解毒利肺口服液对病毒性肺炎小鼠免疫功能的影响
摘要：【目的】研究解毒利肺口服液(简称JLOL，主要由金银花、连翘、黄芩、川贝等组成)对感染病毒机体免疫系统的影响。【方法】60只小鼠随机分为5组：正常对照组、模型对照组、病毒唑组、JLOL大剂量组及JLOL小剂量组。运用流感病毒鼠肺适应株(FM1)感染小鼠制成病毒性肺炎模型，观察JLOL对病毒性肺炎小鼠血浆中细胞因子白细胞介素1(IL1)、白细胞介素2(IL2)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和干扰素γ(IFNγ)水平的影响。【结果】模型对照组与正常对照组比较，IL1及IFNγ水平降低，TNFα水平升高(均P<001)，IL2虽有降低趋势，但差异无显著性(P>005)。用JLOL治疗后，血浆中IL2及IFNγ水平升高，TNFα水平降低(P<005或P<001)；IL1水平有升高趋势，但差异无显著性(P>005)。【结论】该药能提高病毒性肺炎小鼠IL2及IFNγ水平从而增强机体抗病毒感染的免疫功能，并通过抑制TNFα的过量产生，减轻免疫性病理损害。
关键词：解毒利肺口服液/治疗应用；肺炎，病毒性/中药疗法；白细胞介素1/血液；白细胞介素2/血液；肿瘤坏死因子/血液； 干扰素Ⅱ型/血液
解毒利肺口服液(JLOL)是本院为防治传染性非典型肺炎而创的中药复方制剂。该药具有辛凉解表、清热解毒、宣肺止咳的作用，临床用于治疗病毒性呼吸道感染具有较好疗效，本实验观察了该药对流感病毒肺炎小鼠血浆中与病毒感染密切相关的细胞因子白细胞介素1(IL1)、白细胞介素2(IL2)、肿瘤坏死因子α(TNFα)及干扰素γ(IFNγ)水平的影响，从分子水平探讨JLOL的药理作用机制。
1 材料与方法
11 材料
111 病毒
流感病毒鼠肺适应株(FM1)，由中国医学科学院病毒研究所提供。
112 动物
C57BL/6小鼠，雄性，5周龄；BALB/c小鼠，雄性，体重16～18g；昆明种小鼠，SPF级，雌雄各半，体重18～22g，由广州军区广州总医院实验动物中心提供，合格证号为粤检证字第2002B020号。
113 细胞株
L929小鼠纤维母细胞瘤细胞株，由广州军区广州总医院医学实验科细胞室常规冻存、复苏及传代培养。
114 药物
JLOL由广州军区总医院医学实验科研制，含生药量为1kg/L(广州军区卫生部制剂批准文号03LS0012)，主要由金银花、连翘、黄芩、川贝、桔梗、鱼腥草、知母、甘草等11味中药组成。药物制备：将其中的金银花、连翘提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；蒸馏后的药渣与其他药物混合加水煎煮3次，每次1h，合并煎液，滤过。滤液与上述水溶液合并，浓缩，待冷至室温，加乙醇使含量为65%(体积分数)，混匀，静置后，去上清液回收乙醇，浓缩至相对密度为110～115(温度为90～95℃)，浓缩液再与挥发油合并，加入矫味剂，调节pH值至规定范围，再加水至1000mL，混匀，静置，滤过，灌装，灭菌，即得；病毒唑注射液，江苏制药厂生产，批号020105。
115 试剂与仪器
刀豆素A(ConA)、脂肪多糖(LPS)、萘替乙二胺、磺胺、植物血凝素(PHA)均为Sigma公司产品(美国)；放线菌素D(Serva公司产品)；2g/L结晶紫、10g/L SDS、RPMI 1640培养基均为GIBCO公司产品(美国)；噻唑蓝(MTT)为Fluka公司产品(瑞士)；酶标仪：BioRed 255型(美国)；CO2细胞培养箱RK I 1001 B型(日本)；96孔细胞培养板(NUNC，丹麦)。
12 方法
121 动物分组及给药
昆明种小鼠60只，随机分成5组，每组12只，分别为正常对照组、模型对照组、病毒唑组(009g·kg-1·d-1)、JLOL大剂量组(50g·kg-1·d-1)和JLOL小剂量组(25g·kg-1·d-1)。除正常对照组外，其他各组在感染病毒前分别灌服生理盐水、病毒唑和大、小剂量的JLOL 2次，感染后灌胃12次，灌胃容量为每次05mL，每日2次。
122 动物感染方法及血浆制备
各组小鼠轻度乙醚麻醉后，正常对照组用生理盐水滴鼻，每只50μL，其余各组以同体积FM1病毒液感染，感染病毒量为24倍LD50，于感染后第6天，摘眼球取血，肝素抗凝，分离血浆，置-20℃保存待测。
123 IL1测定
采用胸腺细胞法[1]。按常规以5周龄C57BL/6小鼠，制备胸腺单个细胞悬液，调整细胞浓度至1×1010/L。取50μL加入96孔板后，分别加入体积比为1∶20稀释的待测血浆，每孔25μL，并设3复孔和阴性对照孔，再加PHA 25μL/孔(终浓度为1mg/L)。置37℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养72h后，以MTT法用酶标仪测吸光度D(570nm)值，以示各组动物血浆中IL1水平。
124 IL2测定
采用淋巴母细胞法[1]。用5周龄C57BL/6小鼠，无菌取脾脏，按常规制备单个细胞悬液。以含ConA(5mg/L)的5∶100小牛血清RPMI 1640培养液调整细胞浓度至4×109/L，在温度为37℃，体积分数为5%CO2条件下培养48h，弃上清液并洗细胞后，再用体积比为1∶10小牛血清RPMI 1640培养液调节细胞浓度至2×109/L；于96孔培养板内加入此细胞悬液，100μL/孔，并分别加入按1∶20稀释的各待测血浆100μL，设3复孔和阴性对照；置37℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养18h后，每孔吸弃100μL上清液，采用MTT法，酶标仪测D(570nm)值，以示各组动物血浆中IL2水平。
125 INFα测定
用结晶紫染色法[1]。按文献制备L929细胞，调整细胞浓度至1×108/L，将此细胞悬液加入96孔培养板，100μL/孔，置37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养；待长成单层细胞后分别加入按1∶20体积稀释的各待测血浆100μL/孔，并设3复孔，再加入放线菌素D 20μL/孔(终浓度为1mg/L)，设阴性对照。置37℃、体积分数为5%CO2条件下培养24h后，以生理盐水洗3次，按常规加入2g/L结晶紫100μL/孔染色，10g/L SDS脱色后，用酶标仪测D(570nm)值，以示各组动物血浆中TNFα水平。
126 IFNγ测定
采用巨噬细胞NO2释放法[2，3]。以30g/L硫乙醇酸盐3mL注入BALB/c小鼠腹腔，3d后摘眼球处死，用含肝素(20U/mL)、无钙镁的冷Hanks液洗腹腔，收获巨噬细胞；4℃洗细胞后，用1∶20小牛血清RPMI 1640培养液调节细胞浓度至1×109/L(活细胞超过95%)，加入96孔培养板，100μL/孔，置37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养48h，弃上清液后，分别加入按1∶20稀释的各待测血浆，50μL/孔；阴性对照孔以培养液代替，并作3复孔，同时加20μg/L的LPS，50μL/孔；放37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养48h后，每孔取上清70μL，对应加入酶标板中，再加Griess液，70μL/孔，置室温10min后，阳性即显示樱桃红色。用酶标仪测D(530nm)值，以示待测样品中IFNγ的水平。
127 统计学处理
采用t检验。
2 结果
21 JLOL对FM1株病毒感染小鼠血浆中IL1、IL2、TNFα水平的影响
表1结果表明，与正常对照组比较，经流感病毒FM1感染后的小鼠血浆IL1及IFNγ水平降低，TNFα水平升高(均P<001)，IL2有降低趋势，但差异无显著性(P>005)。经JLOL治疗后IL1水平有上升趋势，但与模型对照组比较，差异无显著性(P>005)。JLOL大、小剂量组均能促进血浆中IL2的产生(与模型对照组比较，P<001或P<005)，而病毒唑对血浆中IL2水平无明显影响。JLOL大、小剂量均能降低血浆中TFNα水平(P<005或P<001)，其作用与病毒唑相仿(P>005)。JLOL大、小剂量组及病毒唑组血浆中IFNγ的水平均升高(P<005或P<001)，JLOL大、小剂量与病毒唑之间差异无显著性(P>005)。表1 JLOL对小鼠血浆中IL1、IL2、TNFα及IFNγ水平的影响(略)
3 讨论
解毒利肺口服液是本院在防治传染性非典型肺炎过程中研制的中药新药复方制剂，已获广州军区卫生部医院制剂批准文号，临床用于治疗呼吸道病毒感染性疾病，取得了显著的疗效。方中金银花、连翘既有辛凉透邪清热之效，又具芳香辟秽解毒之功；桔梗、川贝母、鱼腥草解热散结，宣肺利咽，化痰止咳，开痰气之郁结，通胸膈之痹塞；知母、甘草清热养阴，既防热毒化燥伤阴，又可制约连翘、鱼腥草等苦寒药损伤胃气，在辛凉解表、宣肺止咳的同时辅以清热养阴、顾护正气的药物，体现祛邪不忘扶正的治法。
本实验观察了该药对部分免疫细胞因子的作用，实验结果显示，在流感病毒感染小鼠产生肺炎的过程中，小鼠血浆中IL1及IFNγ水平降低，同时IL2水平也有降低趋势，而TNFα水平升高，提示病毒感染后引起了机体免疫功能的抑制和失调。经JLOL治疗后，血浆中IL2及IFNγ水平均升高，说明该药可促进病毒感染动物IL2及IFNγ的产生。这两种细胞因子均能增强细胞毒性T细胞(CTL)作用，并激活自然杀伤(NK)细胞，已有研究表明，机体内NK细胞、IFNγ和IL2相互作用，形成免疫网络，增强抗病毒和免疫调节作用[4，5]，也构成了机体赖以祛邪的“正气”的一部分，提示该药具有扶助正气，提高机体抗病毒感染的免疫作用。实验还表明，药物治疗后，血浆中TNFα水平降低，这对于减轻机体免疫性病理损害具有重要意义。在病毒感染过程中，由病毒诱导的某些细胞因子如TNFα、IL1等均有致炎作用，是构成免疫性病理损害的重要因素，阻断TNFα等的过量产生，可以减轻或清除其对器官的有害作用[6，7]。在腺病毒感染小鼠模型中，早期浸润阶段的鼠肺及血浆中均检测到较高效价的TNFα、IL1、IL6，提示这些细胞因子在炎症产生过程中具有重要作用[8]。本实验观察了JLOL对流感病毒肺炎小鼠血中细胞因子的影响，从分子水平揭示了部分治疗机理，为该药的实验研究和临床运用提供了参考依据。
参考文献：
[1]钱玉昆.实用免疫学新技术[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1994.46-55.
[2]倪若愚，郭劲松，罗端德.巨噬细胞NO2释放法检测小鼠IFNγ[J].上海免疫学杂志，1995，15(2)：84.
[3]Aihao H Ding,Carif Naxhan,Dennis J S.Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages[J].Immunol,1988,141(10):2407.
[4]全伯泉.细胞和分子生物学[M].北京：世界图书出版公司，1995.135.
[5]杨贵贞.医学免疫学[M].长春：吉林科学技术出版社，1995.45，83.
[6]孙永良，张立煌，方海林，等.病毒性肝炎患者IL1、IL6和TNFα活性的检测[J].中华微生物学和免疫学杂志，1994，14(8)：187.
[7]樊万虎，张成文.肿瘤坏死因子与病毒性疾病[J].中华实验临床免疫学杂志，1993，5(3)：47.
[8]Ginsberg,Moldawer L L,Sehgal P B,et al.A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adanovirus pneumonia[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(5):1651.
(广州军区广州总医院医学实验科，广州510010), 百拇医药(石世德，周民伟，李建军，郑文岭)
关键词：解毒利肺口服液/治疗应用；肺炎，病毒性/中药疗法；白细胞介素1/血液；白细胞介素2/血液；肿瘤坏死因子/血液； 干扰素Ⅱ型/血液
解毒利肺口服液(JLOL)是本院为防治传染性非典型肺炎而创的中药复方制剂。该药具有辛凉解表、清热解毒、宣肺止咳的作用，临床用于治疗病毒性呼吸道感染具有较好疗效，本实验观察了该药对流感病毒肺炎小鼠血浆中与病毒感染密切相关的细胞因子白细胞介素1(IL1)、白细胞介素2(IL2)、肿瘤坏死因子α(TNFα)及干扰素γ(IFNγ)水平的影响，从分子水平探讨JLOL的药理作用机制。
1 材料与方法
11 材料
111 病毒
流感病毒鼠肺适应株(FM1)，由中国医学科学院病毒研究所提供。
112 动物
C57BL/6小鼠，雄性，5周龄；BALB/c小鼠，雄性，体重16～18g；昆明种小鼠，SPF级，雌雄各半，体重18～22g，由广州军区广州总医院实验动物中心提供，合格证号为粤检证字第2002B020号。
113 细胞株
L929小鼠纤维母细胞瘤细胞株，由广州军区广州总医院医学实验科细胞室常规冻存、复苏及传代培养。
114 药物
JLOL由广州军区总医院医学实验科研制，含生药量为1kg/L(广州军区卫生部制剂批准文号03LS0012)，主要由金银花、连翘、黄芩、川贝、桔梗、鱼腥草、知母、甘草等11味中药组成。药物制备：将其中的金银花、连翘提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；蒸馏后的药渣与其他药物混合加水煎煮3次，每次1h，合并煎液，滤过。滤液与上述水溶液合并，浓缩，待冷至室温，加乙醇使含量为65%(体积分数)，混匀，静置后，去上清液回收乙醇，浓缩至相对密度为110～115(温度为90～95℃)，浓缩液再与挥发油合并，加入矫味剂，调节pH值至规定范围，再加水至1000mL，混匀，静置，滤过，灌装，灭菌，即得；病毒唑注射液，江苏制药厂生产，批号020105。
115 试剂与仪器
刀豆素A(ConA)、脂肪多糖(LPS)、萘替乙二胺、磺胺、植物血凝素(PHA)均为Sigma公司产品(美国)；放线菌素D(Serva公司产品)；2g/L结晶紫、10g/L SDS、RPMI 1640培养基均为GIBCO公司产品(美国)；噻唑蓝(MTT)为Fluka公司产品(瑞士)；酶标仪：BioRed 255型(美国)；CO2细胞培养箱RK I 1001 B型(日本)；96孔细胞培养板(NUNC，丹麦)。
12 方法
121 动物分组及给药
昆明种小鼠60只，随机分成5组，每组12只，分别为正常对照组、模型对照组、病毒唑组(009g·kg-1·d-1)、JLOL大剂量组(50g·kg-1·d-1)和JLOL小剂量组(25g·kg-1·d-1)。除正常对照组外，其他各组在感染病毒前分别灌服生理盐水、病毒唑和大、小剂量的JLOL 2次，感染后灌胃12次，灌胃容量为每次05mL，每日2次。
122 动物感染方法及血浆制备
各组小鼠轻度乙醚麻醉后，正常对照组用生理盐水滴鼻，每只50μL，其余各组以同体积FM1病毒液感染，感染病毒量为24倍LD50，于感染后第6天，摘眼球取血，肝素抗凝，分离血浆，置-20℃保存待测。
123 IL1测定
采用胸腺细胞法[1]。按常规以5周龄C57BL/6小鼠，制备胸腺单个细胞悬液，调整细胞浓度至1×1010/L。取50μL加入96孔板后，分别加入体积比为1∶20稀释的待测血浆，每孔25μL，并设3复孔和阴性对照孔，再加PHA 25μL/孔(终浓度为1mg/L)。置37℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养72h后，以MTT法用酶标仪测吸光度D(570nm)值，以示各组动物血浆中IL1水平。
124 IL2测定
采用淋巴母细胞法[1]。用5周龄C57BL/6小鼠，无菌取脾脏，按常规制备单个细胞悬液。以含ConA(5mg/L)的5∶100小牛血清RPMI 1640培养液调整细胞浓度至4×109/L，在温度为37℃，体积分数为5%CO2条件下培养48h，弃上清液并洗细胞后，再用体积比为1∶10小牛血清RPMI 1640培养液调节细胞浓度至2×109/L；于96孔培养板内加入此细胞悬液，100μL/孔，并分别加入按1∶20稀释的各待测血浆100μL，设3复孔和阴性对照；置37℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养18h后，每孔吸弃100μL上清液，采用MTT法，酶标仪测D(570nm)值，以示各组动物血浆中IL2水平。
125 INFα测定
用结晶紫染色法[1]。按文献制备L929细胞，调整细胞浓度至1×108/L，将此细胞悬液加入96孔培养板，100μL/孔，置37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养；待长成单层细胞后分别加入按1∶20体积稀释的各待测血浆100μL/孔，并设3复孔，再加入放线菌素D 20μL/孔(终浓度为1mg/L)，设阴性对照。置37℃、体积分数为5%CO2条件下培养24h后，以生理盐水洗3次，按常规加入2g/L结晶紫100μL/孔染色，10g/L SDS脱色后，用酶标仪测D(570nm)值，以示各组动物血浆中TNFα水平。
126 IFNγ测定
采用巨噬细胞NO2释放法[2，3]。以30g/L硫乙醇酸盐3mL注入BALB/c小鼠腹腔，3d后摘眼球处死，用含肝素(20U/mL)、无钙镁的冷Hanks液洗腹腔，收获巨噬细胞；4℃洗细胞后，用1∶20小牛血清RPMI 1640培养液调节细胞浓度至1×109/L(活细胞超过95%)，加入96孔培养板，100μL/孔，置37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养48h，弃上清液后，分别加入按1∶20稀释的各待测血浆，50μL/孔；阴性对照孔以培养液代替，并作3复孔，同时加20μg/L的LPS，50μL/孔；放37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养48h后，每孔取上清70μL，对应加入酶标板中，再加Griess液，70μL/孔，置室温10min后，阳性即显示樱桃红色。用酶标仪测D(530nm)值，以示待测样品中IFNγ的水平。
127 统计学处理
采用t检验。
2 结果
21 JLOL对FM1株病毒感染小鼠血浆中IL1、IL2、TNFα水平的影响
表1结果表明，与正常对照组比较，经流感病毒FM1感染后的小鼠血浆IL1及IFNγ水平降低，TNFα水平升高(均P<001)，IL2有降低趋势，但差异无显著性(P>005)。经JLOL治疗后IL1水平有上升趋势，但与模型对照组比较，差异无显著性(P>005)。JLOL大、小剂量组均能促进血浆中IL2的产生(与模型对照组比较，P<001或P<005)，而病毒唑对血浆中IL2水平无明显影响。JLOL大、小剂量均能降低血浆中TFNα水平(P<005或P<001)，其作用与病毒唑相仿(P>005)。JLOL大、小剂量组及病毒唑组血浆中IFNγ的水平均升高(P<005或P<001)，JLOL大、小剂量与病毒唑之间差异无显著性(P>005)。表1 JLOL对小鼠血浆中IL1、IL2、TNFα及IFNγ水平的影响(略)
3 讨论
解毒利肺口服液是本院在防治传染性非典型肺炎过程中研制的中药新药复方制剂，已获广州军区卫生部医院制剂批准文号，临床用于治疗呼吸道病毒感染性疾病，取得了显著的疗效。方中金银花、连翘既有辛凉透邪清热之效，又具芳香辟秽解毒之功；桔梗、川贝母、鱼腥草解热散结，宣肺利咽，化痰止咳，开痰气之郁结，通胸膈之痹塞；知母、甘草清热养阴，既防热毒化燥伤阴，又可制约连翘、鱼腥草等苦寒药损伤胃气，在辛凉解表、宣肺止咳的同时辅以清热养阴、顾护正气的药物，体现祛邪不忘扶正的治法。
本实验观察了该药对部分免疫细胞因子的作用，实验结果显示，在流感病毒感染小鼠产生肺炎的过程中，小鼠血浆中IL1及IFNγ水平降低，同时IL2水平也有降低趋势，而TNFα水平升高，提示病毒感染后引起了机体免疫功能的抑制和失调。经JLOL治疗后，血浆中IL2及IFNγ水平均升高，说明该药可促进病毒感染动物IL2及IFNγ的产生。这两种细胞因子均能增强细胞毒性T细胞(CTL)作用，并激活自然杀伤(NK)细胞，已有研究表明，机体内NK细胞、IFNγ和IL2相互作用，形成免疫网络，增强抗病毒和免疫调节作用[4，5]，也构成了机体赖以祛邪的“正气”的一部分，提示该药具有扶助正气，提高机体抗病毒感染的免疫作用。实验还表明，药物治疗后，血浆中TNFα水平降低，这对于减轻机体免疫性病理损害具有重要意义。在病毒感染过程中，由病毒诱导的某些细胞因子如TNFα、IL1等均有致炎作用，是构成免疫性病理损害的重要因素，阻断TNFα等的过量产生，可以减轻或清除其对器官的有害作用[6，7]。在腺病毒感染小鼠模型中，早期浸润阶段的鼠肺及血浆中均检测到较高效价的TNFα、IL1、IL6，提示这些细胞因子在炎症产生过程中具有重要作用[8]。本实验观察了JLOL对流感病毒肺炎小鼠血中细胞因子的影响，从分子水平揭示了部分治疗机理，为该药的实验研究和临床运用提供了参考依据。
参考文献：
[1]钱玉昆.实用免疫学新技术[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1994.46-55.
[2]倪若愚，郭劲松，罗端德.巨噬细胞NO2释放法检测小鼠IFNγ[J].上海免疫学杂志，1995，15(2)：84.
[3]Aihao H Ding,Carif Naxhan,Dennis J S.Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages[J].Immunol,1988,141(10):2407.
[4]全伯泉.细胞和分子生物学[M].北京：世界图书出版公司，1995.135.
[5]杨贵贞.医学免疫学[M].长春：吉林科学技术出版社，1995.45，83.
[6]孙永良，张立煌，方海林，等.病毒性肝炎患者IL1、IL6和TNFα活性的检测[J].中华微生物学和免疫学杂志，1994，14(8)：187.
[7]樊万虎，张成文.肿瘤坏死因子与病毒性疾病[J].中华实验临床免疫学杂志，1993，5(3)：47.
[8]Ginsberg,Moldawer L L,Sehgal P B,et al.A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adanovirus pneumonia[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(5):1651.
(广州军区广州总医院医学实验科，广州510010), 百拇医药(石世德，周民伟，李建军，郑文岭)