GABA对大鼠束旁核痛抑制神经元电活动的影响
【摘要】 目的 本实验采用电生理学方法，通过观察侧脑室注射γ-氨基丁酸(GABA)、荷包牡丹碱(Bicuculline,Bic)对大鼠束旁核(PF)痛抑制神经元(PIN)电变化的影响，从而进一步研究GABA与PF在痛觉调制中的作用及其相互关系。结论 本实验结果证明：1)外源性GABA可使正常大鼠PF中痛反应神经元对伤害性刺激的反应减弱，表现为镇痛效应；2)GABA的这种镇痛作用主要是通过GABAA受体介导的。该结果揭示，GABA和PF在痛觉调制中具有非常重要的作用。
【关键词】 束旁核(PF) 痛反应神经元 γ-氨基丁酸(GABA) 荷包牡丹碱(Bic)
The Effects of GABA on Discharges of Pain-related Neurons in PIN
Cong Kai, et al.
(Qiqihar Medical College，Qiqihar, Heilongjiang Province 161042，China)
【Abstract】 Objective The experiment systematically observed the effects of γ-aminobutyric acid (GABA) on the discharges of the pain-related neurons in the pain-inhibition neurons (PIN), in order to further study the role and the interaction of GABA and PF in the painful modulation. Conclusions 1) The exogenous GABA can weaken the responses of pain-excitation neurons in the PF of rats to the noxious stimulation, expressing as analgesic effects. 2) The effects of GABA-induced is mediated by GABAA receptor. All these results revealed that GABA and the PF play a very important role in the modulation of the algesia.
【Key words】 Nucleus parafascicularis (PF) Pain-inhibition neurons (PIN) γ-aminobutyric acid (GABA) Bicuculline(Bic)
GABA是哺乳动物中枢神经系统中主要的抑制性神经递质，具有广泛的生物学效应。GABA广泛分布于中枢神经系统。GABA主要通过与神经细胞表面的GABA受体复合物结合发挥作用。根据受体对激动剂及拮抗剂的敏感性的不同，至少可将GABA受体分为A、B和C三型，一种是促离子型的GABAA受体，当该受体被活化时，调控Cl-通道，引起Cl-内流，Cl-的跨膜流动使膜产生抑制性突触后电位(inhibitory postsynaptic potential,IPSP)，进而引起神经元的抑制，其效应可被特异性拮抗剂荷包牡丹碱(Bicuculline，Bic)阻断[1]。
丘脑束旁核是最重要的痛觉整合中枢[2]，1973年张香桐[3]在研究针刺镇痛的原理中发现，在大鼠PF存在一些对伤害性刺激起兴奋反应的痛敏感神经元，也称为痛兴奋神经元(PEN)。1976年孙明智等在针刺镇痛原理研究中发现，大鼠丘脑束旁核中存在对伤害性刺激呈现抑制反应的神经元(PIN)[4]。并证明中枢各级核团中普遍存在PIN，认为伤害性和镇痛信息传入时经不同的神经通路同时作用于各核团中大量的PEN和PIN,并通过两类神经元的相互配合活动对疼痛的感受加以调制[5-6]。对束旁核的研究指出，束旁核可能与痛觉传导有关，刺激人类丘脑束旁核可加重患者的痛觉症状，而毁损此区则疼痛得到缓解[7]，动物电生理研究也表明该核内存在对伤害性刺激传入冲动敏感的细胞。
1 材料与方法
1.1 动物分组 实验动物及分组50只体重240～280的Wistar:系大鼠，分两组：1)GABA组(侧脑室注入GABA)；2)GABA+Bic组(侧脑室先后注入GABA、Bic)。每组都有相应的盐水对照组(侧脑室注入生理盐水或注入GABA+生理盐水)。
1.2 动物实验前准备 用20%氨基甲酸乙酯(5ml/kg体重)腹腔注射全麻下和5%利多卡因在伤口处局麻下实施常规手术，先后为气管插管、小脑延髓池减压、颅骨开窗、暴露坐骨神经。
1.3 定位及人工呼吸 大鼠头部固定在SN-2.脑立体定位仪上,按照Pellegrino图谱B标系统定位,束旁核(A：-2.2～- 2.6；L、R：1.0～1.4；H：5.5～6.5)；在侧脑室(A：0.1；R：1.5；H:：3.0)插入外径0.8mm的不锈钢套管供注药用。动物清醒后，腹腔注射氯化筒箭毒碱(1mg/kg体重)制动，行间歇正压人工呼吸，呼吸频率70次/分。
1.4 伤害性刺激 以电刺激坐骨神经作为伤害性刺激。以强度5mA、波宽0.3ms、间隔5ms、脉冲5个和主周期5s的串脉冲刺激坐骨神经作为伤害性刺激，以触毛、移动下肢关节作为非伤害性刺激，来鉴别神经元性质。
1.5 放电记录及处理 将玻璃微电极固定在SM-21微电极操纵器上，并插入PF内，记录核团内神经元的电活动。玻璃微电极引导出的神经元放电的信号，经源跟随器排除干扰，输入信号放大器，显示在VC-9示波器上，同时对电信号进行监听，用ST-CH707X双道磁带录音机记录神经元放电。实验后将记录结果经Powerlab/8s数据处理器，用Chart v 4.1.2软件分析放电及频率分布，并打印放电及其频率直方图。
1.6 组织学鉴定 实验结束后，将含有2%的滂胺天蓝溶液充灌记录电极，通以阴极直流电25uA，15min，泳出电极内滂胺天蓝，标记记录电极尖端的位置。按图谱鉴定该染色部位与脑室、前联合等结构的位置关系，确定该点即为PF。
1.7 数据处理和统计 实验数据均用均数±标准差(x±s)表示，组间差别的显著性用配对t检验进行分析，检验以P<0.05和P<0.01表示实验组与对照组差异的显著性。
2 结果
2.1 脑室注射GABA对丘脑束旁核PIN电活动的影响 在30只大鼠左、右束旁核中.共记录到32个PIN的放电28个记录完整。其中GABA组18个，对照组10个。比较注射GABA后。两组PTN电活动放电频率和抑制时程的变化。
图1显示，一个PIN在注射GABA后痛诱发放电抑制时程开始缩短，诱发放电频率增加。18个PIN经统计学处理，诱发放电抑制时程由注药前的(0.6±0.03)s缩短至(0.35±0.02)s。注药后2min最为明显，PIN诱发放电的抑制时程缩短至(0.33±0.02)s。注药后即刻至12min，PIN诱发放电的抑制时程与注药前及对照组同期相比具有非常显著性差异(P<0.01)。注药后14min，PIN诱发放电的抑制时程开始逐渐恢复正常。同时，PIN诱发放电频率的平均净增值开始增加，由注药前的(-2.44±0.15)Hz增加至(2.72±0.17)Hz。注药后2min最明显，PIN诱发放电频率的净增值增加至(3.27±0.15)Hz。注药后即刻至6min，PIN诱发放电频率的净增值与注药前及对照组同期相比具有非常显著差异(P<0.01)。注药后8min，净增值开始恢复，恢复至(-1.98±0.06)Hz,此后逐渐恢复。在对照组注生理盐水前、后，PIN电活动并无明显变化。
图1 icv注射GABA对PF中PIN诱发放电的影响(略)
↑:刺激伪迹；▲:注GABA；X：注GABA前；0、2…26：注GABA后的时间(min)。
2.2 脑室注射GABA+Bic对PIN电活动的影响 在GABA+Bic组20只大鼠PF左、右束旁核中.共完整纪录了25个PIN放电，其中GABA+Bic组15个，对照组10个。两组PIN电活动放电频率和抑制时程的变化。
图2所示，一PIN在注入GABA(500μg/10μl)后即刻，PIN诱发放电频率增加，抑制时程缩短；icv内注入Bic(10μg/10μl)后即刻，PIN诱发放电频率减少，抑制时程延长。15个PIN经统计学处理，注GABA后2min，PIN诱发放电抑制时程由注GABA前的(0.76±0.12)s延长至(0.3±0.04)s。2min后注Bic，PIN诱发放电抑制时程由注Bic前的(0.3±0.04)s延长为(0.7±0.08)s(P<0.05)。此时，PIN诱发放电抑制时程与GABA+生理盐水组同期相比具有显著差异。同时，注GABA后2min，PIN诱发放电净增值由注GABA前的(-4.39±0.53)Hz增加至(5.22±0.5)Hz。注GABA2min后注Bic，PIN诱发放电净增值由注Bic前的(5.22±0.5)Hz减少为(-1.95±0.22)Hz(P<0.01)。注Bic即刻至4min，PIN诱发放电净增值与GABA+生理盐水组同期相比具有非常显著性差异。
图2 Bic对抗GABA对PF中PIN诱发放电的影响(略)
↑：刺激伪迹；▲：注GABA；◆：注Bic；X：注GABA前；2：注GABA后时间(min)；4’、8’、30’：注Bic后的时间(min)。
3 讨论
痛觉是多种神经递质和多个中枢部位参与的复杂的整合过程。丘脑束旁核是最重要的痛觉整合中枢，PF内存在着对伤害性刺激呈特异反应的PEN和PIN[3-4]，在伤害性刺激的作用下，痛反应神经元放电的这种特异性改变被公认为观察疼痛的一种电生理指标[8-9]。GABA主要分布于脑内，在外周神经和其他组织中很少。GABA对中枢神经系统具有普遍的抑制作用，是中枢系统重要的抑制性神经递质[1]。荷包牡丹碱(Bic)对抗GABA对PF中痛反应神经元放电的影响尚未见报道，因此，本实验在原工作的基础上，系统地研究了侧脑室注射GABA对正常大鼠PF中痛反应神经元电活动的影响。实验结果表明，侧脑室注射GABA能使PIN痛诱发放电频率增加、抑制时程缩短。揭示，侧脑室注射GABA可使PF中痛反应神经元对伤害性刺激的反应减弱，痛阈值提高，呈现出镇痛的效应。侧脑室注射GABA后，再注入GABAA受体阻断剂Bic能够使PF中PIN诱发放电频率减少、完全抑制时程延长，即脑室内注射Bic能够阻断GABA的镇痛效应。提示，脑内GABA对PF中PIN电活动的影响是通过脑内GABAA受体介导而发挥作用的。本实验从电生理的角度，证明GABA可使PF中痛反应神经元对伤害性刺激的反应性降低，呈现GABA的镇痛效应，表明GABA对PF中痛反应神经元的这种镇痛作用主要是通过兴奋GABAA受体来实现的。
参考文献
[1] 胡师鹏.γ-氨基丁酸受体[J].受体研究技术，2004，4：233-235
[2] 张立新.微电泳乙酸胆碱和阿托品对大鼠丘脑束旁核痛敏神经元电活动的影响[J].生理学报，1993,45：55-60
[3] 张香桐.针刺镇痛过程中丘脑的整合作用[J].中国科学，1973,1：28-52
[4] 孙明智，陈兰生，顾洪伦.针刺对大鼠束旁核单位放电的影响[J].生理学报，1980，32(3)：207-213
[5] 徐满英，王滨明，孙明智.去甲肾上腺素对大鼠丘脑束旁核痛反应神经元电活动的影响[J].动物学报，1986,32(3)：233-241
[6] 李玉荣，孙明智，张季叶，等.丘脑束旁核和中脑网状结构中两个神经元同时放电及刺激中央灰质对其影响[J].中国科学，1984,4：332-338
[7] Apkarian AV.Functional imaging of pain:new insights regarding the role of the cerebral cortex in human pain perception[J].Semin Neurosci,1995,7：279-293
[8] Xu MY,Sun MZ,Yang LZ,et al.Simultaneous electric activities of pain-excitation and pain-inhibition neurons in nucleus parafascicularis of thalamus in rats during acute morphine tolerance[J].Acta Pharmacol Sin,1990，11(3)：200-203
[9] Xu MY,Sun MZ,Yang LZ,et al.Effect of cholecystokinin(CCK) receptor on morphine produced analgesia：a neuronelectrophysiological study[J].Taiwan Pain Med J,1994，4(1)：19-29
作者单位：齐齐哈尔医学院(丛凯)
通讯作者：哈尔滨医科大学(张辉)
邮编 161042, 百拇医药(丛凯 张辉)
【关键词】 束旁核(PF) 痛反应神经元 γ-氨基丁酸(GABA) 荷包牡丹碱(Bic)
The Effects of GABA on Discharges of Pain-related Neurons in PIN
Cong Kai, et al.
(Qiqihar Medical College，Qiqihar, Heilongjiang Province 161042，China)
【Abstract】 Objective The experiment systematically observed the effects of γ-aminobutyric acid (GABA) on the discharges of the pain-related neurons in the pain-inhibition neurons (PIN), in order to further study the role and the interaction of GABA and PF in the painful modulation. Conclusions 1) The exogenous GABA can weaken the responses of pain-excitation neurons in the PF of rats to the noxious stimulation, expressing as analgesic effects. 2) The effects of GABA-induced is mediated by GABAA receptor. All these results revealed that GABA and the PF play a very important role in the modulation of the algesia.
【Key words】 Nucleus parafascicularis (PF) Pain-inhibition neurons (PIN) γ-aminobutyric acid (GABA) Bicuculline(Bic)
GABA是哺乳动物中枢神经系统中主要的抑制性神经递质，具有广泛的生物学效应。GABA广泛分布于中枢神经系统。GABA主要通过与神经细胞表面的GABA受体复合物结合发挥作用。根据受体对激动剂及拮抗剂的敏感性的不同，至少可将GABA受体分为A、B和C三型，一种是促离子型的GABAA受体，当该受体被活化时，调控Cl-通道，引起Cl-内流，Cl-的跨膜流动使膜产生抑制性突触后电位(inhibitory postsynaptic potential,IPSP)，进而引起神经元的抑制，其效应可被特异性拮抗剂荷包牡丹碱(Bicuculline，Bic)阻断[1]。
丘脑束旁核是最重要的痛觉整合中枢[2]，1973年张香桐[3]在研究针刺镇痛的原理中发现，在大鼠PF存在一些对伤害性刺激起兴奋反应的痛敏感神经元，也称为痛兴奋神经元(PEN)。1976年孙明智等在针刺镇痛原理研究中发现，大鼠丘脑束旁核中存在对伤害性刺激呈现抑制反应的神经元(PIN)[4]。并证明中枢各级核团中普遍存在PIN，认为伤害性和镇痛信息传入时经不同的神经通路同时作用于各核团中大量的PEN和PIN,并通过两类神经元的相互配合活动对疼痛的感受加以调制[5-6]。对束旁核的研究指出，束旁核可能与痛觉传导有关，刺激人类丘脑束旁核可加重患者的痛觉症状，而毁损此区则疼痛得到缓解[7]，动物电生理研究也表明该核内存在对伤害性刺激传入冲动敏感的细胞。
1 材料与方法
1.1 动物分组 实验动物及分组50只体重240～280的Wistar:系大鼠，分两组：1)GABA组(侧脑室注入GABA)；2)GABA+Bic组(侧脑室先后注入GABA、Bic)。每组都有相应的盐水对照组(侧脑室注入生理盐水或注入GABA+生理盐水)。
1.2 动物实验前准备 用20%氨基甲酸乙酯(5ml/kg体重)腹腔注射全麻下和5%利多卡因在伤口处局麻下实施常规手术，先后为气管插管、小脑延髓池减压、颅骨开窗、暴露坐骨神经。
1.3 定位及人工呼吸 大鼠头部固定在SN-2.脑立体定位仪上,按照Pellegrino图谱B标系统定位,束旁核(A：-2.2～- 2.6；L、R：1.0～1.4；H：5.5～6.5)；在侧脑室(A：0.1；R：1.5；H:：3.0)插入外径0.8mm的不锈钢套管供注药用。动物清醒后，腹腔注射氯化筒箭毒碱(1mg/kg体重)制动，行间歇正压人工呼吸，呼吸频率70次/分。
1.4 伤害性刺激 以电刺激坐骨神经作为伤害性刺激。以强度5mA、波宽0.3ms、间隔5ms、脉冲5个和主周期5s的串脉冲刺激坐骨神经作为伤害性刺激，以触毛、移动下肢关节作为非伤害性刺激，来鉴别神经元性质。
1.5 放电记录及处理 将玻璃微电极固定在SM-21微电极操纵器上，并插入PF内，记录核团内神经元的电活动。玻璃微电极引导出的神经元放电的信号，经源跟随器排除干扰，输入信号放大器，显示在VC-9示波器上，同时对电信号进行监听，用ST-CH707X双道磁带录音机记录神经元放电。实验后将记录结果经Powerlab/8s数据处理器，用Chart v 4.1.2软件分析放电及频率分布，并打印放电及其频率直方图。
1.6 组织学鉴定 实验结束后，将含有2%的滂胺天蓝溶液充灌记录电极，通以阴极直流电25uA，15min，泳出电极内滂胺天蓝，标记记录电极尖端的位置。按图谱鉴定该染色部位与脑室、前联合等结构的位置关系，确定该点即为PF。
1.7 数据处理和统计 实验数据均用均数±标准差(x±s)表示，组间差别的显著性用配对t检验进行分析，检验以P<0.05和P<0.01表示实验组与对照组差异的显著性。
2 结果
2.1 脑室注射GABA对丘脑束旁核PIN电活动的影响 在30只大鼠左、右束旁核中.共记录到32个PIN的放电28个记录完整。其中GABA组18个，对照组10个。比较注射GABA后。两组PTN电活动放电频率和抑制时程的变化。
图1显示，一个PIN在注射GABA后痛诱发放电抑制时程开始缩短，诱发放电频率增加。18个PIN经统计学处理，诱发放电抑制时程由注药前的(0.6±0.03)s缩短至(0.35±0.02)s。注药后2min最为明显，PIN诱发放电的抑制时程缩短至(0.33±0.02)s。注药后即刻至12min，PIN诱发放电的抑制时程与注药前及对照组同期相比具有非常显著性差异(P<0.01)。注药后14min，PIN诱发放电的抑制时程开始逐渐恢复正常。同时，PIN诱发放电频率的平均净增值开始增加，由注药前的(-2.44±0.15)Hz增加至(2.72±0.17)Hz。注药后2min最明显，PIN诱发放电频率的净增值增加至(3.27±0.15)Hz。注药后即刻至6min，PIN诱发放电频率的净增值与注药前及对照组同期相比具有非常显著差异(P<0.01)。注药后8min，净增值开始恢复，恢复至(-1.98±0.06)Hz,此后逐渐恢复。在对照组注生理盐水前、后，PIN电活动并无明显变化。
图1 icv注射GABA对PF中PIN诱发放电的影响(略)
↑:刺激伪迹；▲:注GABA；X：注GABA前；0、2…26：注GABA后的时间(min)。
2.2 脑室注射GABA+Bic对PIN电活动的影响 在GABA+Bic组20只大鼠PF左、右束旁核中.共完整纪录了25个PIN放电，其中GABA+Bic组15个，对照组10个。两组PIN电活动放电频率和抑制时程的变化。
图2所示，一PIN在注入GABA(500μg/10μl)后即刻，PIN诱发放电频率增加，抑制时程缩短；icv内注入Bic(10μg/10μl)后即刻，PIN诱发放电频率减少，抑制时程延长。15个PIN经统计学处理，注GABA后2min，PIN诱发放电抑制时程由注GABA前的(0.76±0.12)s延长至(0.3±0.04)s。2min后注Bic，PIN诱发放电抑制时程由注Bic前的(0.3±0.04)s延长为(0.7±0.08)s(P<0.05)。此时，PIN诱发放电抑制时程与GABA+生理盐水组同期相比具有显著差异。同时，注GABA后2min，PIN诱发放电净增值由注GABA前的(-4.39±0.53)Hz增加至(5.22±0.5)Hz。注GABA2min后注Bic，PIN诱发放电净增值由注Bic前的(5.22±0.5)Hz减少为(-1.95±0.22)Hz(P<0.01)。注Bic即刻至4min，PIN诱发放电净增值与GABA+生理盐水组同期相比具有非常显著性差异。
图2 Bic对抗GABA对PF中PIN诱发放电的影响(略)
↑：刺激伪迹；▲：注GABA；◆：注Bic；X：注GABA前；2：注GABA后时间(min)；4’、8’、30’：注Bic后的时间(min)。
3 讨论
痛觉是多种神经递质和多个中枢部位参与的复杂的整合过程。丘脑束旁核是最重要的痛觉整合中枢，PF内存在着对伤害性刺激呈特异反应的PEN和PIN[3-4]，在伤害性刺激的作用下，痛反应神经元放电的这种特异性改变被公认为观察疼痛的一种电生理指标[8-9]。GABA主要分布于脑内，在外周神经和其他组织中很少。GABA对中枢神经系统具有普遍的抑制作用，是中枢系统重要的抑制性神经递质[1]。荷包牡丹碱(Bic)对抗GABA对PF中痛反应神经元放电的影响尚未见报道，因此，本实验在原工作的基础上，系统地研究了侧脑室注射GABA对正常大鼠PF中痛反应神经元电活动的影响。实验结果表明，侧脑室注射GABA能使PIN痛诱发放电频率增加、抑制时程缩短。揭示，侧脑室注射GABA可使PF中痛反应神经元对伤害性刺激的反应减弱，痛阈值提高，呈现出镇痛的效应。侧脑室注射GABA后，再注入GABAA受体阻断剂Bic能够使PF中PIN诱发放电频率减少、完全抑制时程延长，即脑室内注射Bic能够阻断GABA的镇痛效应。提示，脑内GABA对PF中PIN电活动的影响是通过脑内GABAA受体介导而发挥作用的。本实验从电生理的角度，证明GABA可使PF中痛反应神经元对伤害性刺激的反应性降低，呈现GABA的镇痛效应，表明GABA对PF中痛反应神经元的这种镇痛作用主要是通过兴奋GABAA受体来实现的。
参考文献
[1] 胡师鹏.γ-氨基丁酸受体[J].受体研究技术，2004，4：233-235
[2] 张立新.微电泳乙酸胆碱和阿托品对大鼠丘脑束旁核痛敏神经元电活动的影响[J].生理学报，1993,45：55-60
[3] 张香桐.针刺镇痛过程中丘脑的整合作用[J].中国科学，1973,1：28-52
[4] 孙明智，陈兰生，顾洪伦.针刺对大鼠束旁核单位放电的影响[J].生理学报，1980，32(3)：207-213
[5] 徐满英，王滨明，孙明智.去甲肾上腺素对大鼠丘脑束旁核痛反应神经元电活动的影响[J].动物学报，1986,32(3)：233-241
[6] 李玉荣，孙明智，张季叶，等.丘脑束旁核和中脑网状结构中两个神经元同时放电及刺激中央灰质对其影响[J].中国科学，1984,4：332-338
[7] Apkarian AV.Functional imaging of pain:new insights regarding the role of the cerebral cortex in human pain perception[J].Semin Neurosci,1995,7：279-293
[8] Xu MY,Sun MZ,Yang LZ,et al.Simultaneous electric activities of pain-excitation and pain-inhibition neurons in nucleus parafascicularis of thalamus in rats during acute morphine tolerance[J].Acta Pharmacol Sin,1990，11(3)：200-203
[9] Xu MY,Sun MZ,Yang LZ,et al.Effect of cholecystokinin(CCK) receptor on morphine produced analgesia：a neuronelectrophysiological study[J].Taiwan Pain Med J,1994，4(1)：19-29
作者单位：齐齐哈尔医学院(丛凯)
通讯作者：哈尔滨医科大学(张辉)
邮编 161042, 百拇医药(丛凯 张辉)