706代血浆鲎试剂法检测细菌内毒素的研究
作者：林红宁
单位：肇庆市第一人民医院，广东肇庆 526021
关键词：706代血浆；细菌内毒素；鲎试剂法
广东药学院学报000111
摘 要 建立了706代血浆细菌内毒素检查法。将706代血浆2倍稀释后可排除干扰因素，用标示灵敏度为0.25 Eu.mL-1的鲎试剂检测细菌内毒素有效，可用细菌内毒素检查法代替家兔法作为日常检测706代血浆的热原检查。
中图号 R927.12 文献标识码:A 文章编号:1006-8783(2000)01-0032-02
706代血浆(羟乙基淀粉40氯化钠注射液)为血容量补充药，临床上每日剂量为500～1000 mL，静脉滴注，其发热物质检查标准规定用热原检查法检测[1]，一旦发生输液反应需要确证是否属于热原反应时，用家兔法极为不便，而用细菌内毒素检测法则具有简便、快速、准确性高的优点。但对本品进行干扰初筛试验时发现本品原液对鲎试剂有干扰，现将解决干扰的有关实验及结果报道如下。
, http://www.100md.com
1 实验材料
1.1 药品与试剂 鲎试剂(批号：990106，规格：λ=0.5 Eu/mL、0.1 mL/支；批号：980802，规格：λ=0.25 Eu/mL、0.1 mL/支，均为厦门鲎试剂厂生产；批号：990202B、规格：λ=0.5 Eu/mL、0.1 mL/支；批号：990706，规格：=0.25 Eu/mL、0.1 mL/支，均为湛江安度斯生物有限公司生产)；细菌内毒素工作标准品(批号：9906，效价：5 Eu/支，中国药品生物制品检定所提供)；鲎试剂溶解水(批号：990310，规格：2 mL/支，厦门鲎试剂厂生产)；细菌内毒素检查用水(批号：990520，规格：30 mL/瓶，湛江安度斯生物有限公司生产)；706代血浆(规格：500 mL内含30 g的羟乙基淀粉40与氯化钠4.5 g， 批号：9809241，9810082，9905203，均为江苏国营常熟制药厂产品；批号：9906144为常熟雷允上制药有限公司产品，上述每个批号均经热原检查法[2]抽样检查合格)。
, http://www.100md.com
1.2 器材 超净工作台(型号SZX，上海浦东跃欣科学仪器厂)；电热恒温水浴箱(汕头市医疗器械二厂)；漩涡混合器(XW-80A型，上海医科大学仪器厂)；刻度吸管、小试管等玻璃器皿用前均经除热原处理。
2 实验方法与结果
2.1 鲎试剂(TAL)灵敏度复核 按药典方法[3]复核实验用TAL的灵敏度，结果见表1。
表1 鲎试剂灵敏度复核结果 λ(标示灵敏度)
/ Eu*mL-1
批号
ρ(内毒素)/Eu*mL-1
λc(复核灵敏度)
, http://www.100md.com
/Eu*mL-1
1.0
0.5
0.25
0.125
0.06
阴性对照
0.5
990106
++++
++++
+---------
, 百拇医药 0.38
990202B
++++
++++----------
0.5
0.25
980220
++++
++------------
0.35
980220
++++
, http://www.100md.com +++-----------
0.30
4批TAL灵敏度复核结果λc均在0.5 λ～2.0 λ(包括0.5 λ和2.0 λ)范围内，均符合药典规定，可用于细菌内毒素检查，并以其标示值为灵敏度。
2.2 细菌内毒素限值(L)的确定 根据L=K/M，静脉注射药品的热原反应阈值(K)为5 Eu/kg，本品热原检查的兔剂量[1](M)为10 mL/kg，故L=K/M=5/10=0.5 Eu/mL,本品最大有效稀释度MVD=L/λ=0.5/0.5=1[4]。
2.3 干扰初筛试验
2.3.1 稀释供试品 取0.5 Eu/mL为计算供试品稀释倍数的基准灵敏度(记为λ0.5)，计算出对应λ0.5的稀释倍数MVD0.5：MVD0.5=L/λ0.5=0.5/0.5=1(即原液)，类似可计算出本品需稀释的5个浓度：MVD0.5稀释1倍，MVD0.25稀释2倍，MVD0.125稀释4倍，MVD0.06稀释8倍，MVD0.03稀释16倍，用内毒素检查用水把本品稀释成上述系列浓度备用。
, 百拇医药
2.3.2 阴性及阳性对照 供试品阴性对照(NPC)系列：取厦门产批号990106的TAL(λ=0.5 Eu/mL)及湛江产批号990202B的TAL(λ=0.5 Eu/mL)各10支，分别各加0.1 mL上述稀释好的供试品，再各加0.1 mL内毒素检查用水，每一供试品浓度重复两反应管。供试品阳性对照(PPC)系列：取上述两批TAL各10支，分别各加0.1 mL上述稀释好的供试品，每种浓度两份，再各加0.1 mL己稀释好的2 λ浓度(即1.0 Eu/mL)的内毒素，按药典内毒素检查法的规定进行反应观察结果，反应结果见表2。
表2 各浓度的干扰初筛试验结果
MVD0.5
MVD0.25
MVD0.125
, 百拇医药
MVD0.06
MVD0.03
990106
NPC
-+--------
PPC
++
++
++
++
++
990202B
, 百拇医药
NPC
-+--------
PPC
++
++
++
++
++
结果表明，供试品不经稀释(即稀释倍数为1)时，供试品阴性对照(NPC)均有出现阳性结果，表明不经稀释的样品原液对两厂家的鲎试剂均有干扰，其干扰性质为增强作用，反应的结果属假阳性。当稀释倍数为2 以上时，供试品阴性对照(NPC)系列结果均为阴性，供试品阳性对照(PPC)系列结果均为阳性，表明本品至少需稀释2倍，使用灵敏度λ≤0.25 Eu/mL或相应于各稀释倍数的更高灵敏度的鲎试剂作检查才能消除干扰。
, 百拇医药
2.4 干扰试验 按药典方法作供试品干扰试验。选用4批经热原检查合格的不同厂家的本品，用内毒检查用水将其作2倍稀释(称为S2)。用S2和内毒素检查用水分别制成含细菌内毒素工作标准品0.5、0.25、0.125、0.06 Eu/mL的4种浓度的内毒素溶液。按药典方法[3]进行供试品干扰试验。结果见表3，表4。
以上结果表明，本品经2倍稀释后，使用灵敏度为0.25 Eu/mL的鲎试剂检查细菌内毒素即可消除干扰。
2.5 供试品热原检查 依法检测上述两个厂家四个批号的706代血浆，结果均为阴性，与细菌内毒素检查结果一致，用于临床无一出现热原反应。表3 2倍稀释液的干扰试验结果(TAL：批号980802 λ=0.25 Eu/mL) 溶液
批号
ρ(内毒素)/Eu*mL-1
, 百拇医药
λ
/Eu*mL-1
0.5
0.25
0.125
0.06
NC
内毒素水溶液
++++
++------------
0.35
内毒素S2溶液
, 百拇医药
9906144
++++
++++----------
0.25
9809244
++++
++++----------
0.25
表4 2倍稀释液的干扰试验结果(TAL：批号990706 λ=0.25 Eu/mL) 溶液
批号
ρ(内毒素)/Eu*mL-1
, 百拇医药
λ
/Eu*mL-1
0.5
0.25
0.125
0.06
NC
内毒素水溶液
++++
+++-----------
0.30
内毒素S2溶液
, 百拇医药
9906144
++++
++++
+---------
0.21
9810082
++++
++++----------
0.25
9905203
++++
++++----------
, 百拇医药
0.25
3 讨论
3.1 本文通过初筛试验，确定本品的有效稀释范围及相应的鲎试剂灵敏度范围，从初筛试验确定的样品有效浓度范围内选定2倍稀释液，使用灵敏度为0.25 Eu/mL的鲎试剂作供试品试验，一次就可得无干扰结果，这样可减少作供试品干扰试验的盲目性，减少试剂消耗及节省时间。
3.2 本文采用不同厂家的鲎试剂对不同厂家的706代血浆进行干扰试验，均得到无干扰结果，表明以内毒素检查法用于控制706代血浆的热原是可行的。 参考文献
[1]中华人民共和国卫生部药品标准(二部).第六册(生化药品.第一分册),1998.126.
[2]中国药典(一九九五年版).一九九八年增补本：142(附录XID)
[3]同上.142(附录XIE)
[4]黄清泉，夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计.中国药学杂志，1997，32(7):72.
(收稿日期 1999-10-07), 百拇医药
单位：肇庆市第一人民医院，广东肇庆 526021
关键词：706代血浆；细菌内毒素；鲎试剂法
广东药学院学报000111
摘 要 建立了706代血浆细菌内毒素检查法。将706代血浆2倍稀释后可排除干扰因素，用标示灵敏度为0.25 Eu.mL-1的鲎试剂检测细菌内毒素有效，可用细菌内毒素检查法代替家兔法作为日常检测706代血浆的热原检查。
中图号 R927.12 文献标识码:A 文章编号:1006-8783(2000)01-0032-02
706代血浆(羟乙基淀粉40氯化钠注射液)为血容量补充药，临床上每日剂量为500～1000 mL，静脉滴注，其发热物质检查标准规定用热原检查法检测[1]，一旦发生输液反应需要确证是否属于热原反应时，用家兔法极为不便，而用细菌内毒素检测法则具有简便、快速、准确性高的优点。但对本品进行干扰初筛试验时发现本品原液对鲎试剂有干扰，现将解决干扰的有关实验及结果报道如下。
, http://www.100md.com
1 实验材料
1.1 药品与试剂 鲎试剂(批号：990106，规格：λ=0.5 Eu/mL、0.1 mL/支；批号：980802，规格：λ=0.25 Eu/mL、0.1 mL/支，均为厦门鲎试剂厂生产；批号：990202B、规格：λ=0.5 Eu/mL、0.1 mL/支；批号：990706，规格：=0.25 Eu/mL、0.1 mL/支，均为湛江安度斯生物有限公司生产)；细菌内毒素工作标准品(批号：9906，效价：5 Eu/支，中国药品生物制品检定所提供)；鲎试剂溶解水(批号：990310，规格：2 mL/支，厦门鲎试剂厂生产)；细菌内毒素检查用水(批号：990520，规格：30 mL/瓶，湛江安度斯生物有限公司生产)；706代血浆(规格：500 mL内含30 g的羟乙基淀粉40与氯化钠4.5 g， 批号：9809241，9810082，9905203，均为江苏国营常熟制药厂产品；批号：9906144为常熟雷允上制药有限公司产品，上述每个批号均经热原检查法[2]抽样检查合格)。
, http://www.100md.com
1.2 器材 超净工作台(型号SZX，上海浦东跃欣科学仪器厂)；电热恒温水浴箱(汕头市医疗器械二厂)；漩涡混合器(XW-80A型，上海医科大学仪器厂)；刻度吸管、小试管等玻璃器皿用前均经除热原处理。
2 实验方法与结果
2.1 鲎试剂(TAL)灵敏度复核 按药典方法[3]复核实验用TAL的灵敏度，结果见表1。
表1 鲎试剂灵敏度复核结果 λ(标示灵敏度)
/ Eu*mL-1
批号
ρ(内毒素)/Eu*mL-1
λc(复核灵敏度)
, http://www.100md.com
/Eu*mL-1
1.0
0.5
0.25
0.125
0.06
阴性对照
0.5
990106
++++
++++
+---------
, 百拇医药 0.38
990202B
++++
++++----------
0.5
0.25
980220
++++
++------------
0.35
980220
++++
, http://www.100md.com +++-----------
0.30
4批TAL灵敏度复核结果λc均在0.5 λ～2.0 λ(包括0.5 λ和2.0 λ)范围内，均符合药典规定，可用于细菌内毒素检查，并以其标示值为灵敏度。
2.2 细菌内毒素限值(L)的确定 根据L=K/M，静脉注射药品的热原反应阈值(K)为5 Eu/kg，本品热原检查的兔剂量[1](M)为10 mL/kg，故L=K/M=5/10=0.5 Eu/mL,本品最大有效稀释度MVD=L/λ=0.5/0.5=1[4]。
2.3 干扰初筛试验
2.3.1 稀释供试品 取0.5 Eu/mL为计算供试品稀释倍数的基准灵敏度(记为λ0.5)，计算出对应λ0.5的稀释倍数MVD0.5：MVD0.5=L/λ0.5=0.5/0.5=1(即原液)，类似可计算出本品需稀释的5个浓度：MVD0.5稀释1倍，MVD0.25稀释2倍，MVD0.125稀释4倍，MVD0.06稀释8倍，MVD0.03稀释16倍，用内毒素检查用水把本品稀释成上述系列浓度备用。
, 百拇医药
2.3.2 阴性及阳性对照 供试品阴性对照(NPC)系列：取厦门产批号990106的TAL(λ=0.5 Eu/mL)及湛江产批号990202B的TAL(λ=0.5 Eu/mL)各10支，分别各加0.1 mL上述稀释好的供试品，再各加0.1 mL内毒素检查用水，每一供试品浓度重复两反应管。供试品阳性对照(PPC)系列：取上述两批TAL各10支，分别各加0.1 mL上述稀释好的供试品，每种浓度两份，再各加0.1 mL己稀释好的2 λ浓度(即1.0 Eu/mL)的内毒素，按药典内毒素检查法的规定进行反应观察结果，反应结果见表2。
表2 各浓度的干扰初筛试验结果
MVD0.5
MVD0.25
MVD0.125
, 百拇医药
MVD0.06
MVD0.03
990106
NPC
-+--------
PPC
++
++
++
++
++
990202B
, 百拇医药
NPC
-+--------
PPC
++
++
++
++
++
结果表明，供试品不经稀释(即稀释倍数为1)时，供试品阴性对照(NPC)均有出现阳性结果，表明不经稀释的样品原液对两厂家的鲎试剂均有干扰，其干扰性质为增强作用，反应的结果属假阳性。当稀释倍数为2 以上时，供试品阴性对照(NPC)系列结果均为阴性，供试品阳性对照(PPC)系列结果均为阳性，表明本品至少需稀释2倍，使用灵敏度λ≤0.25 Eu/mL或相应于各稀释倍数的更高灵敏度的鲎试剂作检查才能消除干扰。
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2.4 干扰试验 按药典方法作供试品干扰试验。选用4批经热原检查合格的不同厂家的本品，用内毒检查用水将其作2倍稀释(称为S2)。用S2和内毒素检查用水分别制成含细菌内毒素工作标准品0.5、0.25、0.125、0.06 Eu/mL的4种浓度的内毒素溶液。按药典方法[3]进行供试品干扰试验。结果见表3，表4。
以上结果表明，本品经2倍稀释后，使用灵敏度为0.25 Eu/mL的鲎试剂检查细菌内毒素即可消除干扰。
2.5 供试品热原检查 依法检测上述两个厂家四个批号的706代血浆，结果均为阴性，与细菌内毒素检查结果一致，用于临床无一出现热原反应。表3 2倍稀释液的干扰试验结果(TAL：批号980802 λ=0.25 Eu/mL) 溶液
批号
ρ(内毒素)/Eu*mL-1
, 百拇医药
λ
/Eu*mL-1
0.5
0.25
0.125
0.06
NC
内毒素水溶液
++++
++------------
0.35
内毒素S2溶液
, 百拇医药
9906144
++++
++++----------
0.25
9809244
++++
++++----------
0.25
表4 2倍稀释液的干扰试验结果(TAL：批号990706 λ=0.25 Eu/mL) 溶液
批号
ρ(内毒素)/Eu*mL-1
, 百拇医药
λ
/Eu*mL-1
0.5
0.25
0.125
0.06
NC
内毒素水溶液
++++
+++-----------
0.30
内毒素S2溶液
, 百拇医药
9906144
++++
++++
+---------
0.21
9810082
++++
++++----------
0.25
9905203
++++
++++----------
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0.25
3 讨论
3.1 本文通过初筛试验，确定本品的有效稀释范围及相应的鲎试剂灵敏度范围，从初筛试验确定的样品有效浓度范围内选定2倍稀释液，使用灵敏度为0.25 Eu/mL的鲎试剂作供试品试验，一次就可得无干扰结果，这样可减少作供试品干扰试验的盲目性，减少试剂消耗及节省时间。
3.2 本文采用不同厂家的鲎试剂对不同厂家的706代血浆进行干扰试验，均得到无干扰结果，表明以内毒素检查法用于控制706代血浆的热原是可行的。 参考文献
[1]中华人民共和国卫生部药品标准(二部).第六册(生化药品.第一分册),1998.126.
[2]中国药典(一九九五年版).一九九八年增补本：142(附录XID)
[3]同上.142(附录XIE)
[4]黄清泉，夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计.中国药学杂志，1997，32(7):72.
(收稿日期 1999-10-07), 百拇医药