金路捷对大鼠脑神经细胞损伤的保护作用
【摘要】 目的 建立体外培养大鼠脑神经细胞损伤模型，测定损伤前后不同时间LDH的水平，研究金路捷对脑皮质神经元的保护作用机制。方法 原代培养新生Wistar大鼠的脑皮质神经细胞，建立体外脑神经损伤模型，通过测定神经细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量变化观察模型对神经细胞的损伤作用。结果 损伤组与对照组神经细胞损伤后LDH值比较差异均有显著性(P<0.05)，证明损伤模型确实有效；本实验表明治疗组神经元LDH的水平与损伤组比较有差异(P<0.05)，证明金路捷能够起神经元保护作用。结论 损伤模型损伤前后各时间点LDH活力损伤组与对照组比较，表明本实验应用的损伤模型确实使细胞损伤。
【关键词】 神经细胞 LDH 金路捷
The Protective Function of BDNF on Cortical Neuronal Injuries of Big Mouse Wu Yanmin,et al. (Immunology Department of Qiqihar Medical College,Qiqihar,Heilongjiang,161042)
【Abstract】 Objective To establish a model of brain nerve cell injury in vitro and examine the level of LDH at different times.This study also focused on understanding the mechanism of action for the protective effect of BDNF on cortical neurons.This study also focused on understanding the mechanism of action for the protective effect of BDNF on cortical neurons.Methods To cultivate the rat cortical neurons and establish a model of brain nerve cell injury in vitro.According to the levels of LDH in cultivating medium at different times,detecting damage effect of the model.Results The concentration of LDH of the injured group had notable discrepancy compared to that of the control group (P<0.05).It showed the feasibility of the model.；The level of LDH of the injured group had discrepancy compared to that of the BDNF group(P<0.05).It showed both of the drugs could repair neurons.Conclusions The model is easy to perform and facilitate to observe the gradual changes of the injured neurons,which also can simulate the pathological mechanism of traumatic brain injury.and research the changes of the activity of the liquidity of the cell membrane.
【Key words】 Nerve cell LDH BDNF
创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)，也称为脑损伤或头部损伤，是由外伤引起的脑组织损害。为了进一步阐明TBI的病理生理机制，研究药物治疗作用，更好的治疗TBI，国内外学者建立了大量TBI模型，主要包括体外损伤模型和在体损伤模型。以下就TBI模型相关的神经保护药物脑源性神经营养因子[Brain-derived neurotrophic factor,金路捷(BDNF)]作以综述。
金路捷是神经营养因子中的一种,在中枢神经系统中,对神经元的生存、分化、信号的传递[1]、生长及执行功能起重要作用,它是维持神经元功能、再生修复[2]及防止神经元细胞退行性变等多方面发挥极其重要作用的细胞因子[3]。所以,金路捷 对脊髓损伤、脑损伤及其他多种神经系统疾病所致的神经损伤的保护作用,目前已引起人们的广泛瞩目。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 Wistar 大鼠：出生48小时内，由哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物中心提供。
1.1.2 药物及试剂 1)DMEM高糖培养基(GIBCO)。2)胎牛血清(杭州四季青生物工程材料工程公司)。3)多聚-L-赖氨酸(Sigma)。4)谷氨酰胺(上海华联制药有限公司)。5)LDH试剂盒(南京建成生物工程研究所)。6)羊抗小鼠IgG-FITC(北京中山金桥生物技术有限公司)。7)金路捷 (武汉博士德生物工程公司产品)。
1.1.3 仪器 1)CO2培养箱(日本SANYO公司)。2)DIAPHOT-TMD型倒置相差显微镜(日本Nikon公司)。3)OLYMPUS倒置荧光显微镜(日本光学工业株式会社)。4)Bio-Rad680酶标仪(美国制造)。5)HKCB-3型恒温磁力搅拌器(温州市医疗电器厂)。6)LD4-2离心机(北京医用离心机厂)。
1.2 实验方法
1.2.1 主要试剂及溶液的配制 1)培养用PBS(0.2mol/L)。2)细胞消化液。3)DMEM培养基配制。4)MAP-2抗体的稀释。5)封片剂的制备。6)金路捷神经元的原代培养 取出生48h内的Wistar大鼠，消毒，无菌条件下分离出大脑皮质，用PBS溶液冲洗2次，置于0.25%的胰蛋白酶中消化30min。用吸管弃去表面的胰蛋白酶。加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，离心1000r/min 3分钟，吸弃上清液。制成单细胞悬液，自然沉降后将上层单细胞悬液移入另一离心管，同此法重复一遍，最终得到细胞悬液，接种于预先放入6孔培养板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
1.3 神经元损伤模型的建立及分组 神经元培养到8~10天便可以用于制备损伤模型。实验分为对照组，损伤组和损伤加金路捷治疗组[4]。
1.4 MAP-2免疫荧光化学鉴定神经元。
1.5 使用BR68-450 DL (450定量 )酶标仪测定LDH。
1.6 数据处理和统计 LDH：实验数据以均数±标准差表示(x±s)，SPSS 13.0 统计软件。采用的方法：多组比较，方差齐同，符合正态性，采用多因素方差分析。组间两两比较使用SNK方法，检验水准0.05。
2 结果
2.1 原代Wistar大鼠大脑皮层神经元细胞 见图1。
2.2 MAP-2免疫荧光鉴定神经元 见图2。
2.3 损伤组与损伤加金路捷组LDH不同时间含量 见图3。
表1 体外培养大鼠脑皮质神经元损伤后不同时间各组LDH检测(略) 注：损伤组与对照组比较(P<0.01)。金路捷组与损伤组比较(P<0.01)。
图1 原代培养第3天的神经细胞，可见神经突起生成 ×200图 2MAP-2抗体鉴定培养的神经元：原代Wistar大鼠大脑皮层神经元细胞
图1 损伤加金路捷组与损伤对照组不同时间LDH含量(略)
2.4 LDH检测神经元损伤模型的损伤效果 LDH是一种稳定的蛋白质，是机体能量代谢中一种重要的酶，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外。神经系统损伤可见脑脊液中LDH水平升高，与损伤程度呈正相关，因此测定LDH含量可以衡量神经细胞的损伤程度[5]。神经细胞在变性和死亡时释放LDH，而胶质细胞在创伤作用后LDH不再明显升高(创伤当时细胞损伤引起的LDH升高除外)，故少数胶质细胞的存在对本研究结果无影响[6]。
3 讨论
神经元损伤模型损伤前后各时间点LDH活力损伤组与对照组比较，表明本实验应用的损伤模型确实使细胞损伤。神经元机械损伤模型中，损伤组LDH的含量有两次增高。第1次是在30分出现，可能是原发机械损伤直接造成神经元细胞膜损伤的结果。第2次是在72小时出现。可能是是继发性损伤的结果。
本实验使用MAP-2免疫荧光化学鉴定神经元方法可行，成功培养出神经元细胞。治疗组神经元LDH的水平与损伤组比较有差异(P<0.05)，证明金路捷能够在一定程度上保护神经元，起到修复的作用。
参 考 文 献
[1] 曾赵军,罗学港.脑源性神经营养因子对神经损伤的修复与再生[J].国外医学·生理、病理科学与临床分册,2001,21(4)：317-319
[2] 陈丽华,吴良芳,周雪.脑源性神经营养因子的研究现状[J].解剖学杂志,1998,6(2)：104-107
[3] 贾丛林.脑源性神经营养因子在脑创伤中表达的动物实验研究[J].实用神经疾病杂志,2004,7(2)：3-4
[4] 刘海泉,葛坚,杨智宽,等.神经生长因子2β、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子对体外压力作用下视网膜神经细胞的保护作用[J].中华眼底病杂志,2004,20(4)：249-251
[5] 黄卫东,费舟，章翔.体外培养大鼠脑皮层神经元机械性损伤模型的建立[J].第四军医大学学报,2004，25:307-309
[6] Regan,R.F.and D.W.Choi,The effect of NMDA,AMPA/kainate,and calcium channel antagonists on traumatic cortical neuronal injury in culture[J].Brain Res,1994，633(1-2):236-242
(齐齐哈尔医学院免疫教研室,哈尔滨医科大学), 百拇医药(吴艳敏 李 波 郑 辉 沈龙德)
【关键词】 神经细胞 LDH 金路捷
The Protective Function of BDNF on Cortical Neuronal Injuries of Big Mouse Wu Yanmin,et al. (Immunology Department of Qiqihar Medical College,Qiqihar,Heilongjiang,161042)
【Abstract】 Objective To establish a model of brain nerve cell injury in vitro and examine the level of LDH at different times.This study also focused on understanding the mechanism of action for the protective effect of BDNF on cortical neurons.This study also focused on understanding the mechanism of action for the protective effect of BDNF on cortical neurons.Methods To cultivate the rat cortical neurons and establish a model of brain nerve cell injury in vitro.According to the levels of LDH in cultivating medium at different times,detecting damage effect of the model.Results The concentration of LDH of the injured group had notable discrepancy compared to that of the control group (P<0.05).It showed the feasibility of the model.；The level of LDH of the injured group had discrepancy compared to that of the BDNF group(P<0.05).It showed both of the drugs could repair neurons.Conclusions The model is easy to perform and facilitate to observe the gradual changes of the injured neurons,which also can simulate the pathological mechanism of traumatic brain injury.and research the changes of the activity of the liquidity of the cell membrane.
【Key words】 Nerve cell LDH BDNF
创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)，也称为脑损伤或头部损伤，是由外伤引起的脑组织损害。为了进一步阐明TBI的病理生理机制，研究药物治疗作用，更好的治疗TBI，国内外学者建立了大量TBI模型，主要包括体外损伤模型和在体损伤模型。以下就TBI模型相关的神经保护药物脑源性神经营养因子[Brain-derived neurotrophic factor,金路捷(BDNF)]作以综述。
金路捷是神经营养因子中的一种,在中枢神经系统中,对神经元的生存、分化、信号的传递[1]、生长及执行功能起重要作用,它是维持神经元功能、再生修复[2]及防止神经元细胞退行性变等多方面发挥极其重要作用的细胞因子[3]。所以,金路捷 对脊髓损伤、脑损伤及其他多种神经系统疾病所致的神经损伤的保护作用,目前已引起人们的广泛瞩目。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 Wistar 大鼠：出生48小时内，由哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物中心提供。
1.1.2 药物及试剂 1)DMEM高糖培养基(GIBCO)。2)胎牛血清(杭州四季青生物工程材料工程公司)。3)多聚-L-赖氨酸(Sigma)。4)谷氨酰胺(上海华联制药有限公司)。5)LDH试剂盒(南京建成生物工程研究所)。6)羊抗小鼠IgG-FITC(北京中山金桥生物技术有限公司)。7)金路捷 (武汉博士德生物工程公司产品)。
1.1.3 仪器 1)CO2培养箱(日本SANYO公司)。2)DIAPHOT-TMD型倒置相差显微镜(日本Nikon公司)。3)OLYMPUS倒置荧光显微镜(日本光学工业株式会社)。4)Bio-Rad680酶标仪(美国制造)。5)HKCB-3型恒温磁力搅拌器(温州市医疗电器厂)。6)LD4-2离心机(北京医用离心机厂)。
1.2 实验方法
1.2.1 主要试剂及溶液的配制 1)培养用PBS(0.2mol/L)。2)细胞消化液。3)DMEM培养基配制。4)MAP-2抗体的稀释。5)封片剂的制备。6)金路捷神经元的原代培养 取出生48h内的Wistar大鼠，消毒，无菌条件下分离出大脑皮质，用PBS溶液冲洗2次，置于0.25%的胰蛋白酶中消化30min。用吸管弃去表面的胰蛋白酶。加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，离心1000r/min 3分钟，吸弃上清液。制成单细胞悬液，自然沉降后将上层单细胞悬液移入另一离心管，同此法重复一遍，最终得到细胞悬液，接种于预先放入6孔培养板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
1.3 神经元损伤模型的建立及分组 神经元培养到8~10天便可以用于制备损伤模型。实验分为对照组，损伤组和损伤加金路捷治疗组[4]。
1.4 MAP-2免疫荧光化学鉴定神经元。
1.5 使用BR68-450 DL (450定量 )酶标仪测定LDH。
1.6 数据处理和统计 LDH：实验数据以均数±标准差表示(x±s)，SPSS 13.0 统计软件。采用的方法：多组比较，方差齐同，符合正态性，采用多因素方差分析。组间两两比较使用SNK方法，检验水准0.05。
2 结果
2.1 原代Wistar大鼠大脑皮层神经元细胞 见图1。
2.2 MAP-2免疫荧光鉴定神经元 见图2。
2.3 损伤组与损伤加金路捷组LDH不同时间含量 见图3。
表1 体外培养大鼠脑皮质神经元损伤后不同时间各组LDH检测(略) 注：损伤组与对照组比较(P<0.01)。金路捷组与损伤组比较(P<0.01)。
图1 原代培养第3天的神经细胞，可见神经突起生成 ×200图 2MAP-2抗体鉴定培养的神经元：原代Wistar大鼠大脑皮层神经元细胞
图1 损伤加金路捷组与损伤对照组不同时间LDH含量(略)
2.4 LDH检测神经元损伤模型的损伤效果 LDH是一种稳定的蛋白质，是机体能量代谢中一种重要的酶，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外。神经系统损伤可见脑脊液中LDH水平升高，与损伤程度呈正相关，因此测定LDH含量可以衡量神经细胞的损伤程度[5]。神经细胞在变性和死亡时释放LDH，而胶质细胞在创伤作用后LDH不再明显升高(创伤当时细胞损伤引起的LDH升高除外)，故少数胶质细胞的存在对本研究结果无影响[6]。
3 讨论
神经元损伤模型损伤前后各时间点LDH活力损伤组与对照组比较，表明本实验应用的损伤模型确实使细胞损伤。神经元机械损伤模型中，损伤组LDH的含量有两次增高。第1次是在30分出现，可能是原发机械损伤直接造成神经元细胞膜损伤的结果。第2次是在72小时出现。可能是是继发性损伤的结果。
本实验使用MAP-2免疫荧光化学鉴定神经元方法可行，成功培养出神经元细胞。治疗组神经元LDH的水平与损伤组比较有差异(P<0.05)，证明金路捷能够在一定程度上保护神经元，起到修复的作用。
参 考 文 献
[1] 曾赵军,罗学港.脑源性神经营养因子对神经损伤的修复与再生[J].国外医学·生理、病理科学与临床分册,2001,21(4)：317-319
[2] 陈丽华,吴良芳,周雪.脑源性神经营养因子的研究现状[J].解剖学杂志,1998,6(2)：104-107
[3] 贾丛林.脑源性神经营养因子在脑创伤中表达的动物实验研究[J].实用神经疾病杂志,2004,7(2)：3-4
[4] 刘海泉,葛坚,杨智宽,等.神经生长因子2β、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子对体外压力作用下视网膜神经细胞的保护作用[J].中华眼底病杂志,2004,20(4)：249-251
[5] 黄卫东,费舟，章翔.体外培养大鼠脑皮层神经元机械性损伤模型的建立[J].第四军医大学学报,2004，25:307-309
[6] Regan,R.F.and D.W.Choi,The effect of NMDA,AMPA/kainate,and calcium channel antagonists on traumatic cortical neuronal injury in culture[J].Brain Res,1994，633(1-2):236-242
(齐齐哈尔医学院免疫教研室,哈尔滨医科大学), 百拇医药(吴艳敏 李 波 郑 辉 沈龙德)