肿瘤相关基因的筛选策略
肿瘤的发生发展是一个涉及多因素(遗传、理化及感染因素)、多步骤的贯穿一系列分子事件(多基因参与)的复杂生物过程。细胞染色体的异常和基因的缺陷在肿瘤发生发展过程中起重要作用。1986年，美国麻省总医院的Thaddeus Dryia和哈佛大学的Robert Weinbergd等成功克隆出第一个抑癌基因Rb并由WH Lee等完成全序列测定。自此肿瘤相关基因(癌基因和抑癌基因)的研究开始进入高潮期并延续至今，一百多种癌基因和二十多种抑癌基因被相继发现。目前有关肿瘤发病机制的研究方向有：①以研究基因环境交互作用为主攻方向，主效应基因与环境易感基因研究并重；②遗传机制与表遗传结合研究；③功能基因型(genotype)和表型(phenotype)的相互关系的研究等。肿瘤相关基因的筛选一直为研究者所重视，新方法不断出现。
1 用微卫星DNA多态性标记策略寻找肿瘤相关的候选抑癌基因
抑癌基因的丢失或者功能失活能够引起细胞的恶性转化而致肿瘤发生。可以采用微卫星DNA多态性标记策略去寻找肿瘤相关的抑癌基因。即首先运用微卫星分析的方法寻找具有高杂合性丢失频率的染色体区域，根据连锁分析可知该染色体区域或其临近区域可能存在肿瘤相关的抑癌基因； 然后运用基因的分子内微卫星标志分析、甲基化状态分析、突变检测或候选片段的定位克隆等方法从高杂合性丢失的染色体区域筛选候选的抑癌基因。最后将目的基因转入动物观察其功能表型。
在肺癌、乳癌、子宫和卵巢癌、女性生殖道癌、睾丸癌、肾癌、口腔癌、头颈鳞癌以及食道癌等人类肿瘤中经常发生一些染色体区域的高杂合性丢失[1～9]，提示这些区域可能存在候选的抑癌基因。通过微卫星分析已筛选到一些候选抑癌基因。在人类肿瘤中，3p14.2、3p21.3、9p1322和16q23.324.1等区域杂合性丢失频率较高。 FHIT基因位于3p14.2。FHIT蛋白是一种AP3A水解酶，可能参与DNA复制和细胞周期的调控。在诸如消化道肿瘤、肺癌、乳腺癌和头颈鳞癌中可以检测到FHIT基因的异常转录[10～12]。在肺癌、胃癌和乳癌中还检测到FHIT基因的点突变[13,14]。在肺癌和宫颈癌中观察到Fhit蛋白表达缺失[15,16]。H37和RPL14等基因位于3p21.3。免疫组化分析显示在非小细胞肺癌中H37基因表达水平降低[17]。细胞周期调控相关基因p16位于9p1322。在食管癌中p16可能通过甲基化、杂合性丢失或者突变等机制失活[18]。WWOX基因位于16q23.324.1。在食管癌中WWOX通过杂合性丢失机制失活[19,20]。上述研究提示FHIT、H37、RPL16、p16和WWOX是候选的抑癌基因，它们有可能在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。
2 用基因芯片(DNA chip)技术寻找候选肿瘤相关基因
DNA芯片技术是20世纪90年代后发展的一项DNA分析新技术，它集合了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术。基因芯片技术以其高通量特点而被广泛应用于肿瘤研究中。通过运用多个技术平台，一个基因芯片可以同时检测多达48000个不同的基因。通过基因芯片分析发现不同肿瘤的基因表达谱具有显著差异[21]，并发现了许多新的肿瘤相关基因，这些基因可能成为肿瘤诊断的新标志物。随着成本的降低，基因芯片技术将成为对肿瘤患者进行临床诊断和预后估计的常规手段。例如基因表达微阵列被证明可以用于对乳腺癌、肺癌、脑肿瘤以及急性淋巴细胞性白血病等患者的生存期进行预测；表达谱分析可以用于肿瘤的进一步临床分类，这种技术已经用于对淋巴瘤、白血病和乳癌等肿瘤的分类[22]；通过基因表达谱研究Huerta等在转移结肠癌中鉴定出对顺铂诱导凋亡具有抗性的基因包括MCT、GAD67、p19、GSTM3、Cyclin D1、ATM和CO029等[23]。
3 用微阵列比较基因组杂交方法寻找肿瘤相关基因
以微阵列为基础的比较基因组杂交(ArrayCGH)类似于普通的染色体比较基因组杂交，不同的是它运用大的插入DNA克隆如BAC、YAC和P1 [24,25]或者cDNAs [26,27]以微阵列代替中期染色体作为染色体特异的杂交靶点。通过ArrayCGH方法检测到克隆对应区域DNA拷贝数的变化可能直接和基因序列信息相关，已经成功地运用于乳癌中新的肿瘤相关基因的定位和鉴定[25]。ArrayCGH也已被应用于肾细胞癌的鉴别诊断。
4 用双向电泳质谱技术寻找肿瘤中异常表达的蛋白
用配对的癌和癌旁组织进行蛋白质双向电泳，寻找差异表达蛋白，挖取差异表达的蛋白点并进行蛋白质纯化，对所纯化的蛋白进行质谱鉴定，运用Edman降解等方法测定所纯化蛋白的序列，最后运用反向遗传学(reverse genetics)得到所纯化蛋白的对应基因，即具有蛋白差异表达的基因。这是蛋白质组学研究的常规思路。通过上述方法Xia等发现了食管鳞癌中的一些上调和下调基因[28]。Wulfkuhle等通过对人乳腺导管癌的蛋白质组学研究得到了57个肿瘤异常表达蛋白，14个通过免疫组化方法得到进一步鉴定。这些蛋白包括细胞内膜及囊泡运输的蛋白、离子通道和脂肪酸，及与细胞骨架结构、蛋白伴侣功能、细胞凋亡、基因组不稳定性以及细胞内微环境等相关的蛋白。Kuerer等对浸润性乳癌的研究也说明，蛋白质组学研究是发现新的肿瘤分子标志物的一种有价值的方法[29]。
现代分子生物学技术的不断创新给肿瘤相关基因的筛选提供了越来越多的可行和便捷策略。越来越多的肿瘤相关基因也将被发现和鉴定，这将为肿瘤的基因诊断和治疗提供特异的靶基因。
参考文献：
[1]Morita R, Ishikawa J, Tsutstumi M, et al. Allelotype of renal cell carcinoma[J]. Cancer Res，1991,51(3): 820
[2]hlen T, Dubeau L. Loss of heterozygosity on the choromosomal segments 3p, 6q, and 11p in human ovarian carcinomas[J]. Oncogene,1990,5(2): 219
[3]Jones MH, Nakamura Y. Deletion mapping of chromosome 3p in female genital tract malignancies using microsatellite polymorphisms[J]. Oncogene,1992,7(8): 1631
[4]Chen LC, Matsumura K, Deng G, et al. Deletion of two separate regions on chromosome 3p in breast cancers[J]. Cancer Res,1994,54(11): 3021
[5]Wu CL, Sloan P, Read AP, et al. Deletion mapping on the short arm of chromosome 3 in squamous cell carcinoma of the oral cavity[J]. Cancer Res,1994,54: 6484
[6]Kok K, Naylor SL, Buys CHCM. Deletions of the short arm of chromosome 3 in solid tumors and the search for suppressor genes[J]. Adv Cancer Res,1997,71: 27
[7]Shriver SP, Shiver MD, Tirpak DL, et al. Trinucleotide repeat length variation in the human ribosomal protein L14 gene (RPL14): localization to 3p21.3 and loss of heterozygosity in lung and oral cancers[J]. Mutation Reserch Genomics,1998, 406: 9
[8]Califano J, Leong PL, Koch WM, et al. Second esophageal tumors in patients with head and neck squamous cell carcinoma: an assessment of clonal relationships[J]. Clin Cancer Res,1999,5(7): 1862
[9]Hu N, Roth MJ, Polymeropolous M, et al. Identification of novel regions of allelic loss from a genomewide scan of esophageal squamouscell carcinoma in a highrisk Chinese population[J]. Genes Chromosomes Cancer,2000,27(3): 217
[10]Ohta M, Inoue H, Cotticelli MG, et al. The FHIT gene, spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinomaassociated t(3:8) break point, is abnormal in digestive tract cancers[J]. Cell,1996,84: 587
[11]Sozzi G, Veronese ML, Negrini M, et al. The FHIT gene at 3p14.2 is abnormal in lung cancer[J]. Cell ，1996，85: 17
[12]Negrini M, Monaco C, Vorechovsky I, et al. The FHIT gene at 3p14.2 is abnormal in breast carcinomas[J]. Cancer Res,1996,56: 3173
[13]Gemma A, Hagiwara K, Ke Y, et al. FHIT mutations in human primary gastric cancer[J]. Cancer Res,1997,57: 1435
[14]Ahmadian M, Wistuba II, Fong KM, et al. Analysis of the FHIT gene and FRA3B region in sporadic breast cancer, preneoplastic lesions, and familial breast cancer prohands[J]. Cancer Res,1997,57: 3664
[15]Greenspan DL, Connolly DC, Wu R, et al. Loss of FHIT expression in cervical cell lines and primary tumors[J]. Cancer Res,1997,57: 4692
[16]Sizzi G, Tornielli S, Tagliabue E, et al. Absence of Fhit protein in primary lung tumors and cell lines with FHIT gene abnormalities[J].Cancer Res，1997,57: 5207
[17]Oh J, West AR, Fishbein MC, et al. A candidate tumor suppressor gene, H37, from the human lung cancer tumor suppressor locus 3p21.3[J]. Cancer Res，2002，62: 3207
[18]Tokugawa T, Sugihara H, Tani T, et al. Modes of silencing of p16 in development of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer Res，2002，62: 4938
[19]Kuroki T, Trapasso F, Shiraishi T, et al. Genetic alterations of the tumor suppressor WWOX in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer Res，2002，62: 2258
[20]LudesMeyers JH, Bednarek AK, Popescu NC, et al. WWOX, the common chromosomal fragile site, FRA16D, cancer gene[J]. Cytogenet Genome Res，2003，100(14): 101
[21]Yeatman TJ. The future of clinical cancer management: one tumor, one chip[J]. Am Surg，2003，69(1): 41
[22]Liu ET. 89 Classification of cancers by expression profiling[J]. Curr Opin Genet Dev，2003，13(1): 97
[23]Huerta S, Harris DM, Jazirehi A, et al. Gene expression profile of metastatic colon cancer cells resistant to cisplatininduced apoptosis[J]. Int J Oncol， 2003，22(3): 663
[24]Pinkel D, Segraves R, Sudar D, et al. High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays[J]. Nat Genet，1998; 20: 207
[25]Albertson DG, Ylstra B, Segraves R, et al. Quantitative mapping of amplicon structure by array CGH identifies CYP24 as a candidate oncogene[J]. Nat Genet，2000，25: 144
[26]Pollack JR, Perou CM, Alizadeh AA, et al. Genomewide analysis of DNA copy number changes using cDNA microarrays[J]. Nat Genet，1999，23: 41
[27]Heiskanen MA, Bittner ML, Chen Y, et al. Detection of gene amplification by genomic hybridization to cDNA microarrays[J]. Cancer Res，2000，60: 799
[28]Xia SH, Hu H, Hu LP, et al. Analysis of proteins with altered expression in human esophageal squamous cell carcinomas[J]. Ai Zheng，2002，21(1): 11
[29]Wulfkuhle JD, Sgroi DC, Krutzsch H, et al. Proteomics of human breast ductal carcinoma in situ[J]. Cancer Res，2002，62(22): 6740
(咸宁学院医学院病理学教研室，湖北 咸宁 437100), http://www.100md.com(刘复兴)
1 用微卫星DNA多态性标记策略寻找肿瘤相关的候选抑癌基因
抑癌基因的丢失或者功能失活能够引起细胞的恶性转化而致肿瘤发生。可以采用微卫星DNA多态性标记策略去寻找肿瘤相关的抑癌基因。即首先运用微卫星分析的方法寻找具有高杂合性丢失频率的染色体区域，根据连锁分析可知该染色体区域或其临近区域可能存在肿瘤相关的抑癌基因； 然后运用基因的分子内微卫星标志分析、甲基化状态分析、突变检测或候选片段的定位克隆等方法从高杂合性丢失的染色体区域筛选候选的抑癌基因。最后将目的基因转入动物观察其功能表型。
在肺癌、乳癌、子宫和卵巢癌、女性生殖道癌、睾丸癌、肾癌、口腔癌、头颈鳞癌以及食道癌等人类肿瘤中经常发生一些染色体区域的高杂合性丢失[1～9]，提示这些区域可能存在候选的抑癌基因。通过微卫星分析已筛选到一些候选抑癌基因。在人类肿瘤中，3p14.2、3p21.3、9p1322和16q23.324.1等区域杂合性丢失频率较高。 FHIT基因位于3p14.2。FHIT蛋白是一种AP3A水解酶，可能参与DNA复制和细胞周期的调控。在诸如消化道肿瘤、肺癌、乳腺癌和头颈鳞癌中可以检测到FHIT基因的异常转录[10～12]。在肺癌、胃癌和乳癌中还检测到FHIT基因的点突变[13,14]。在肺癌和宫颈癌中观察到Fhit蛋白表达缺失[15,16]。H37和RPL14等基因位于3p21.3。免疫组化分析显示在非小细胞肺癌中H37基因表达水平降低[17]。细胞周期调控相关基因p16位于9p1322。在食管癌中p16可能通过甲基化、杂合性丢失或者突变等机制失活[18]。WWOX基因位于16q23.324.1。在食管癌中WWOX通过杂合性丢失机制失活[19,20]。上述研究提示FHIT、H37、RPL16、p16和WWOX是候选的抑癌基因，它们有可能在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。
2 用基因芯片(DNA chip)技术寻找候选肿瘤相关基因
DNA芯片技术是20世纪90年代后发展的一项DNA分析新技术，它集合了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术。基因芯片技术以其高通量特点而被广泛应用于肿瘤研究中。通过运用多个技术平台，一个基因芯片可以同时检测多达48000个不同的基因。通过基因芯片分析发现不同肿瘤的基因表达谱具有显著差异[21]，并发现了许多新的肿瘤相关基因，这些基因可能成为肿瘤诊断的新标志物。随着成本的降低，基因芯片技术将成为对肿瘤患者进行临床诊断和预后估计的常规手段。例如基因表达微阵列被证明可以用于对乳腺癌、肺癌、脑肿瘤以及急性淋巴细胞性白血病等患者的生存期进行预测；表达谱分析可以用于肿瘤的进一步临床分类，这种技术已经用于对淋巴瘤、白血病和乳癌等肿瘤的分类[22]；通过基因表达谱研究Huerta等在转移结肠癌中鉴定出对顺铂诱导凋亡具有抗性的基因包括MCT、GAD67、p19、GSTM3、Cyclin D1、ATM和CO029等[23]。
3 用微阵列比较基因组杂交方法寻找肿瘤相关基因
以微阵列为基础的比较基因组杂交(ArrayCGH)类似于普通的染色体比较基因组杂交，不同的是它运用大的插入DNA克隆如BAC、YAC和P1 [24,25]或者cDNAs [26,27]以微阵列代替中期染色体作为染色体特异的杂交靶点。通过ArrayCGH方法检测到克隆对应区域DNA拷贝数的变化可能直接和基因序列信息相关，已经成功地运用于乳癌中新的肿瘤相关基因的定位和鉴定[25]。ArrayCGH也已被应用于肾细胞癌的鉴别诊断。
4 用双向电泳质谱技术寻找肿瘤中异常表达的蛋白
用配对的癌和癌旁组织进行蛋白质双向电泳，寻找差异表达蛋白，挖取差异表达的蛋白点并进行蛋白质纯化，对所纯化的蛋白进行质谱鉴定，运用Edman降解等方法测定所纯化蛋白的序列，最后运用反向遗传学(reverse genetics)得到所纯化蛋白的对应基因，即具有蛋白差异表达的基因。这是蛋白质组学研究的常规思路。通过上述方法Xia等发现了食管鳞癌中的一些上调和下调基因[28]。Wulfkuhle等通过对人乳腺导管癌的蛋白质组学研究得到了57个肿瘤异常表达蛋白，14个通过免疫组化方法得到进一步鉴定。这些蛋白包括细胞内膜及囊泡运输的蛋白、离子通道和脂肪酸，及与细胞骨架结构、蛋白伴侣功能、细胞凋亡、基因组不稳定性以及细胞内微环境等相关的蛋白。Kuerer等对浸润性乳癌的研究也说明，蛋白质组学研究是发现新的肿瘤分子标志物的一种有价值的方法[29]。
现代分子生物学技术的不断创新给肿瘤相关基因的筛选提供了越来越多的可行和便捷策略。越来越多的肿瘤相关基因也将被发现和鉴定，这将为肿瘤的基因诊断和治疗提供特异的靶基因。
参考文献：
[1]Morita R, Ishikawa J, Tsutstumi M, et al. Allelotype of renal cell carcinoma[J]. Cancer Res，1991,51(3): 820
[2]hlen T, Dubeau L. Loss of heterozygosity on the choromosomal segments 3p, 6q, and 11p in human ovarian carcinomas[J]. Oncogene,1990,5(2): 219
[3]Jones MH, Nakamura Y. Deletion mapping of chromosome 3p in female genital tract malignancies using microsatellite polymorphisms[J]. Oncogene,1992,7(8): 1631
[4]Chen LC, Matsumura K, Deng G, et al. Deletion of two separate regions on chromosome 3p in breast cancers[J]. Cancer Res,1994,54(11): 3021
[5]Wu CL, Sloan P, Read AP, et al. Deletion mapping on the short arm of chromosome 3 in squamous cell carcinoma of the oral cavity[J]. Cancer Res,1994,54: 6484
[6]Kok K, Naylor SL, Buys CHCM. Deletions of the short arm of chromosome 3 in solid tumors and the search for suppressor genes[J]. Adv Cancer Res,1997,71: 27
[7]Shriver SP, Shiver MD, Tirpak DL, et al. Trinucleotide repeat length variation in the human ribosomal protein L14 gene (RPL14): localization to 3p21.3 and loss of heterozygosity in lung and oral cancers[J]. Mutation Reserch Genomics,1998, 406: 9
[8]Califano J, Leong PL, Koch WM, et al. Second esophageal tumors in patients with head and neck squamous cell carcinoma: an assessment of clonal relationships[J]. Clin Cancer Res,1999,5(7): 1862
[9]Hu N, Roth MJ, Polymeropolous M, et al. Identification of novel regions of allelic loss from a genomewide scan of esophageal squamouscell carcinoma in a highrisk Chinese population[J]. Genes Chromosomes Cancer,2000,27(3): 217
[10]Ohta M, Inoue H, Cotticelli MG, et al. The FHIT gene, spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinomaassociated t(3:8) break point, is abnormal in digestive tract cancers[J]. Cell,1996,84: 587
[11]Sozzi G, Veronese ML, Negrini M, et al. The FHIT gene at 3p14.2 is abnormal in lung cancer[J]. Cell ，1996，85: 17
[12]Negrini M, Monaco C, Vorechovsky I, et al. The FHIT gene at 3p14.2 is abnormal in breast carcinomas[J]. Cancer Res,1996,56: 3173
[13]Gemma A, Hagiwara K, Ke Y, et al. FHIT mutations in human primary gastric cancer[J]. Cancer Res,1997,57: 1435
[14]Ahmadian M, Wistuba II, Fong KM, et al. Analysis of the FHIT gene and FRA3B region in sporadic breast cancer, preneoplastic lesions, and familial breast cancer prohands[J]. Cancer Res,1997,57: 3664
[15]Greenspan DL, Connolly DC, Wu R, et al. Loss of FHIT expression in cervical cell lines and primary tumors[J]. Cancer Res,1997,57: 4692
[16]Sizzi G, Tornielli S, Tagliabue E, et al. Absence of Fhit protein in primary lung tumors and cell lines with FHIT gene abnormalities[J].Cancer Res，1997,57: 5207
[17]Oh J, West AR, Fishbein MC, et al. A candidate tumor suppressor gene, H37, from the human lung cancer tumor suppressor locus 3p21.3[J]. Cancer Res，2002，62: 3207
[18]Tokugawa T, Sugihara H, Tani T, et al. Modes of silencing of p16 in development of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer Res，2002，62: 4938
[19]Kuroki T, Trapasso F, Shiraishi T, et al. Genetic alterations of the tumor suppressor WWOX in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer Res，2002，62: 2258
[20]LudesMeyers JH, Bednarek AK, Popescu NC, et al. WWOX, the common chromosomal fragile site, FRA16D, cancer gene[J]. Cytogenet Genome Res，2003，100(14): 101
[21]Yeatman TJ. The future of clinical cancer management: one tumor, one chip[J]. Am Surg，2003，69(1): 41
[22]Liu ET. 89 Classification of cancers by expression profiling[J]. Curr Opin Genet Dev，2003，13(1): 97
[23]Huerta S, Harris DM, Jazirehi A, et al. Gene expression profile of metastatic colon cancer cells resistant to cisplatininduced apoptosis[J]. Int J Oncol， 2003，22(3): 663
[24]Pinkel D, Segraves R, Sudar D, et al. High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays[J]. Nat Genet，1998; 20: 207
[25]Albertson DG, Ylstra B, Segraves R, et al. Quantitative mapping of amplicon structure by array CGH identifies CYP24 as a candidate oncogene[J]. Nat Genet，2000，25: 144
[26]Pollack JR, Perou CM, Alizadeh AA, et al. Genomewide analysis of DNA copy number changes using cDNA microarrays[J]. Nat Genet，1999，23: 41
[27]Heiskanen MA, Bittner ML, Chen Y, et al. Detection of gene amplification by genomic hybridization to cDNA microarrays[J]. Cancer Res，2000，60: 799
[28]Xia SH, Hu H, Hu LP, et al. Analysis of proteins with altered expression in human esophageal squamous cell carcinomas[J]. Ai Zheng，2002，21(1): 11
[29]Wulfkuhle JD, Sgroi DC, Krutzsch H, et al. Proteomics of human breast ductal carcinoma in situ[J]. Cancer Res，2002，62(22): 6740
(咸宁学院医学院病理学教研室，湖北 咸宁 437100), http://www.100md.com(刘复兴)