛋白进行体外重组表达,并用免疫印迹方法对其抗原性做初步分析.
1材料和方法
1.1材料限制性核酸内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA marker(DL2000)购自Tokara公司；病毒基因组DNA提取试剂盒购自Sigma公司； Xgal和IPTG购自上海生工；质粒提取试剂盒Promega Wizard Plus Miniprep DNA Purification System和pGEMT载体购自Promega公司；DNA回收试剂盒购自鼎国公司；硝酸纤维素膜为Amersham公司产品；HRP标记的二抗购自北京中山生物技术有限公司；化学发光底物SuperSignal West Pico Trial Kit为Pierce公司产品；引物由上海生工合成,在上海博亚公司进行序列测定；原核表达质粒pQE30和DH5α及M15为本所保存；SEN病毒阳性血清来自第四军医大学西京医院输血科.
1.2方法
1.2.1聚合酶链反应及重组质粒pGEMTSENVD的构建根据GenBank登录的SENVD基因全序列，设计一对引物用于从SEN病毒基因组中扩增D亚型的全长，在上、下游引物的两端分别添加了BamHⅠ和HindⅢ内切酶位点. 引物序列如下： OP1：5′CGCGGATCCGTAGCTTACATGGA3′，OP2: 5′CCCAAGCTTTAAATTTGCTTTGG3′[3]. PCR参数为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，30个循环；最后72℃延伸7 min. PCR产物纯化后，连入pGEMT载体、转化DH5α感受态、质粒抽提、双酶切筛选阳性重组子等步骤均按常规分子克隆方法或试剂盒说明书进行，阳性质粒pGEMTSENVD送上海博亚公司测序鉴定.
1.2.2重组质粒pQE30SENVD的构建用BamHⅠ和HindⅢ内切酶将SENVDORF1C从pGEMTSENVD质粒中切下，连入同样双酶切的pQE30中，分别转化M15感受态，同前筛选阳性重组子，阳性质粒pQE30SENVD送上海博亚公司测序鉴定.
1.2.3重组融合蛋白的诱导表达及鉴定挑取表达pQE30SENVD的单个菌落，接种于LB (含卡那霉素50 mg/L和氨苄青霉素100 mg/L)培养液中，加IPTG至终浓度1 mmol/L继续震荡培养4 h. 以BioRad垂直平板电泳仪以100 g/L SDSPAGE分离胶对目的蛋白的表达进行鉴定. 进行Western blot分析时，SDSPAGE后，160 mA恒流转膜30 min (0.4 μmol/L硝酸纤维素膜)；用封闭液(含50 g/L脱脂奶粉的TBST)室温振荡封闭2 h；加入1∶10稀释的SENVD阳性血清于4℃孵育过夜；与1∶2000稀释的HRP标记的二抗室温振荡反应2 h；ECL显色检测目的蛋白.
2结果
2.1SEN病毒D亚型ORF1C端基因的获得根据GenBank公布的SEN病毒D亚型ORF1C端基因序列设计并合成特异性引物P1和P2，通过PCR得到约900 bp大小的片段，其长度与预计相符，(Fig 1). 将PCR产物克隆至pGEMT载体，BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定获得同样大小的目的片段，将重组质粒命名为pGEMTSENVD. 测序结果显示克隆片段为SEN病毒D亚型ORF1C端基因的序列，与文献报道一致 . 结果证实 ：获得正确的SEN病毒D亚型ORF1C端基因.
2.2重组质粒pQE30SENVD的构建及酶切鉴定用BamHⅠ和HindⅢ将SENVDORF1C从pGEMTSENVD载体上切下，连入同样双酶切的pQE30载体中，双酶切产生的片段约为900 bp(Fig 2). 将重组质粒命名为pQE30SENVD，重组质粒测序证明正确.
图1-图2 (略)
2.3融合蛋白的诱导表达及鉴定在1 mmol/L IPTG终浓度、37℃培养4 h的诱导条件下，在诱导菌的全菌中有Mr 约38×103的pQE30SENVD蛋白表达(Fig 3)，其中，目的蛋白约占全菌
图3 (略)
D融合蛋白的表达总蛋白的30%. 将IPTG诱导的pQE30SENVD全菌和未诱导全菌进行120 g/L SDSPAGE后，转移至硝酸纤维素膜，以SENVD阳性血清按1∶10比例为一抗做Westernblotting，在约Mr 38×103处有一明显的反应带. 表明表达产物能与患者血清中相应的抗体结合，发生抗原抗体反应，未诱导菌则不行(Fig 4).
图4Westernblot的分析结果 (略)
3讨论
SENV是Diasorin公司的研究人员从一例HIV静脉吸毒患者血液中发现的. SENV是一种无包膜单链环状DNA病毒，属圆环病毒科，分为8型，分别命名为SENVA~H[4]. SENV共有三个开放读框，ORF1和ORF2相互重叠，ORF3在ORF1的3′端，SENVA~H的ORF1分别编码642, 679, 753, 754, 743, 758, 763和762个氨基酸. ORF1蛋白既有衣壳蛋白的特点，又含有复制蛋白的保守基序，行使复制蛋白的功能[5,6]，其N端富含精氨酸/赖氨酸，其中52个都使用的是稀有密码子，对蛋白的表达会有所影响. 流行病学调查显示SENV很可能是一种通过输血、性接触、母婴途径传播的新型肝炎病毒[7,8]. 在美国和意大利健康人群和献血人员中SENV阳性率为2%[7,9]，日本和台湾分别为10%和15%[10,11]，而在药瘾者、血友病患者、地中海贫血患者和进行多次血液透析的患者等高危人群中有很高的感染率，分别为54%, 68%. 90%和85%[11]. 而SENVD和SENVH在献血员中的感染率小于1%而在输血相关性nonAE肝炎患者中感染率超过50%，提示SENVD和SENVH可能与输血相关性nonAE肝炎有关[7,8]. 国内报道在nonAE患者血清中用PCR方法检测到SENV DNA，检出率为15%.
随着人们对输血安全认识的深入，输血安全也越来越受到人们的重视. 目前对SENV感染的实验室检测方法还很不成熟，现有的方法一是通过用SENV病毒特异性引物进行PCR反应后，再用5′端生物素标记的SRNV各亚型的特异性探针进行DNA的酶联免疫反应；二是nPCR检测方法. 两种方法均不宜作为常规临床检测. 而表达病毒蛋白可以建立基于抗原抗体反应的检测方法来了解对人体内SENV感染以及对其产生的免疫反应情况，为开发出用于临床输血前筛查的免疫诊断试剂提供有力的依据.
我们成功地表达了SENVORF1C端蛋白，并经Western印迹法证实能与阳性血清中的抗体发生抗原抗体反应. 有可能用于检测SENVD抗体. 为今后进一步研究有助于疫情监测及早期发现感染者的抗体奠定了坚实的基础.
【参考文献】
[1] Primi D, Fiordalisi G, Manero GL, et al. Identification of SENV genotypes[P] International Publication: WO 00/28039,2000(International application published under the patent cooperation treaty).
[2] Primi D, Sittini A. Identification and characterization of SEN virus, a family of novel viruses[J]. Antivirol Ther, 2000;5(Suppl 1):G7.
[3] 杜娟，王海平，孟庆华，等. SEN病毒D亚型中国分离株基因克隆及序列分析[J]. 病毒学报，2003;19(2):173-175.Du J, Wang HP, Meng QH, et al. The cloning and sequencing of the gene of a Chinese SEN virus D subtype isolate[J]. Chin J Virol, 2003;19(2):173-175.
[4] Umemura T, Yeo AE, Sottini A, et al. SEN virus infection and its relationship to transfusionassociated hepatitis[J]. Hepatology, 2001;33(5):1303-1311.
[5] Tanaka Y, Primi D, Wang RY, et al. Genomic and molecular evolutionary analysis of a newly identified infectious agent and its relationship to the TT virus family[J]. J Infect Dis, 2001;183(3):359-367.
[6] Okamoto H, Nishizawa T, Ukita NKM, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J]. Hepatol Res,1998;10:1.
[7] Bowden S. New hepatitis viruses:contenders and pretenders[J]. J Gastroent Hepatol, 2001;16(2):124-131.
[8] Pirovano S, Bellinzoni M, Ballerini C, et al. Transmission of SEN virus from mother to their babies[J]. J Med Virol, 2002;66(3):421-427.
[9] Mushahwar IK. Recently discovered bloodborne virus: Are they hepatitis viruses or merely endosymbionts?[J]. J Med Virol, 2000;62(4):399-404.
[10] Shibata M, Wang RY, Yoshiba M, et al. The presence of a newly identified infectious agent in patients with liver diseases and in blood donors in Japan[J]. J Infect Dis, 2001;184(4):400-404.
[11] Kao JH, Chen W, Chen PJ, et al. Prevalence and implication of a newly identified infectious agent in Taiwan[J]. J Infect Dis, 2002;185(3):389-392.
1西安交通大学生命科学院,陕西 西安 710048
2军事医学科学院野战输血研究所,北京 100850
3第四军医大学西京医院输血科,陕西 西安 710033
编辑许昌泰, 百拇医药(穆士杰 杜娟 陈蕤 王全立 赵文明)
MU ShiJie1, DU Juan2, CHEN Rui3, WANG QuanLi2, ZHAO WenMing1
1School of Life Sciences and Technology, Xian Jiaotong University, Xian 710048, China, 2Institute of Field Transfusion Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China, 3Department of Blood Transfusion, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To obtain the gene sequence of ORF1C terminal protein of SENVD and then to express the molecule, which lays the foundation for further research, diagnosis and therapy applications. METHODS: The SENVDORF1 Cterminal gene was obtained by PCR from SENV positive serum. After sequencing, the gene was subcloned into pQE30SEND expression vector and transferred into E.coli M15. After IPTG induction, the expressed protein was analyzed by Western blot. RESULTS: The gene sequence of SENVD ORF1C terminal protein, as well as the (Mr ) 38×103 expressed molecule, was successfully obtained. The expressed protein could be recognized very well by the specific antibody from the patients serum. CONCLUSION: The SENVDORF1 Cterminal protein is successfully expressed and can be recognized by the specific antibody from the positive serum in Western Blot. It can be used in the detection of SENVD antibody, which is very useful in monitoring the epidemic situation and detecting the infected patient at early stage.
【Keywords】 SEN; sequence analysis; gene cloning; expression
【摘要】 目的： 获得SENVD亚型ORF1C端蛋白基因序列，并进行表达，为进一步研究及诊断、治疗应用奠定基础. 方法: 用PCR法从SENV阳性血清中获得SENVDORF1C端基因，测序验证后，构建了pQE30SENVD重组表达质粒，并经过转化E.coli M15，IPTG诱导表达，Western blot分析表达结果. 结果: 获得了正确序列的SENVD亚型ORF1C端蛋白基因序列，表达出Mr 约为38×103的蛋白. 表达蛋白能与患者血清中相应的抗体结合，发生抗原抗体反应. 结论: 成功获得并表达了SENVDORF1C端蛋白，并经Western blot印迹法证实能与阳性血清中的抗体发生抗原抗体反应，有可能用于检测SENVD抗体. 为今后进一步研究有助于疫情监测及早期发现感染者的抗体奠定了坚实的基础.
【关键词】 SEN病毒；序列分析；基因克隆； 表达
0引言
病毒性肝炎是传播很广的传染病,严重威胁人类的健康.除了已明确致病性的甲、乙、丙、丁、戊五型肝炎病毒外,1999年Primi发现了一种新的DNA病毒,将其称为SEN病毒[1]. SEN病毒为一单链环状、无包膜DNA病毒,其基因组为负链长3.7 kb[2]. 目前对SENV感染的实验室检测方法还很不成熟,要全面了解人体内SENV感染以及机体对其产生的免疫反应的情况,需要对病毒的蛋白进行体外表达,建立基于抗原抗体反应的检测方法. 本研究针对SEN病毒的ORF1C端蛋白进行体外重组表达,并用免疫印迹方法对其抗原性做初步分析.
1材料和方法
1.1材料限制性核酸内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA marker(DL2000)购自Tokara公司；病毒基因组DNA提取试剂盒购自Sigma公司； Xgal和IPTG购自上海生工；质粒提取试剂盒Promega Wizard Plus Miniprep DNA Purification System和pGEMT载体购自Promega公司；DNA回收试剂盒购自鼎国公司；硝酸纤维素膜为Amersham公司产品；HRP标记的二抗购自北京中山生物技术有限公司；化学发光底物SuperSignal West Pico Trial Kit为Pierce公司产品；引物由上海生工合成,在上海博亚公司进行序列测定；原核表达质粒pQE30和DH5α及M15为本所保存；SEN病毒阳性血清来自第四军医大学西京医院输血科.
1.2方法
1.2.1聚合酶链反应及重组质粒pGEMTSENVD的构建根据GenBank登录的SENVD基因全序列，设计一对引物用于从SEN病毒基因组中扩增D亚型的全长，在上、下游引物的两端分别添加了BamHⅠ和HindⅢ内切酶位点. 引物序列如下： OP1：5′CGCGGATCCGTAGCTTACATGGA3′，OP2: 5′CCCAAGCTTTAAATTTGCTTTGG3′[3]. PCR参数为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，30个循环；最后72℃延伸7 min. PCR产物纯化后，连入pGEMT载体、转化DH5α感受态、质粒抽提、双酶切筛选阳性重组子等步骤均按常规分子克隆方法或试剂盒说明书进行，阳性质粒pGEMTSENVD送上海博亚公司测序鉴定.
1.2.2重组质粒pQE30SENVD的构建用BamHⅠ和HindⅢ内切酶将SENVDORF1C从pGEMTSENVD质粒中切下，连入同样双酶切的pQE30中，分别转化M15感受态，同前筛选阳性重组子，阳性质粒pQE30SENVD送上海博亚公司测序鉴定.
1.2.3重组融合蛋白的诱导表达及鉴定挑取表达pQE30SENVD的单个菌落，接种于LB (含卡那霉素50 mg/L和氨苄青霉素100 mg/L)培养液中，加IPTG至终浓度1 mmol/L继续震荡培养4 h. 以BioRad垂直平板电泳仪以100 g/L SDSPAGE分离胶对目的蛋白的表达进行鉴定. 进行Western blot分析时，SDSPAGE后，160 mA恒流转膜30 min (0.4 μmol/L硝酸纤维素膜)；用封闭液(含50 g/L脱脂奶粉的TBST)室温振荡封闭2 h；加入1∶10稀释的SENVD阳性血清于4℃孵育过夜；与1∶2000稀释的HRP标记的二抗室温振荡反应2 h；ECL显色检测目的蛋白.
2结果
2.1SEN病毒D亚型ORF1C端基因的获得根据GenBank公布的SEN病毒D亚型ORF1C端基因序列设计并合成特异性引物P1和P2，通过PCR得到约900 bp大小的片段，其长度与预计相符，(Fig 1). 将PCR产物克隆至pGEMT载体，BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定获得同样大小的目的片段，将重组质粒命名为pGEMTSENVD. 测序结果显示克隆片段为SEN病毒D亚型ORF1C端基因的序列，与文献报道一致 . 结果证实 ：获得正确的SEN病毒D亚型ORF1C端基因.
2.2重组质粒pQE30SENVD的构建及酶切鉴定用BamHⅠ和HindⅢ将SENVDORF1C从pGEMTSENVD载体上切下，连入同样双酶切的pQE30载体中，双酶切产生的片段约为900 bp(Fig 2). 将重组质粒命名为pQE30SENVD，重组质粒测序证明正确.
图1-图2 (略)
2.3融合蛋白的诱导表达及鉴定在1 mmol/L IPTG终浓度、37℃培养4 h的诱导条件下，在诱导菌的全菌中有Mr 约38×103的pQE30SENVD蛋白表达(Fig 3)，其中，目的蛋白约占全菌
图3 (略)
D融合蛋白的表达总蛋白的30%. 将IPTG诱导的pQE30SENVD全菌和未诱导全菌进行120 g/L SDSPAGE后，转移至硝酸纤维素膜，以SENVD阳性血清按1∶10比例为一抗做Westernblotting，在约Mr 38×103处有一明显的反应带. 表明表达产物能与患者血清中相应的抗体结合，发生抗原抗体反应，未诱导菌则不行(Fig 4).
图4Westernblot的分析结果 (略)
3讨论
SENV是Diasorin公司的研究人员从一例HIV静脉吸毒患者血液中发现的. SENV是一种无包膜单链环状DNA病毒，属圆环病毒科，分为8型，分别命名为SENVA~H[4]. SENV共有三个开放读框，ORF1和ORF2相互重叠，ORF3在ORF1的3′端，SENVA~H的ORF1分别编码642, 679, 753, 754, 743, 758, 763和762个氨基酸. ORF1蛋白既有衣壳蛋白的特点，又含有复制蛋白的保守基序，行使复制蛋白的功能[5,6]，其N端富含精氨酸/赖氨酸，其中52个都使用的是稀有密码子，对蛋白的表达会有所影响. 流行病学调查显示SENV很可能是一种通过输血、性接触、母婴途径传播的新型肝炎病毒[7,8]. 在美国和意大利健康人群和献血人员中SENV阳性率为2%[7,9]，日本和台湾分别为10%和15%[10,11]，而在药瘾者、血友病患者、地中海贫血患者和进行多次血液透析的患者等高危人群中有很高的感染率，分别为54%, 68%. 90%和85%[11]. 而SENVD和SENVH在献血员中的感染率小于1%而在输血相关性nonAE肝炎患者中感染率超过50%，提示SENVD和SENVH可能与输血相关性nonAE肝炎有关[7,8]. 国内报道在nonAE患者血清中用PCR方法检测到SENV DNA，检出率为15%.
随着人们对输血安全认识的深入，输血安全也越来越受到人们的重视. 目前对SENV感染的实验室检测方法还很不成熟，现有的方法一是通过用SENV病毒特异性引物进行PCR反应后，再用5′端生物素标记的SRNV各亚型的特异性探针进行DNA的酶联免疫反应；二是nPCR检测方法. 两种方法均不宜作为常规临床检测. 而表达病毒蛋白可以建立基于抗原抗体反应的检测方法来了解对人体内SENV感染以及对其产生的免疫反应情况，为开发出用于临床输血前筛查的免疫诊断试剂提供有力的依据.
我们成功地表达了SENVORF1C端蛋白，并经Western印迹法证实能与阳性血清中的抗体发生抗原抗体反应. 有可能用于检测SENVD抗体. 为今后进一步研究有助于疫情监测及早期发现感染者的抗体奠定了坚实的基础.
【参考文献】
[1] Primi D, Fiordalisi G, Manero GL, et al. Identification of SENV genotypes[P] International Publication: WO 00/28039,2000(International application published under the patent cooperation treaty).
[2] Primi D, Sittini A. Identification and characterization of SEN virus, a family of novel viruses[J]. Antivirol Ther, 2000;5(Suppl 1):G7.
[3] 杜娟，王海平，孟庆华，等. SEN病毒D亚型中国分离株基因克隆及序列分析[J]. 病毒学报，2003;19(2):173-175.Du J, Wang HP, Meng QH, et al. The cloning and sequencing of the gene of a Chinese SEN virus D subtype isolate[J]. Chin J Virol, 2003;19(2):173-175.
[4] Umemura T, Yeo AE, Sottini A, et al. SEN virus infection and its relationship to transfusionassociated hepatitis[J]. Hepatology, 2001;33(5):1303-1311.
[5] Tanaka Y, Primi D, Wang RY, et al. Genomic and molecular evolutionary analysis of a newly identified infectious agent and its relationship to the TT virus family[J]. J Infect Dis, 2001;183(3):359-367.
[6] Okamoto H, Nishizawa T, Ukita NKM, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J]. Hepatol Res,1998;10:1.
[7] Bowden S. New hepatitis viruses:contenders and pretenders[J]. J Gastroent Hepatol, 2001;16(2):124-131.
[8] Pirovano S, Bellinzoni M, Ballerini C, et al. Transmission of SEN virus from mother to their babies[J]. J Med Virol, 2002;66(3):421-427.
[9] Mushahwar IK. Recently discovered bloodborne virus: Are they hepatitis viruses or merely endosymbionts?[J]. J Med Virol, 2000;62(4):399-404.
[10] Shibata M, Wang RY, Yoshiba M, et al. The presence of a newly identified infectious agent in patients with liver diseases and in blood donors in Japan[J]. J Infect Dis, 2001;184(4):400-404.
[11] Kao JH, Chen W, Chen PJ, et al. Prevalence and implication of a newly identified infectious agent in Taiwan[J]. J Infect Dis, 2002;185(3):389-392.
1西安交通大学生命科学院,陕西 西安 710048
2军事医学科学院野战输血研究所,北京 100850
3第四军医大学西京医院输血科,陕西 西安 710033
编辑许昌泰, 百拇医药(穆士杰 杜娟 陈蕤 王全立 赵文明)