抗人肝癌单克隆抗体嵌合轻链在巴氏毕赤酵母的高效分泌表达
Secretory expression of chimeric light chain of HAb 18 against human hepatoma in Pichia pastoris
DONG HongLin1,XING JinLiang2,YANG XiangMin2,YAO XiYing2,LI Yu2,DOU KeFeng1,CHEN ZhiNan2
1Department of Hepatobiliary Surgery,Xijing Hospital,2 Cell Engineering Research Center,Fourth Military Medical University,Xian 710033,China
【Abstract】AIM: To express secretively chimeric light chain of HAb18 against human hepatoma in Pichia pastoris.METHODS: Genes of cL chain fragment of cFab antibody HAb18 from the plasmids pET32a/Fab were subcloned into vectors pPIC9K.After confirmed by DNA sequence analysis,the recombinant plasmid pPIC9K/cL was transducted into the genome of GS115 Pichia pastoris using integrating technology.Mut+multiple inserted transformants were screened by G418○R and induced by 5 mL/L methanol to express.RESULTS: After 4 days of methanol induction,highyield secretory expression (22 mg/L)of the cL fragments was achieved.Western Blotting assay proved that the expressed protein had specific binding activity with HAb18GE antigen.CONCLUSION: The successful expression of cL of HAb18 in Pichia pastoris lays a solid foundation for the secretory expression of cFab HAb18.
【Keywords】 liver neoplasms；antibodies，monoclonal；chimeric light chain；Pichia；secretory expression
【摘要】 目的： 通过整合，用巴氏毕赤酵母表达抗人肝癌mAb HAb18的cFab的嵌合轻链.方法： 将抗人肝癌mAb cFab/HAb18原核表达载体pET32a/cFab中的cL亚克隆到酵母表达载体pPIC9K，构建成重组质粒pPIC9K/cL测序鉴定.重组质粒pPIC9K/cL整合到酵母菌GS115的染色体上，经G418筛选得到高拷贝转化子及Mut表型鉴定后，用含5 mL/L甲醇的培养基诱导表达.结果： 该系统成功表达了抗人肝癌mAb HAb18cFab的嵌合轻链，表达水平为22 mg/L；Western Blotting证实，表达产物具有良好的HAb18GE结合活性和特异性.结论： 嵌合轻链/HAb18在巴氏毕赤酵母获得成功表达，为高效分泌表达cFab抗体奠定了基础.
【关键词】 肝肿瘤；抗体，单克隆；嵌合轻链；毕赤酵母；分泌表达
0引言
以单抗(monoclonal antibody，mAb)为载体的抗肝癌导向药物研究已取得了较大进展，我们用131I标记HAb18 F(ab′) 2 制备的第二代肝癌放射免疫治疗剂，已完成Ⅱ期临床.但其鼠源性和用消化酶制备的方法限制了进一步的应用；因此，研究人源化的低成本的工程抗体很有必要.以前我们已对mAb的Fab进行了人源化改造，得到嵌合Fab我们选用毕赤酵母表达系统进行了HAb18cFab抗体的分泌表达为高效表达cFab HAb18奠定了良好的基础.
1材料和方法
1.1材料 pET32a/cFab质粒及Top10F'菌株由本实验室制备并保存；酵母表达载体pPIC9K和毕赤酵母宿主菌GS115购自Invitrogen公司；限制性内切酶、T4连接酶及Taq DNA聚合酶购自NEB公司；小量质粒提取试剂盒购自Sigma公司；酵母培养基YPD，YNB为Amresco公司产品；HRP标记羊抗人IgG购自Pierce公司，聚偏氟乙烯膜(PVDF)购自Millipore公司；人肝癌细胞系HCC由本室保存.
1.2方法根据已克隆的抗体cL的基因序列，我们设计了相应的引物，引入了BamHI +NotI酶切位点.引物分别为： 1： 5'AAAGGATCCAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTG3′；2： 5′AGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAGAGATACCCCTT3′;3： 5′AGAGAGGCTG
AAGCTGTGATGACCCAGACTCCCAC 3′;4： 5'GCGCCGGCGGCCGCTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC3′.根据文献[1]及密码子的简并性，将引物中部分密码子的碱基替换而不改变所编码氨基酸，使其为毕赤酵母偏嗜密码子.引物由上海博亚生物工程有限公司合成.以pET32a/cFab质粒为模板，用上述引物采用overlap PCR方法扩增cL链基因.重组质粒构建参照Sambrook方法进行，并进行酶切和测序鉴定.测序由上海博亚生物工程技术服务有限公司完成.参照Invitrogen Pichia Expression Kit将酵母菌GS115制备成感受态，取80 μL与经SacⅠ单酶切线性化的重组表达质粒pPIC9K/cL 10 μg混合，电转化后将200～600 μL菌液涂布于MD/His(134 g/L YNB，04 mg/L biotin，20 g/L dextrose及15 g/L agar)选择平板上，置30℃孵育2~4 d.将His+转化子用灭菌去离子水悬浮，按每平板1×105细胞涂于含G418不同浓度的YPD平板，置于30℃，经72 h培养后，抗G418的克隆长出.将G418高抗性克隆分别对应的点在MM (134 g/L YNB，04 mg/L biotin，5 mL/L methanol及15 g/L agar)和MD选择平板上，确定其表型.筛选阳性菌落接种于BMGY培养基25 mL(10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，134 g/L YNB，10 g/L glycerol及04 mg/L biotin)，30℃培养至A600nm≈30.离心收菌，用BMMY 250 mL培养基(10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，134 g/L YNB，5 mL/L methanol及04 mg/L biotin)重悬培养.每天补加纯甲醇于培养基质中至终浓度为5 mL/L，诱导表达产物用SDSPAGE，ELISA和Western Blotting方法鉴定.ELISA法所用包被抗原为HAb18 G蛋白，一抗为我们表达的cL，二抗为HRP标记的HRP标记的羊抗人IgG，OPD显色，阴性对照为pPIC9K空对照载体转化GS115后的表达上清.Western Blotting方法： 标准HAb18G蛋白经电泳并转印到硝酸纤维素膜后，用我们制备的cL/HAb18作为一抗进行结合，二抗为HRP标记的羊抗人IgG，DAB显色，阴性对照为pPIC9K空对照载体转化GS115后的表达上清.染色胞转染48 h后收集细胞，涂片干燥后，冷丙酮固定15 min，以抗HAb18G 的cL为一抗，FITC 标记的羊抗人特异性IgG 为二抗，行间接免疫荧光染色后，观察结果并照像.实验中以正常细胞作为对照.
2结果
2.1重组质粒pPIC9K/cL载体的构建及鉴定以pET32a/ cFab质粒为模板，用cL链基因引物扩增出目的片段，琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR产物cL链大小为600 bp左右，与预期的大小一致.重组质粒pPIC9 K/cL用BamHⅠ和NotⅠ双酶切，酶切结果显示： cL链基因已正确插入载体中的相应酶切位点，均为单拷贝插入(Fig 1).测序结果表明重组载体中cL链基因序列与已知序列相符合，未发现突变的碱基，且密码子读框正确.
图1重组质粒pPIC9 k/cL载体的构建和鉴定 (略)
2.2 cL链基因在毕赤酵母中的表达 重组质粒pPIC9 K/cL对照载体电转GS115后，于MD平板上皆有大量His+克隆产生，进一步将这些阳性克隆进行G418抗性筛选，结果G418在10 g/L时仍有克隆产生.挑取单克隆菌株，提取酵母DNA，以此为模板进行PCR扩增，得到650 bp的DNA片段，而转入空质粒pPIC9K的酵母没有扩增得到目的片段，证明重组质粒pPIC9 K/L整合入酵母基因DNA组中(Fig 2).将高拷贝转化子于MM和MD选择平板上，确定其表型为Mut+.120 g/L SDSPAGE电泳显示，表达产物Mr 23 000处有一条带，而转入空载体的对照菌无该条带.产物约占总蛋白98%(Fig 3,4)，经HPLC纯化后，表达水平为22 mg/L.ELISA显示表达产物与HAb18 GE 有特异性结合活性(A450 nm∶0431±0021)，而对照未见结合反应，Western Blotting也显示表达产物与HAb18 GE 有特异性结合活性(Fig 5).
图 2-图5 (略)
3讨 论
Pichia pastoris基因表达系统是最近迅速发展的一种外源基因表达系统，表达载体通过同源重组整合入酵母基因组而随同酵母染色体一起复制.同源重组时，毕赤酵母表达质粒可以通过体内和体外2种方式多拷贝整合于毕赤酵母基因组中.由于不同基因具有不同的特性，在毕赤酵母表达时，不同外源蛋白的表达水平会有很大差异，这种多拷贝整合在大多数情况下可以显著增加外源蛋白的表达水平.影响外源基因表达的另一重要因素是基因本身的特性.尽可能多地采用毕赤酵母偏爱使用的遗传密码，优化基因，才可能最大程度地减少翻译受阻或提前终止等现象的发生，提高表达量[1-3].大肠杆菌中进行了HAb18G抗原、Fab/HAb18和cFab/HAb18表达量还不足以进行大规模生产，所以，我们通过Pichia pastoris表达系统获得高效表达.cFab/HAb18的cL在巴氏毕赤酵母表达系统得到成功表达，为在Pichia pastoris中实现cFab的高效表达提供了可靠的实验依据.
【参考文献】
[1] Cregg JM，Cereghino JL，Shi J，et al.Recombinant protein expression in Pichia pastoris[J].Mol Biotechnol，2000；16(1):23-52.
[2] Xing JL，Yang XM，Dong HL，et al.Prokaryotic expression and immunological analysis of extracellular domain of hepatoma associated antigen HAb18G[J].J Tumor Marker Oncol，2003；18(4)：321-331.
[3] 邢金良,杨向民,姚西英，等.抗人肝癌基因工程嵌合Fab抗体的原核表达及复性[J].中华微生物学和免疫学杂志，2004;24(3)：189-193.Xing JL，Yang XM，Yao XY，et al.Prokaryotic expression and renaturation of engineering chimeric Fab antibody against human hepatoma[J].Chin J Microbiol Immunol，2004；24(3)：189-193.
第四军医大学: 1西京医院肝胆外科，2细胞工程研究中心，陕西西安710033
基金项目：国家863计划重点课题基金项目(2001AA2l5101)
编辑袁天峰, 百拇医药(董红霖 邢金良 杨向民 姚西英 李郁 窦科峰 陈志)
DONG HongLin1,XING JinLiang2,YANG XiangMin2,YAO XiYing2,LI Yu2,DOU KeFeng1,CHEN ZhiNan2
1Department of Hepatobiliary Surgery,Xijing Hospital,2 Cell Engineering Research Center,Fourth Military Medical University,Xian 710033,China
【Abstract】AIM: To express secretively chimeric light chain of HAb18 against human hepatoma in Pichia pastoris.METHODS: Genes of cL chain fragment of cFab antibody HAb18 from the plasmids pET32a/Fab were subcloned into vectors pPIC9K.After confirmed by DNA sequence analysis,the recombinant plasmid pPIC9K/cL was transducted into the genome of GS115 Pichia pastoris using integrating technology.Mut+multiple inserted transformants were screened by G418○R and induced by 5 mL/L methanol to express.RESULTS: After 4 days of methanol induction,highyield secretory expression (22 mg/L)of the cL fragments was achieved.Western Blotting assay proved that the expressed protein had specific binding activity with HAb18GE antigen.CONCLUSION: The successful expression of cL of HAb18 in Pichia pastoris lays a solid foundation for the secretory expression of cFab HAb18.
【Keywords】 liver neoplasms；antibodies，monoclonal；chimeric light chain；Pichia；secretory expression
【摘要】 目的： 通过整合，用巴氏毕赤酵母表达抗人肝癌mAb HAb18的cFab的嵌合轻链.方法： 将抗人肝癌mAb cFab/HAb18原核表达载体pET32a/cFab中的cL亚克隆到酵母表达载体pPIC9K，构建成重组质粒pPIC9K/cL测序鉴定.重组质粒pPIC9K/cL整合到酵母菌GS115的染色体上，经G418筛选得到高拷贝转化子及Mut表型鉴定后，用含5 mL/L甲醇的培养基诱导表达.结果： 该系统成功表达了抗人肝癌mAb HAb18cFab的嵌合轻链，表达水平为22 mg/L；Western Blotting证实，表达产物具有良好的HAb18GE结合活性和特异性.结论： 嵌合轻链/HAb18在巴氏毕赤酵母获得成功表达，为高效分泌表达cFab抗体奠定了基础.
【关键词】 肝肿瘤；抗体，单克隆；嵌合轻链；毕赤酵母；分泌表达
0引言
以单抗(monoclonal antibody，mAb)为载体的抗肝癌导向药物研究已取得了较大进展，我们用131I标记HAb18 F(ab′) 2 制备的第二代肝癌放射免疫治疗剂，已完成Ⅱ期临床.但其鼠源性和用消化酶制备的方法限制了进一步的应用；因此，研究人源化的低成本的工程抗体很有必要.以前我们已对mAb的Fab进行了人源化改造，得到嵌合Fab我们选用毕赤酵母表达系统进行了HAb18cFab抗体的分泌表达为高效表达cFab HAb18奠定了良好的基础.
1材料和方法
1.1材料 pET32a/cFab质粒及Top10F'菌株由本实验室制备并保存；酵母表达载体pPIC9K和毕赤酵母宿主菌GS115购自Invitrogen公司；限制性内切酶、T4连接酶及Taq DNA聚合酶购自NEB公司；小量质粒提取试剂盒购自Sigma公司；酵母培养基YPD，YNB为Amresco公司产品；HRP标记羊抗人IgG购自Pierce公司，聚偏氟乙烯膜(PVDF)购自Millipore公司；人肝癌细胞系HCC由本室保存.
1.2方法根据已克隆的抗体cL的基因序列，我们设计了相应的引物，引入了BamHI +NotI酶切位点.引物分别为： 1： 5'AAAGGATCCAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTG3′；2： 5′AGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAGAGATACCCCTT3′;3： 5′AGAGAGGCTG
AAGCTGTGATGACCCAGACTCCCAC 3′;4： 5'GCGCCGGCGGCCGCTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC3′.根据文献[1]及密码子的简并性，将引物中部分密码子的碱基替换而不改变所编码氨基酸，使其为毕赤酵母偏嗜密码子.引物由上海博亚生物工程有限公司合成.以pET32a/cFab质粒为模板，用上述引物采用overlap PCR方法扩增cL链基因.重组质粒构建参照Sambrook方法进行，并进行酶切和测序鉴定.测序由上海博亚生物工程技术服务有限公司完成.参照Invitrogen Pichia Expression Kit将酵母菌GS115制备成感受态，取80 μL与经SacⅠ单酶切线性化的重组表达质粒pPIC9K/cL 10 μg混合，电转化后将200～600 μL菌液涂布于MD/His(134 g/L YNB，04 mg/L biotin，20 g/L dextrose及15 g/L agar)选择平板上，置30℃孵育2~4 d.将His+转化子用灭菌去离子水悬浮，按每平板1×105细胞涂于含G418不同浓度的YPD平板，置于30℃，经72 h培养后，抗G418的克隆长出.将G418高抗性克隆分别对应的点在MM (134 g/L YNB，04 mg/L biotin，5 mL/L methanol及15 g/L agar)和MD选择平板上，确定其表型.筛选阳性菌落接种于BMGY培养基25 mL(10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，134 g/L YNB，10 g/L glycerol及04 mg/L biotin)，30℃培养至A600nm≈30.离心收菌，用BMMY 250 mL培养基(10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，134 g/L YNB，5 mL/L methanol及04 mg/L biotin)重悬培养.每天补加纯甲醇于培养基质中至终浓度为5 mL/L，诱导表达产物用SDSPAGE，ELISA和Western Blotting方法鉴定.ELISA法所用包被抗原为HAb18 G蛋白，一抗为我们表达的cL，二抗为HRP标记的HRP标记的羊抗人IgG，OPD显色，阴性对照为pPIC9K空对照载体转化GS115后的表达上清.Western Blotting方法： 标准HAb18G蛋白经电泳并转印到硝酸纤维素膜后，用我们制备的cL/HAb18作为一抗进行结合，二抗为HRP标记的羊抗人IgG，DAB显色，阴性对照为pPIC9K空对照载体转化GS115后的表达上清.染色胞转染48 h后收集细胞，涂片干燥后，冷丙酮固定15 min，以抗HAb18G 的cL为一抗，FITC 标记的羊抗人特异性IgG 为二抗，行间接免疫荧光染色后，观察结果并照像.实验中以正常细胞作为对照.
2结果
2.1重组质粒pPIC9K/cL载体的构建及鉴定以pET32a/ cFab质粒为模板，用cL链基因引物扩增出目的片段，琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR产物cL链大小为600 bp左右，与预期的大小一致.重组质粒pPIC9 K/cL用BamHⅠ和NotⅠ双酶切，酶切结果显示： cL链基因已正确插入载体中的相应酶切位点，均为单拷贝插入(Fig 1).测序结果表明重组载体中cL链基因序列与已知序列相符合，未发现突变的碱基，且密码子读框正确.
图1重组质粒pPIC9 k/cL载体的构建和鉴定 (略)
2.2 cL链基因在毕赤酵母中的表达 重组质粒pPIC9 K/cL对照载体电转GS115后，于MD平板上皆有大量His+克隆产生，进一步将这些阳性克隆进行G418抗性筛选，结果G418在10 g/L时仍有克隆产生.挑取单克隆菌株，提取酵母DNA，以此为模板进行PCR扩增，得到650 bp的DNA片段，而转入空质粒pPIC9K的酵母没有扩增得到目的片段，证明重组质粒pPIC9 K/L整合入酵母基因DNA组中(Fig 2).将高拷贝转化子于MM和MD选择平板上，确定其表型为Mut+.120 g/L SDSPAGE电泳显示，表达产物Mr 23 000处有一条带，而转入空载体的对照菌无该条带.产物约占总蛋白98%(Fig 3,4)，经HPLC纯化后，表达水平为22 mg/L.ELISA显示表达产物与HAb18 GE 有特异性结合活性(A450 nm∶0431±0021)，而对照未见结合反应，Western Blotting也显示表达产物与HAb18 GE 有特异性结合活性(Fig 5).
图 2-图5 (略)
3讨 论
Pichia pastoris基因表达系统是最近迅速发展的一种外源基因表达系统，表达载体通过同源重组整合入酵母基因组而随同酵母染色体一起复制.同源重组时，毕赤酵母表达质粒可以通过体内和体外2种方式多拷贝整合于毕赤酵母基因组中.由于不同基因具有不同的特性，在毕赤酵母表达时，不同外源蛋白的表达水平会有很大差异，这种多拷贝整合在大多数情况下可以显著增加外源蛋白的表达水平.影响外源基因表达的另一重要因素是基因本身的特性.尽可能多地采用毕赤酵母偏爱使用的遗传密码，优化基因，才可能最大程度地减少翻译受阻或提前终止等现象的发生，提高表达量[1-3].大肠杆菌中进行了HAb18G抗原、Fab/HAb18和cFab/HAb18表达量还不足以进行大规模生产，所以，我们通过Pichia pastoris表达系统获得高效表达.cFab/HAb18的cL在巴氏毕赤酵母表达系统得到成功表达，为在Pichia pastoris中实现cFab的高效表达提供了可靠的实验依据.
【参考文献】
[1] Cregg JM，Cereghino JL，Shi J，et al.Recombinant protein expression in Pichia pastoris[J].Mol Biotechnol，2000；16(1):23-52.
[2] Xing JL，Yang XM，Dong HL，et al.Prokaryotic expression and immunological analysis of extracellular domain of hepatoma associated antigen HAb18G[J].J Tumor Marker Oncol，2003；18(4)：321-331.
[3] 邢金良,杨向民,姚西英，等.抗人肝癌基因工程嵌合Fab抗体的原核表达及复性[J].中华微生物学和免疫学杂志，2004;24(3)：189-193.Xing JL，Yang XM，Yao XY，et al.Prokaryotic expression and renaturation of engineering chimeric Fab antibody against human hepatoma[J].Chin J Microbiol Immunol，2004；24(3)：189-193.
第四军医大学: 1西京医院肝胆外科，2细胞工程研究中心，陕西西安710033
基金项目：国家863计划重点课题基金项目(2001AA2l5101)
编辑袁天峰, 百拇医药(董红霖 邢金良 杨向民 姚西英 李郁 窦科峰 陈志)