HPLC法测定巴特芬搽剂的有关物质
摘 要 目的：建立测定巴特芬搽剂有关物质的高效液相色谱法。方法：采用Purospher C18 柱, 以流动相 ψ[A(乙腈)∶流动相B(含0.025 mol/L枸橼酸、0.0025 mol/L 乙二胺四乙酸二钠, pH6.5) ]=35∶65的混合液作为流动相, 流速为1.0 mL/min, 检测波长为303 nm, 进样量为20 μL，柱温为30 ℃。结果：有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ的浓度在0.05~3.0 μg/mL范围内均与峰面积呈良好的线性关系，r分别为0.9994、0.9992。 平均回收率分别为100.2 %、100.4%，RSD分别为0.54%、0.74% (n=9)。最低检测限量有关物质Ⅰ为0.1 ng,有关物质Ⅱ为0.3 ng。结论:本方法简便，快速，结果准确，重现性好,可用于该药有关物质的检查。
关键词 HPLC法；环吡酮；有关物质
Determination of related substances in Batrafen Nail Lacquer by HPLC
Abstract Objetive: To establish a HPLC method for the determination of related substances in Batrafen Nail Lacquer. Methods: The separation was performed on a Purospher C18 column (5 μm, 4.0 mm×125 mm) with acetonitrile and a solution of 0.025 mol/L citric acid monohydrate and 0.0025 mol/L Disodium ethylenediamine tetracetate in 1000 mL pure water (adjusted to pH6.5 with 10%NaOH) (35∶65) as the mobile phase . The flow rate was 1.0 mL/min, the detection wavelength was 303 nm, the injection volume was 20 μL and the column temperature was maintained at 30 ℃. Results: The calibration curves were linear in the concentration range of 0.05~3.0 μg/mL for related substance Ⅰand related substance Ⅱ, r=09994 and 0.9992 respectively . The average recovery rates were 100.2% and 100.4%, RSDs were 0.54% and 0.74% (n=9) respectively. The detection limits were 0.1 ng for related substance Ⅰand 0.3 ng for related substance Ⅱ. Conclusions: The method is simple, rapid, accurate and well reproducible. It may be adopted for the examination of the impurities of the drug.
Key words HPLC；ciclopirox；related substance
巴特芬搽剂，其活性成分环吡酮具有广谱抗皮肤真菌的作用，是治疗灰指甲的理想药物。目前，其质量标准在国内外药典中均未收载。环吡酮对光较敏感，所以除了可能带入中间体吡喃酮外，还可能带入光解物吡啶酮。据文献报道，测定其有关物质的方法有HPLC法[1],TLC法[2] ,前者需衍生化后进行，操作复杂且色谱图有严重拖尾的现象，而后者却不能定量测定只能作限量检查，而且分离效果不如HPLC法。本文报告一种简便的HPLC法，能准确测定其有关物质的含量。用外标法测定有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ的含量，面积归一化法检测未知杂质及总杂质的含量[3]。该法简便快速，专属性强，灵敏度高，可用于本品的有关物质检查。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 日本岛津LC10A高效液相色谱仪，SPD10A紫外检测器，CBM10A数据处理机, CTO10A柱恒温箱，7725型液相色谱进样器。
1. 2 试药 巴特芬搽剂(批号为40W292, 41W291, 40H201,由德国赫司特公司生产)，环吡酮对照品(由Aventis公司提供，含量为100.0%)，有关物质对照品：6-环己基-4-甲基-2(1H)吡啶酮(简称有关物质Ⅰ)及6-环己基-4-甲基-2-吡喃酮(简称有关物质Ⅱ)(均由Aventis公司提供，含量分别为100.0%，99.1%)，乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，枸橼酸、乙二胺四乙酸二钠(均为分析纯)，试验用水为纯水。
2 方法与结果
2 . 1 色谱条件
色谱柱为Purospher C18(4.0 mm×125 mm,5 μm)，流动相为ψ[A(乙腈)∶流动相B(取枸橼酸5.25 g，加0.1 mol/L乙二胺四乙酸二钠25 mL，加水至1000 mL，用10% NaOH溶液调节pH6.5)]=35∶65，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长303 nm，进样量20 μL。
2. 2 溶液的制备
有关物质对照品溶液：精密称取有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ对照品各10 mg，置100 mL棕色容量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，混匀，制得对照品的贮备液。精密吸取1 mL置200 mL棕色容量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀。
样品溶液：取装量项下的混合均匀内容物0.25 g(约相当于环吡酮20 mg)精密称定，置100 mL棕色容量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀。
2. 3 方法学考察
2. 3. 1 系统适应性试验 精密称取环吡酮对照品20 mg，置100 mL棕色容量瓶中，加甲醇适量溶解后，精密加入有关物质对照品的贮备液2 mL，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。取上述溶液，按“2.1色谱条件”下测定，计算柱效、分离度和拖尾因子，结果见表1。环吡酮及有关物质对照品分离色谱图见图1。
2. 3. 2 检测波长的选择 取环吡酮对照品适量，用甲醇制成适当浓度的溶液，在200~400 nm波长范围内扫描紫外吸收光谱，结果发现环吡酮在205 nm及303 nm处有最大吸收。因为在205 nm末端紫外吸收干扰大，故我们选择303 nm为检测波长。
2. 3. 3 线性回归试验 精密量取有关物质对照品的贮备液0.05、0.1、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 30 mL, 分别置8个100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成浓度分别为0.05、0.1、 0.5、 1.0、1.5、 2.0、 2.5、3.0 μg/mL的一系列溶液，摇匀，各精密量取20 μL，注入液相色谱仪。记录各浓度的色谱峰面积，以峰面积A对浓度C (μg/mL) 进行线性回归，得有关物质Ⅰ的回归方程为：A=52636.67C-938.70, r=09994;有关物质Ⅱ的回归方程为：A=47041.84C+1192.01, r=0.9992 。结果表明有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ在0.05~3.0 μg/mL的范围内与峰面积呈良好的线性关系。
表1 系统适应性实验测定结果成分(略)
2. 3. 4 加样回收试验 精密称取已测定有关物质含量的样品适量(约相当于环吡酮20 mg)，共3份，分别置100 mL棕色容量瓶中，加适量甲醇溶解，然后各精密加入有关物质对照品的贮备液1.6 mL，2.0 mL和2.4 mL，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，按“样品有关物质测定”项下的方法分别测定有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ的含量，减去样品本底，计算回收率，结果测得的平均回收率分别为：有关物质Ⅰ为100.2%，RSD=054%(n=9)；有关物质Ⅱ为100.4%, RSD=0.74% (n=9)。
2. 3. 5 最低检测限 在选定的色谱条件下，按信噪比为3对最低检测限进行测定，结果表明：有关物质Ⅰ的浓度为5.16×10-3 μg/mL，进样量为20 μL时，最低检测限量为0.1 ng。有关物质Ⅱ的浓度为1.62×10-3 μg/mL，进样量为20 μL时，最低检测限量为03 ng。
2. 3. 6 精密度试验 取“样品有关物质测定”项下的对照品溶液，连续进样6次，每次进样20 μL，测量有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ的峰面积，结果有关物质Ⅰ的RSD为1.5%；有关物质Ⅱ的RSD为1.6%(n=6)。
2. 3. 7 样品有关物质测定 分别取按“2.2”项下制备的有关物质对照品溶液及样品溶液，按“2 .1”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图至主成分保留时间的3倍。按外标法计算有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ的含量，用面积归一化法计算未知杂质及总杂质的含量，结果见表2。有关物质对照品溶液、样品溶液及溶剂甲醇的色谱图分别见图2A、B、C。
表2 样品有关物质测定结果(略)
2. 3. 8 样品溶液稳定性试验 取“样品有关物质测定”项下的样品溶液分别于室温避光放置0、2、4、6、12、24、48h分别进样测定，记录有关物质的峰面积，并用归一化法考察有关物质的含量，结果有关物质含量与初始溶液相比无明显变化，RSD为1.0%,而且没有降解产物出现，结果表明，在避光条件下，样品溶液在48h内可保持稳定。
2. 3. 9 样品溶液光破坏试验 环吡酮对光较敏感，所以样品中除了可能带入合成中间体吡喃酮即有关物质Ⅱ外，还可能带入光解物吡啶酮即有关物质Ⅰ。笔者曾将样品溶液置室温4500 Lx强光下照射2 h，结果样品主峰面积明显减少，由7707641变为7362604，而吡啶酮的峰面积却明显增加，由386变为661984。色谱图见图2D。主峰与其他降解物峰均能达到基线分离，证明本法选择性好。
图2 HPLC色谱图 (略)
3 讨论
3. 1 单因素轮换法考察流动相中各因素对组分保留时间及色谱峰形的影响。
3. 1. 1 pH在5.5~6.5之间改变，对色谱峰形及分离度的影响不大，但pH低时，保留时间长，故选用pH6.5。
3. 1. 2 乙腈比例在30%~40%之间改变，结果表明，流动相中乙腈含量对主峰及相邻杂质峰的保留时间影响较大，乙腈比例为40%时，主峰保留时间减少，不能与相邻杂质峰完全分开；乙腈比例为30%时，主峰保留时间延长，峰形变差，柱效降低，故采用乙腈比例为35%的流动相较为适宜。
3. 1. 3 枸橼酸的浓度在0.01~0.04 mol/L之间改变，结果发现，随着枸橼酸浓度的增大，对柱效和拖尾因子无明显影响,但样品主峰的保留时间减少，而对主峰邻近几个杂质峰的保留时间无明显影响。故枸橼酸的量影响杂质与主峰的分离。选用0025 mol/L的枸橼酸作为流动相可获得满意的结果。
3. 1. 4 EDTA2Na的浓度在0.001~0004 mol/L之间改变，结果发现，随着EDTA2Na浓度的增加，对柱效和拖尾因子无明显影响，只是样品主峰的保留时间增大，由7.7 min增大到11.2 min，而相邻杂质峰的保留时间不变。故EDTA2Na的量影响杂质与主峰的分离，综上所述，我们选用浓度为00025 mol/L的EDTA2Na作流动相，这时样品出峰时间比较合适，为10.6 min，且它与相邻杂质峰及杂质峰之间均能达到有效分离。
3. 2 鉴于乙腈成本高、毒性大，故在上述研究的基础上，我们将流动相体系的组成成分进行改变，试验以甲醇代替乙腈的分离效果，结果换用35%、40%、45%的甲醇时，1 h以上仍未出峰，而用50%、55%的甲醇时，样品主峰与杂质吡喃酮峰重叠在一起，虽经调整甲醇比例，两者都无法达到基线分离，故无法采用甲醇代替乙腈作试验。
3. 3 笔者曾试用日常检验常用的色谱柱Hypersil ODS C18柱及Diamonsil C18柱进行测定，结果发现前者的环吡酮峰的拖尾因子为2.79，后者的环吡酮峰与有关物质Ⅱ峰重叠在一起，而使用Purospher C18柱则可获得满意的结果, 说明本法对色谱柱有一定的选择性。
3. 4 因巴特芬搽剂是进口药品，未能提供处方及有关辅料，故本实验没有做空白辅料试验，回收率试验采取加样回收的方法。
3. 5 实验结果表明，本文介绍的HPLC色谱条件，对环吡酮及其有关物质相互间均有很好的分离度，互不干扰检测。
参考文献
[1]Lehr, karl Hein. Quanrificatication of ciclopirox by HPLC after precolumn derivatization[J]. J chromatogr,1985,339 (2)：451.
[2]刘淑贤，林嫣梅. 薄层色谱法用于环吡酮胺的纯度检查[J]. 中国药学杂志，1994，29(3)：161.
[3]凌大奎. HPLC用于杂质检查的方法学讨论[J]. 药典通讯，1997，7(4)：183.
( 广州市药品检验所，广东 广州 510160 ), 百拇医药(张慧文 何丽明 周少映)
关键词 HPLC法；环吡酮；有关物质
Determination of related substances in Batrafen Nail Lacquer by HPLC
Abstract Objetive: To establish a HPLC method for the determination of related substances in Batrafen Nail Lacquer. Methods: The separation was performed on a Purospher C18 column (5 μm, 4.0 mm×125 mm) with acetonitrile and a solution of 0.025 mol/L citric acid monohydrate and 0.0025 mol/L Disodium ethylenediamine tetracetate in 1000 mL pure water (adjusted to pH6.5 with 10%NaOH) (35∶65) as the mobile phase . The flow rate was 1.0 mL/min, the detection wavelength was 303 nm, the injection volume was 20 μL and the column temperature was maintained at 30 ℃. Results: The calibration curves were linear in the concentration range of 0.05~3.0 μg/mL for related substance Ⅰand related substance Ⅱ, r=09994 and 0.9992 respectively . The average recovery rates were 100.2% and 100.4%, RSDs were 0.54% and 0.74% (n=9) respectively. The detection limits were 0.1 ng for related substance Ⅰand 0.3 ng for related substance Ⅱ. Conclusions: The method is simple, rapid, accurate and well reproducible. It may be adopted for the examination of the impurities of the drug.
Key words HPLC；ciclopirox；related substance
巴特芬搽剂，其活性成分环吡酮具有广谱抗皮肤真菌的作用，是治疗灰指甲的理想药物。目前，其质量标准在国内外药典中均未收载。环吡酮对光较敏感，所以除了可能带入中间体吡喃酮外，还可能带入光解物吡啶酮。据文献报道，测定其有关物质的方法有HPLC法[1],TLC法[2] ,前者需衍生化后进行，操作复杂且色谱图有严重拖尾的现象，而后者却不能定量测定只能作限量检查，而且分离效果不如HPLC法。本文报告一种简便的HPLC法，能准确测定其有关物质的含量。用外标法测定有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ的含量，面积归一化法检测未知杂质及总杂质的含量[3]。该法简便快速，专属性强，灵敏度高，可用于本品的有关物质检查。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 日本岛津LC10A高效液相色谱仪，SPD10A紫外检测器，CBM10A数据处理机, CTO10A柱恒温箱，7725型液相色谱进样器。
1. 2 试药 巴特芬搽剂(批号为40W292, 41W291, 40H201,由德国赫司特公司生产)，环吡酮对照品(由Aventis公司提供，含量为100.0%)，有关物质对照品：6-环己基-4-甲基-2(1H)吡啶酮(简称有关物质Ⅰ)及6-环己基-4-甲基-2-吡喃酮(简称有关物质Ⅱ)(均由Aventis公司提供，含量分别为100.0%，99.1%)，乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，枸橼酸、乙二胺四乙酸二钠(均为分析纯)，试验用水为纯水。
2 方法与结果
2 . 1 色谱条件
色谱柱为Purospher C18(4.0 mm×125 mm,5 μm)，流动相为ψ[A(乙腈)∶流动相B(取枸橼酸5.25 g，加0.1 mol/L乙二胺四乙酸二钠25 mL，加水至1000 mL，用10% NaOH溶液调节pH6.5)]=35∶65，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长303 nm，进样量20 μL。
2. 2 溶液的制备
有关物质对照品溶液：精密称取有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ对照品各10 mg，置100 mL棕色容量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，混匀，制得对照品的贮备液。精密吸取1 mL置200 mL棕色容量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀。
样品溶液：取装量项下的混合均匀内容物0.25 g(约相当于环吡酮20 mg)精密称定，置100 mL棕色容量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀。
2. 3 方法学考察
2. 3. 1 系统适应性试验 精密称取环吡酮对照品20 mg，置100 mL棕色容量瓶中，加甲醇适量溶解后，精密加入有关物质对照品的贮备液2 mL，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。取上述溶液，按“2.1色谱条件”下测定，计算柱效、分离度和拖尾因子，结果见表1。环吡酮及有关物质对照品分离色谱图见图1。
2. 3. 2 检测波长的选择 取环吡酮对照品适量，用甲醇制成适当浓度的溶液，在200~400 nm波长范围内扫描紫外吸收光谱，结果发现环吡酮在205 nm及303 nm处有最大吸收。因为在205 nm末端紫外吸收干扰大，故我们选择303 nm为检测波长。
2. 3. 3 线性回归试验 精密量取有关物质对照品的贮备液0.05、0.1、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 30 mL, 分别置8个100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成浓度分别为0.05、0.1、 0.5、 1.0、1.5、 2.0、 2.5、3.0 μg/mL的一系列溶液，摇匀，各精密量取20 μL，注入液相色谱仪。记录各浓度的色谱峰面积，以峰面积A对浓度C (μg/mL) 进行线性回归，得有关物质Ⅰ的回归方程为：A=52636.67C-938.70, r=09994;有关物质Ⅱ的回归方程为：A=47041.84C+1192.01, r=0.9992 。结果表明有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ在0.05~3.0 μg/mL的范围内与峰面积呈良好的线性关系。
表1 系统适应性实验测定结果成分(略)
2. 3. 4 加样回收试验 精密称取已测定有关物质含量的样品适量(约相当于环吡酮20 mg)，共3份，分别置100 mL棕色容量瓶中，加适量甲醇溶解，然后各精密加入有关物质对照品的贮备液1.6 mL，2.0 mL和2.4 mL，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，按“样品有关物质测定”项下的方法分别测定有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ的含量，减去样品本底，计算回收率，结果测得的平均回收率分别为：有关物质Ⅰ为100.2%，RSD=054%(n=9)；有关物质Ⅱ为100.4%, RSD=0.74% (n=9)。
2. 3. 5 最低检测限 在选定的色谱条件下，按信噪比为3对最低检测限进行测定，结果表明：有关物质Ⅰ的浓度为5.16×10-3 μg/mL，进样量为20 μL时，最低检测限量为0.1 ng。有关物质Ⅱ的浓度为1.62×10-3 μg/mL，进样量为20 μL时，最低检测限量为03 ng。
2. 3. 6 精密度试验 取“样品有关物质测定”项下的对照品溶液，连续进样6次，每次进样20 μL，测量有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ的峰面积，结果有关物质Ⅰ的RSD为1.5%；有关物质Ⅱ的RSD为1.6%(n=6)。
2. 3. 7 样品有关物质测定 分别取按“2.2”项下制备的有关物质对照品溶液及样品溶液，按“2 .1”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图至主成分保留时间的3倍。按外标法计算有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ的含量，用面积归一化法计算未知杂质及总杂质的含量，结果见表2。有关物质对照品溶液、样品溶液及溶剂甲醇的色谱图分别见图2A、B、C。
表2 样品有关物质测定结果(略)
2. 3. 8 样品溶液稳定性试验 取“样品有关物质测定”项下的样品溶液分别于室温避光放置0、2、4、6、12、24、48h分别进样测定，记录有关物质的峰面积，并用归一化法考察有关物质的含量，结果有关物质含量与初始溶液相比无明显变化，RSD为1.0%,而且没有降解产物出现，结果表明，在避光条件下，样品溶液在48h内可保持稳定。
2. 3. 9 样品溶液光破坏试验 环吡酮对光较敏感，所以样品中除了可能带入合成中间体吡喃酮即有关物质Ⅱ外，还可能带入光解物吡啶酮即有关物质Ⅰ。笔者曾将样品溶液置室温4500 Lx强光下照射2 h，结果样品主峰面积明显减少，由7707641变为7362604，而吡啶酮的峰面积却明显增加，由386变为661984。色谱图见图2D。主峰与其他降解物峰均能达到基线分离，证明本法选择性好。
图2 HPLC色谱图 (略)
3 讨论
3. 1 单因素轮换法考察流动相中各因素对组分保留时间及色谱峰形的影响。
3. 1. 1 pH在5.5~6.5之间改变，对色谱峰形及分离度的影响不大，但pH低时，保留时间长，故选用pH6.5。
3. 1. 2 乙腈比例在30%~40%之间改变，结果表明，流动相中乙腈含量对主峰及相邻杂质峰的保留时间影响较大，乙腈比例为40%时，主峰保留时间减少，不能与相邻杂质峰完全分开；乙腈比例为30%时，主峰保留时间延长，峰形变差，柱效降低，故采用乙腈比例为35%的流动相较为适宜。
3. 1. 3 枸橼酸的浓度在0.01~0.04 mol/L之间改变，结果发现，随着枸橼酸浓度的增大，对柱效和拖尾因子无明显影响,但样品主峰的保留时间减少，而对主峰邻近几个杂质峰的保留时间无明显影响。故枸橼酸的量影响杂质与主峰的分离。选用0025 mol/L的枸橼酸作为流动相可获得满意的结果。
3. 1. 4 EDTA2Na的浓度在0.001~0004 mol/L之间改变，结果发现，随着EDTA2Na浓度的增加，对柱效和拖尾因子无明显影响，只是样品主峰的保留时间增大，由7.7 min增大到11.2 min，而相邻杂质峰的保留时间不变。故EDTA2Na的量影响杂质与主峰的分离，综上所述，我们选用浓度为00025 mol/L的EDTA2Na作流动相，这时样品出峰时间比较合适，为10.6 min，且它与相邻杂质峰及杂质峰之间均能达到有效分离。
3. 2 鉴于乙腈成本高、毒性大，故在上述研究的基础上，我们将流动相体系的组成成分进行改变，试验以甲醇代替乙腈的分离效果，结果换用35%、40%、45%的甲醇时，1 h以上仍未出峰，而用50%、55%的甲醇时，样品主峰与杂质吡喃酮峰重叠在一起，虽经调整甲醇比例，两者都无法达到基线分离，故无法采用甲醇代替乙腈作试验。
3. 3 笔者曾试用日常检验常用的色谱柱Hypersil ODS C18柱及Diamonsil C18柱进行测定，结果发现前者的环吡酮峰的拖尾因子为2.79，后者的环吡酮峰与有关物质Ⅱ峰重叠在一起，而使用Purospher C18柱则可获得满意的结果, 说明本法对色谱柱有一定的选择性。
3. 4 因巴特芬搽剂是进口药品，未能提供处方及有关辅料，故本实验没有做空白辅料试验，回收率试验采取加样回收的方法。
3. 5 实验结果表明，本文介绍的HPLC色谱条件，对环吡酮及其有关物质相互间均有很好的分离度，互不干扰检测。
参考文献
[1]Lehr, karl Hein. Quanrificatication of ciclopirox by HPLC after precolumn derivatization[J]. J chromatogr,1985,339 (2)：451.
[2]刘淑贤，林嫣梅. 薄层色谱法用于环吡酮胺的纯度检查[J]. 中国药学杂志，1994，29(3)：161.
[3]凌大奎. HPLC用于杂质检查的方法学讨论[J]. 药典通讯，1997，7(4)：183.
( 广州市药品检验所，广东 广州 510160 ), 百拇医药(张慧文 何丽明 周少映)