蛋白质组与蛋白质芯片
摘要:
蛋白质组研究目的在于从蛋白水平阐明基因的功能，这对于探索生命的奥秘具有重要的意义。蛋白质芯片是近年来兴起的一种强有力的高通量研究方法，能够一次平行分析成千上万的蛋白样品， 具有很高的敏感度与准确性。它将成为蛋白质组学研究中的强有力的研究方法，并最终架起基因组学与蛋白质组学的桥梁。
1 研究现状
蛋白质组(proteome)是指一个基因，一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。蛋白质组学研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，从而揭示和说明生命活动的基本规律。蛋白质组学可以分为三个领域:
①蛋白质的大规模的分离与鉴定，以及它们的表达后修饰; ②蛋白水平的差异显示在疾病中的运用;③运用当前的一切手段研究蛋白质与蛋白质之间的相互关系。
, http://www.100md.com 与基因组相比蛋白质组具有多样性和可变性。对一个机体而言，基因的数目是恒定的，而蛋白质的种类和数目在同一个机体的不同细胞中各不相同，即使同一细胞在不同的时期，不同条件下，其蛋白质表达也不同 。虽然可以通过cDNA 芯片等方法显示生物体的基因启动状况，但mRNA水平(包括mRNA 的种类和含量)并不能完全反映出蛋白质的表达。另外从研究手段方面来说，蛋白质研究技术比基因技术相对要复杂和困难，不仅氨基酸残基数量多于核甘酸残基，而且在蛋白质组研究中没有一种方法象PCR那样能迅速扩增目的片段，这样对于那些含量很低但对细胞功能起重要作用的蛋白质很难进行大规模的研究。
目前，蛋白质组学研究是以二维凝胶电泳蛋白质分离识别技术和质谱分析鉴定技术两大技术为核心。二维电泳是当前最为常用的蛋白质分离方法，它具有一次分离，能用计算机分析处理，并且能与质谱等分析鉴定方法相匹配的优点。二维凝胶电泳以等电聚焦(isoelectric focusing ， IEF) 为第一向胶，根据蛋白质等电点(PI) 不同而将之分离。最早是采用载体两性电解质pH 梯度等电聚焦，而现在一般采用固向化pH梯度(immobilized pH gradients ，IPG) 等电聚焦。第二向凝胶是SDS-PAGE根据蛋白质分子质量不同来分离蛋白质的方法。相对于分离技术而言，蛋白质组的分析技术较多种选择，如质谱，蛋白序列分析，氨基酸组成分析等。其中质谱分析和蛋白序列分析最为重要，而质谱以其快速，准确，灵敏而成为蛋白质组的主要分析技术。质谱技术的基本原理是将样品离子化后，根据不同离子间质荷比(m/z) 的差异来分离并确定分子量。
, 百拇医药
尽管二维凝胶电泳分离蛋白质的方法在蛋白质组学中占有重要地位，但这种方法具有局限性。首先，我们所得的结果(通过电荷和分子大小分离蛋白质的表达模式)在蛋白质的实际身份和起源基因或基因之间不能建立联系。其次，对于一些表达量低， 但在细胞中起重要作用的蛋白，以及差溶解度极大，极小或极端的蛋白PI值，通过此方法不能够很好的分离。再次，通过二维凝胶分离的蛋白点不一定只代表一种蛋白质。据报道，通过此方法分离的真核组织的蛋白点有20%的点包括了至少两种或两种以上的蛋白质;而在原核组织中这样的情况竟高达40 %。为了寻找蛋白质组研究的其他更有效的方法，有人将蛋白固定在一些固相物质上，做成蛋白阵列用于蛋白质的研究，蛋白质芯片由此产生。
2 蛋白质芯片的特点
蛋白质芯片(protein array)是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新的方法，它类似于基因芯片，是将蛋白质点到固相物质上，然后与要检测的组织或细胞等进行“杂交”，再通过自动化仪器分析得出结果。这里所指的“杂交”是指蛋白与蛋白之间如(抗体与抗原)在空间构象上能特异性的相互识别。此方法与传统的研究方法相比具有如下优点:
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①蛋白质芯片是一种高通量的研究方法，能在一次实验中提供相当大的信息量，使我们能够全面、准确的研究蛋白表达谱，这是传统的蛋白研究方法无法做到的。②蛋白质组芯片的灵敏度高，它可以检测出蛋白样品中微量蛋白的存在， 检测水平已达ng 级。德国科学家Angelika Lueking等用人类甘油醛232磷酸盐脱氢酶( GAPDH， Swiss-Prot P04406) ， 人类热休克蛋白90аC 末端片段(43. 3kD) (HSP90а， Swiss-Prot P07900) 和鼠免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP ， Swiss-Prot P06767) 蛋白抗体制作成抗体阵列，可以检测某种蛋白达到10fm/μl。美国科学家Haab 等运用绿色荧光(green fluorescence) 标记抗体微阵列，用红色荧光(red fluorescence) 标记蛋白混和物，并运用计算机识别(R/ G)的信号强弱，来进行检测，检测水平可达到1ng/ ml [11] 。③蛋白质芯片具有高度的准确性。
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3 蛋白质芯片的运用
蛋白质组芯片可用于蛋白质组学研究中的各个领域，具体来说大致可分为三个方面:
研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用，筛选新的蛋白质。到目前为止，我们研究蛋白与蛋白之间的相互作用，还是沿用酵母双杂交系统。双杂交系统虽然在研究蛋白与蛋白之间的相互作用方面发挥重要作用，但它也具有其内在的不足:通过双杂交观察到的蛋白质的相互作用在真实情况下不一定发生，即假阳性。另外，对于某些蛋白特别是胞浆蛋白和胞膜蛋白在酵母的胞核内不一定能够正确折叠，这样给研究带来了很大的困难。Zhu等运用蛋白质组芯片成功的对涵盖酵母80 %蛋白质进行了研究，构建了酵母蛋白芯片5800个，占包含了大约80 %的酵母蛋白。并用钙调蛋白来筛选酵母蛋白芯片，钙调蛋白是一种非常保守的结合钙的蛋白，它有很多配偶体并参与许多钙控制的细胞过程。通过此方法除鉴定出6 种已知的钙调蛋白的配偶体外，还找到33 种另外的钙调蛋白可能的配偶体，这是其它方法很难做到的。
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另外蛋白质芯片能够用于现在其它方法不能检测到的，如蛋白质-药物、蛋白质-脂质之间的相互作用。Homma 等用磷脂酰肌醇(PI)来筛选磷脂酰肌醇(PI) 的结合蛋白。PI是细胞膜的重要成分，并且是控制许多细胞过程如生长、分化细胞骨架重排、膜运输等的第二信使。因为它们出现的时间很短暂，很少有人研究。这次其用6个脂质体共筛选出150种不同的蛋白，其中52 个属于未知蛋白(占35 %) ，余下的98 个已知蛋白中45个是与膜有关的或是估计具有跨膜区，包括完整的膜蛋白，并具有磷脂的修饰作用，其它8个和磷脂代谢或肌糖磷酸化或是与膜和磷脂功能有关。令人惊奇的是磷脂结合蛋白中有19 个是激酶，其中17个是蛋白激酶。酶是生物体内维持生命活动的重要物质，研究酶及其底物对于我们理解生命活动的本质有着重大的价值。利用蛋白质芯片检测酶和底物的作用，将会为酶及其底物的研究开辟一个新的领域。将119种酵母蛋白激酶制作成蛋白质芯片，运用17 种特异性底物与之作用。他们发现32 种酶能磷酸化1 ，2 种没有谷氨酸，络氨酸结构的底物，27种酶能完全磷酸化有此结构的底物。酵母的蛋白激酶中，除了2 种属于组氨酸家族外，其余的都属于丝氨酸/苏氨酸家族。而有研究则提示酵母的蛋白酶中应该有络氨酸家族的成员。
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蛋白质组芯片还可用于检测蛋白与小分子物质的作用，例如蛋白质与DNA ，RNA分子等。怎样有效地检测蛋白与小分子物质的作用一直困绕着生命科学家，虽然近年来有新的方法出现[16]，但它们有着共同的局限性:均是利用了随机cDNA 文库法，所以编码的蛋白不一定是全长，并且不能完全保证能够正确折叠。而David等利用蛋白质芯片可克服以上的不足。
另外蛋白质组芯片不仅能用于蛋白质组学的研究， 还可以用于药物基因组学，筛选药物的靶分子，以及疾病的诊断，筛选与疾病相关的特异性蛋白标志。
4 存在的问题
蛋白质芯片的制作是决定其运用的关键因素之一， 蛋白质组芯片的制作比当前流行DNA 芯片制作要复杂，特别是涉及大量不同种类的蛋白的高效表达与纯化。其制作方法总的来说分为两类:一种是将菌液直接点在固相物质上如聚偏二乙烯二氟(PVDF) ， 尼龙膜上。用机械人技术，把人类胎儿脑cDNA 表达文库(hEx1) 点阵在酶标板上，然后把细菌群体定格在聚偏二乙烯二氟(PVDF) 过滤膜上，诱导融合蛋白的原位表达并应用抗体进行鉴定[18] 。而后又把这种方法进一步发展，应用一个装有一个平台的点样机械手来自动点细菌融合物形成蛋白质芯片。另一种是先将蛋白纯化后，在通过化学物质偶连到固相物质上。有人先把玻片用乙醛处理，然后把融合蛋白通过N 端的起始胺或蛋白的其它残基与载玻片相连。而Zhu 等则是将蛋白点在涂镍的载玻片上， 再把融合蛋白通过HisX6 尾连到玻片上。尽管上述工作相当成功， 但无论采用哪一种方法蛋白质芯片制作都费时，费力，且成本较高。另外现行蛋白质表达系统也不令人满意， 尽管采用原核表达系统可以大量产生外源蛋白，但对于某些外源性蛋白质来说，却能在包涵体中聚集和累积，而且宿主细菌对某些蛋白不能正确的折叠以及进行磷酸化或糖基化等修饰。这将影响芯片的检测效率。
5 展望
蛋白质组芯片是一种强有力的蛋白质组学研究的新方法，它能一次平行分析成千上万个蛋白质样品，而且具有很高的灵敏度与准确性，这是当前的蛋白质组学研究方法无法相比的。如果利用cDNA 芯片来绘制一个细胞中mRNA的图谱，用来反映基因的表达， 那我们就可以用蛋白质组芯片来绘制与其相对应的蛋白质表达图谱，用来反映各项基因的功能，从而在基因组学和蛋白质组学之间搭建起一坐桥梁。, 百拇医药
蛋白质组研究目的在于从蛋白水平阐明基因的功能，这对于探索生命的奥秘具有重要的意义。蛋白质芯片是近年来兴起的一种强有力的高通量研究方法，能够一次平行分析成千上万的蛋白样品， 具有很高的敏感度与准确性。它将成为蛋白质组学研究中的强有力的研究方法，并最终架起基因组学与蛋白质组学的桥梁。
1 研究现状
蛋白质组(proteome)是指一个基因，一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。蛋白质组学研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，从而揭示和说明生命活动的基本规律。蛋白质组学可以分为三个领域:
①蛋白质的大规模的分离与鉴定，以及它们的表达后修饰; ②蛋白水平的差异显示在疾病中的运用;③运用当前的一切手段研究蛋白质与蛋白质之间的相互关系。
, http://www.100md.com 与基因组相比蛋白质组具有多样性和可变性。对一个机体而言，基因的数目是恒定的，而蛋白质的种类和数目在同一个机体的不同细胞中各不相同，即使同一细胞在不同的时期，不同条件下，其蛋白质表达也不同 。虽然可以通过cDNA 芯片等方法显示生物体的基因启动状况，但mRNA水平(包括mRNA 的种类和含量)并不能完全反映出蛋白质的表达。另外从研究手段方面来说，蛋白质研究技术比基因技术相对要复杂和困难，不仅氨基酸残基数量多于核甘酸残基，而且在蛋白质组研究中没有一种方法象PCR那样能迅速扩增目的片段，这样对于那些含量很低但对细胞功能起重要作用的蛋白质很难进行大规模的研究。
目前，蛋白质组学研究是以二维凝胶电泳蛋白质分离识别技术和质谱分析鉴定技术两大技术为核心。二维电泳是当前最为常用的蛋白质分离方法，它具有一次分离，能用计算机分析处理，并且能与质谱等分析鉴定方法相匹配的优点。二维凝胶电泳以等电聚焦(isoelectric focusing ， IEF) 为第一向胶，根据蛋白质等电点(PI) 不同而将之分离。最早是采用载体两性电解质pH 梯度等电聚焦，而现在一般采用固向化pH梯度(immobilized pH gradients ，IPG) 等电聚焦。第二向凝胶是SDS-PAGE根据蛋白质分子质量不同来分离蛋白质的方法。相对于分离技术而言，蛋白质组的分析技术较多种选择，如质谱，蛋白序列分析，氨基酸组成分析等。其中质谱分析和蛋白序列分析最为重要，而质谱以其快速，准确，灵敏而成为蛋白质组的主要分析技术。质谱技术的基本原理是将样品离子化后，根据不同离子间质荷比(m/z) 的差异来分离并确定分子量。
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尽管二维凝胶电泳分离蛋白质的方法在蛋白质组学中占有重要地位，但这种方法具有局限性。首先，我们所得的结果(通过电荷和分子大小分离蛋白质的表达模式)在蛋白质的实际身份和起源基因或基因之间不能建立联系。其次，对于一些表达量低， 但在细胞中起重要作用的蛋白，以及差溶解度极大，极小或极端的蛋白PI值，通过此方法不能够很好的分离。再次，通过二维凝胶分离的蛋白点不一定只代表一种蛋白质。据报道，通过此方法分离的真核组织的蛋白点有20%的点包括了至少两种或两种以上的蛋白质;而在原核组织中这样的情况竟高达40 %。为了寻找蛋白质组研究的其他更有效的方法，有人将蛋白固定在一些固相物质上，做成蛋白阵列用于蛋白质的研究，蛋白质芯片由此产生。
2 蛋白质芯片的特点
蛋白质芯片(protein array)是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新的方法，它类似于基因芯片，是将蛋白质点到固相物质上，然后与要检测的组织或细胞等进行“杂交”，再通过自动化仪器分析得出结果。这里所指的“杂交”是指蛋白与蛋白之间如(抗体与抗原)在空间构象上能特异性的相互识别。此方法与传统的研究方法相比具有如下优点:
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①蛋白质芯片是一种高通量的研究方法，能在一次实验中提供相当大的信息量，使我们能够全面、准确的研究蛋白表达谱，这是传统的蛋白研究方法无法做到的。②蛋白质组芯片的灵敏度高，它可以检测出蛋白样品中微量蛋白的存在， 检测水平已达ng 级。德国科学家Angelika Lueking等用人类甘油醛232磷酸盐脱氢酶( GAPDH， Swiss-Prot P04406) ， 人类热休克蛋白90аC 末端片段(43. 3kD) (HSP90а， Swiss-Prot P07900) 和鼠免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP ， Swiss-Prot P06767) 蛋白抗体制作成抗体阵列，可以检测某种蛋白达到10fm/μl。美国科学家Haab 等运用绿色荧光(green fluorescence) 标记抗体微阵列，用红色荧光(red fluorescence) 标记蛋白混和物，并运用计算机识别(R/ G)的信号强弱，来进行检测，检测水平可达到1ng/ ml [11] 。③蛋白质芯片具有高度的准确性。
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3 蛋白质芯片的运用
蛋白质组芯片可用于蛋白质组学研究中的各个领域，具体来说大致可分为三个方面:
研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用，筛选新的蛋白质。到目前为止，我们研究蛋白与蛋白之间的相互作用，还是沿用酵母双杂交系统。双杂交系统虽然在研究蛋白与蛋白之间的相互作用方面发挥重要作用，但它也具有其内在的不足:通过双杂交观察到的蛋白质的相互作用在真实情况下不一定发生，即假阳性。另外，对于某些蛋白特别是胞浆蛋白和胞膜蛋白在酵母的胞核内不一定能够正确折叠，这样给研究带来了很大的困难。Zhu等运用蛋白质组芯片成功的对涵盖酵母80 %蛋白质进行了研究，构建了酵母蛋白芯片5800个，占包含了大约80 %的酵母蛋白。并用钙调蛋白来筛选酵母蛋白芯片，钙调蛋白是一种非常保守的结合钙的蛋白，它有很多配偶体并参与许多钙控制的细胞过程。通过此方法除鉴定出6 种已知的钙调蛋白的配偶体外，还找到33 种另外的钙调蛋白可能的配偶体，这是其它方法很难做到的。
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另外蛋白质芯片能够用于现在其它方法不能检测到的，如蛋白质-药物、蛋白质-脂质之间的相互作用。Homma 等用磷脂酰肌醇(PI)来筛选磷脂酰肌醇(PI) 的结合蛋白。PI是细胞膜的重要成分，并且是控制许多细胞过程如生长、分化细胞骨架重排、膜运输等的第二信使。因为它们出现的时间很短暂，很少有人研究。这次其用6个脂质体共筛选出150种不同的蛋白，其中52 个属于未知蛋白(占35 %) ，余下的98 个已知蛋白中45个是与膜有关的或是估计具有跨膜区，包括完整的膜蛋白，并具有磷脂的修饰作用，其它8个和磷脂代谢或肌糖磷酸化或是与膜和磷脂功能有关。令人惊奇的是磷脂结合蛋白中有19 个是激酶，其中17个是蛋白激酶。酶是生物体内维持生命活动的重要物质，研究酶及其底物对于我们理解生命活动的本质有着重大的价值。利用蛋白质芯片检测酶和底物的作用，将会为酶及其底物的研究开辟一个新的领域。将119种酵母蛋白激酶制作成蛋白质芯片，运用17 种特异性底物与之作用。他们发现32 种酶能磷酸化1 ，2 种没有谷氨酸，络氨酸结构的底物，27种酶能完全磷酸化有此结构的底物。酵母的蛋白激酶中，除了2 种属于组氨酸家族外，其余的都属于丝氨酸/苏氨酸家族。而有研究则提示酵母的蛋白酶中应该有络氨酸家族的成员。
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蛋白质组芯片还可用于检测蛋白与小分子物质的作用，例如蛋白质与DNA ，RNA分子等。怎样有效地检测蛋白与小分子物质的作用一直困绕着生命科学家，虽然近年来有新的方法出现[16]，但它们有着共同的局限性:均是利用了随机cDNA 文库法，所以编码的蛋白不一定是全长，并且不能完全保证能够正确折叠。而David等利用蛋白质芯片可克服以上的不足。
另外蛋白质组芯片不仅能用于蛋白质组学的研究， 还可以用于药物基因组学，筛选药物的靶分子，以及疾病的诊断，筛选与疾病相关的特异性蛋白标志。
4 存在的问题
蛋白质芯片的制作是决定其运用的关键因素之一， 蛋白质组芯片的制作比当前流行DNA 芯片制作要复杂，特别是涉及大量不同种类的蛋白的高效表达与纯化。其制作方法总的来说分为两类:一种是将菌液直接点在固相物质上如聚偏二乙烯二氟(PVDF) ， 尼龙膜上。用机械人技术，把人类胎儿脑cDNA 表达文库(hEx1) 点阵在酶标板上，然后把细菌群体定格在聚偏二乙烯二氟(PVDF) 过滤膜上，诱导融合蛋白的原位表达并应用抗体进行鉴定[18] 。而后又把这种方法进一步发展，应用一个装有一个平台的点样机械手来自动点细菌融合物形成蛋白质芯片。另一种是先将蛋白纯化后，在通过化学物质偶连到固相物质上。有人先把玻片用乙醛处理，然后把融合蛋白通过N 端的起始胺或蛋白的其它残基与载玻片相连。而Zhu 等则是将蛋白点在涂镍的载玻片上， 再把融合蛋白通过HisX6 尾连到玻片上。尽管上述工作相当成功， 但无论采用哪一种方法蛋白质芯片制作都费时，费力，且成本较高。另外现行蛋白质表达系统也不令人满意， 尽管采用原核表达系统可以大量产生外源蛋白，但对于某些外源性蛋白质来说，却能在包涵体中聚集和累积，而且宿主细菌对某些蛋白不能正确的折叠以及进行磷酸化或糖基化等修饰。这将影响芯片的检测效率。
5 展望
蛋白质组芯片是一种强有力的蛋白质组学研究的新方法，它能一次平行分析成千上万个蛋白质样品，而且具有很高的灵敏度与准确性，这是当前的蛋白质组学研究方法无法相比的。如果利用cDNA 芯片来绘制一个细胞中mRNA的图谱，用来反映基因的表达， 那我们就可以用蛋白质组芯片来绘制与其相对应的蛋白质表达图谱，用来反映各项基因的功能，从而在基因组学和蛋白质组学之间搭建起一坐桥梁。, 百拇医药