通络益智散对拟血管性痴呆大鼠脑组织中Glu和GABA影响的实验研究
摘 要：目的：探讨通络益智散对拟血管性痴呆大鼠海马区兴奋性和抑制性氨基酸的影响。方法：选用改良的脑缺血再灌注配合腹腔注射硝普钠降压法复制血管性痴呆模型。将实验大鼠随机分为5组，即假手术组、模型组、尼莫地平组、通络益智散大剂量组、通络益智散小剂量组。给药3周后，取海马匀浆检测谷氨酸(Glu)含量，并观察海马区γ-氨基丁酸(GABA)的表达。结果：通络益智散可以显著降低拟血管性痴呆模型大鼠海马区Glu的含量、增强GABA的表达(P<0.01)。结论:通络益智散能够通过调节血管性痴呆大鼠海马区Glu和GABA的含量保护脑组织，这可能是其治疗血管性痴呆的作用机制之一。
关键词：血管性痴呆;谷氨酸；γ-氨基丁酸
血管性痴呆(Vascular Dementia,VD)是由各种脑血管病所导致的痴呆综合征。属于中医“呆病”、“文痴”、“健忘”等范畴。在我国由于脑血管病的多发,使得VD成为高发疾病之一。目前国内外对控制本病病程进展尚无有效方法和药物，但根据现在的研究结论认为VD具有潜在的可防治性，其部分是可逆的[1]。本研究通过观察通络益智散对拟血管性痴呆大鼠GABA表达及Glu含量的影响，进一步阐明通络益智散对血管性痴呆的作用机制，为缺血再灌流后所致血管性痴呆的治疗提供实验依据。
1 实验材料
1.1 实验动物
健康9月龄Wistar雄性大鼠60只，质量250±20 g，由兰州大学医学院实验动物中心提供。实验前先适应性喂养3 d，实验过程中自由喂养。
1.2 药品与试剂
硝普钠粉针剂(北京双鹤现代医药技术有限公司生产，批号041011，50 mg /支)用双蒸水配成1 mg/L溶液，黑纸包裹备用；尼莫地平(山西亚宝药业集团有限公司生产，批号041003，20 mg/片，实验时用生理盐水配成1 mg/mL的混悬液)；通络益智散由红芪、当归、地龙、红花、桃仁、葛根、核桃仁、石菖蒲、远志组成，将其水煎3次，合并浓缩为含生药3.14 g/mL的药液，高压灭菌，4 ℃贮存备用。Glu及总蛋白测试盒购自南京建成生物工程研究所，批号为20041207；SABC试剂盒和兔抗大鼠GABA由武汉博士德生物工程有限公司生产。
1.3 仪器
HANGPING电子称:上海精科公司天平仪器厂生产，型号 JY4001；可控低温冰箱:青岛澳柯玛，型号BCD-183；H.H.S 21-4电热恒温水浴锅，上海医疗器械五厂生产；VIS-7220紫外分光光度计，北京第二光学仪器厂生产；LXJ-64-01高速光学仪器离心机，北京医疗仪器修理厂生产。
2 实验方法
2.1 模型制备
采用王蕊等[2]的改进方法，将大鼠用3 %戊巴比妥钠40 mg/kg 腹腔注射麻醉后，仰卧固定在手术台上，常规消毒，颈正中切口，分离双侧颈总动脉(common caroAid arAeris，CCA)，在夹闭双侧CCA之前，腹腔注射硝普钠(2.5 mg/kg)，随即用无创伤动脉夹夹闭双侧CCA10 min，共夹闭2次，每次间隔10 min，即采用2次缺血10 min、再灌10 min的方式。再通后伤口滴青霉素适量，缝合伤口，放回笼中，(27±0.5)℃温度下饲养。在全部造模过程中用肛表密切测量大鼠肛温，保持肛温在37 ℃左右，以防止低温对脑缺血损伤的保护作用。
2.2 动物分组及处理
从60只大鼠中随机选出10只作为假手术组，假手术组只进行麻醉，颈正中切口，分离双侧颈总动脉，但不阻断CCA及腹腔注射硝普钠。其余50只造模，手术过程由于损伤喉返神经、出血过多、麻醉过量，死亡6只大鼠，术后两天相继死亡4只，余40只大鼠随机分为模型组、通络益智散大剂量组、通络益智散小剂量组、尼莫地平对照组，每组10只。所有大鼠从造模后第7 d开始给药，1日1次。假手术组与模型组予生理盐水；通络益智散大剂量相当于正常成人用量的20倍(浓度为3.14 g/mL)；通络益智散小剂量相当于正常成人用量的5倍(浓度为0.785 g/mL)；尼莫地平组给予尼莫地平悬浊液(相当于正常成人用量的20倍)，给药剂量均为0.01 mL/g，连续给药21 d。
2.3 标本采集和处理
治疗结束后第28 d，迅速开胸暴露心脏，从左心室插入导管至主动脉，于右心耳部剪一小口，用生理盐水快速冲洗，直到右心房流出液清亮为止。洗毕将大鼠快速断头取脑，在冰盘上去除脑膜和血管，分离海马称重，放入玻璃匀浆器加9倍生理盐水，在冰浴中匀浆，3000 r/min离心机离心10 min，取上清液予-20 ℃冰箱内冻存待测。右半脑置于4 %多聚甲醛及0.1 mol/L磷酸缓冲液中固定72 h后，取海马常规脱水，石蜡包埋，冠状连续切片(4 μm)，40 ℃水温展片，明胶处理的载玻片捞片后置于60 ℃的烤箱内烤2～3 h。
2.4 Glu的检测
依据试剂盒说明书步骤，用7220分光光度计进行检测。
2.5 GABA的检测
(1)对石蜡切片进行免疫组织化学反应。①脱蜡。②滴加0.03 %H2O2的甲醇溶液(室温)30 min以去除内源性过氧化物酶，然后蒸馏水洗3次。③热源修复抗原：将切片浸入0.01 mol/L的枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)中，微波炉加热至沸腾后断电，间隔5～10 min，反复1～2次，冷却后用PBS(pH 7.2～7.6)洗涤1～2次。④用抗原修复液Ⅰ进一步暴露抗原：将抗原(稀释1∶200)修复液滴加在切片上,室温10 min后，用PBS (pH 7.2～7.6)洗涤3次。⑤在切片上滴加封闭液，室温20 min，甩去多余的液体，不能冲洗。⑥滴加稀释的一抗兔IgG，放入冷藏室过夜。第二天取出切片，放置至室温后，用PBS(pH 7.2～7.6)洗涤3次，各2 min。⑦再滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37 ℃温度下放置20 min，用PBS(pH 7.2～7.6)洗涤3次，各2 min。⑧滴加试剂SABC，在20～37 ℃温度下放置20 min，用PBS(pH 7.2～7.6)洗涤3次，各5 min。⑨DBA显色：使用DBA显色试剂盒(AR1022)，取1 mL蒸馏水加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5～30 min。苏木素轻度复染，脱水、透明、封片。取假手术组切片6张，用PBS代替一抗。
(2)定量观察：采用BI-2000图像分析系统，于400倍放大条件下，在每张切片上随机摄取5个视野，测阳性细胞的光密度值及灰度值，并做统计分析。
2.6 统计学处理
所有实验数据用SPSS 12.0统计软件处理，均采用均数±标准差(±s)表示，组间比较用单因素方差分析，各实验组均数间的两两比较若方差齐则采用LSD检验，方差不齐采用Tamhane’s T2 检验。
3 实验结果
3.1 各组大鼠海马匀浆中Glu含量的比较
结果见表1。模型组与假手术组比较，模型组大鼠海马区Glu含量明显升高(P﹤0.01)，说明造模成功；通络益智散大、小剂量组Glu显著低于模型组(P﹤0.01)，但与尼莫地平组比较无显著性差异(P﹥0.05)，结果提示通络益智散大、小剂量组能降低VD大鼠Glu含量，治疗效果与尼莫地平相当。
3.2 各组大鼠海马齿状回GABA表达的比较
结果见表2。模型组与假手术组相比，GABA平均光密度在CA1区均明显减少，平均灰度值升高(P﹤0.01)；各治疗组与假手术组比较，除小剂量组外，其他两组GABA平均光密度在CA1区均显著升高，平均灰度值显著降低(P﹤0.01)；各治疗组GABA平均光密度较模型组均显著增多(P﹤0.01)，升高幅度以尼莫地平、大剂量、小剂量的顺序依次降低。
表1 通络益智散对VD大鼠脑组织Glu含量的影响(略)
注：与假手术组比较★P﹤0.01；与模型组比较△P﹤0.01
表2 大鼠海马CA1区平均灰度值及平均光密度值(略)
注：与假手术组比较★P﹤0.01；与模型组比较△P﹤0.01；与尼莫地平组比较*P﹤0.05
4 讨论
谷氨酸(Glu)是人和哺乳动物脑内含量最高的兴奋性氨基酸(EAAs)，参与中枢神经系统的信息传递，在学习记忆、突触可塑性、神经元发育和退化等方面亦有重要的作用。但过量的Glu对神经元有明显的损伤作用，因此已被认为是内源性兴奋性毒素[3]。据文献报道，其兴奋毒性作用在急性脑缺血细胞凋亡、再灌注损伤和迟发性神经元死亡中起重要作用。γGABA被认为是重要的抑制性神经递质，具有降低兴奋性与神经保护作用。因此，缺血再灌注后，Glu升高的同时如能出现GABA的释放增高，这一过程则意味着可能建立对抗EAAs过量的保护机制[4]。
本研究结果显示:采用缺血再灌注制造的VD模型组大鼠海马区Glu含量明显高于假手术组(P<0.01)，而GABA的表达则明显低于假手术组(P<0.01)；用药后各组Glu含量降低，GABA表达增强。提示通络益智散治疗血管性痴呆的作用机制是：一方面通过降低海马区兴奋性氨基酸类神经递质含量以减轻其兴奋性神经毒性作用；另一方面则通过增加海马区抑制性氨基酸(IAAs)含量，以对抗EAAs的神经毒性作用。因此，调节兴奋性及抑制性氨基酸类神经递质的平衡可能是通络益智散治疗血管性痴呆的机制之一。
参考文献：
[1]王永炎.现代中医临床与研究血管性痴呆[M].北京：人民卫生出版社，2003：255-259.
[2]王蕊,杨秦飞,唐一鹏,等.大鼠拟“血管性痴呆”模型的改进[J].中国病理生理杂志,2000,16(10):914.
[3]邓文斌，张均田.脑缺血时谷氨酸兴奋性毒性及毒理学对抗策略[J].国外医学·脑血管疾病分册，1996，(4)：12.
[4]Gromdahl TO,Berg Johnsen J,Langmoen IA.Chloride influx durin gcerebral energy deprivation [J] .NeurolPes, 1998,20(2):131-136.
(甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000；甘肃中医学院附属医院，甘肃 兰州 730020), http://www.100md.com(戴恩来，欧秀梅，马鸿斌，孙红旭)
关键词：血管性痴呆;谷氨酸；γ-氨基丁酸
血管性痴呆(Vascular Dementia,VD)是由各种脑血管病所导致的痴呆综合征。属于中医“呆病”、“文痴”、“健忘”等范畴。在我国由于脑血管病的多发,使得VD成为高发疾病之一。目前国内外对控制本病病程进展尚无有效方法和药物，但根据现在的研究结论认为VD具有潜在的可防治性，其部分是可逆的[1]。本研究通过观察通络益智散对拟血管性痴呆大鼠GABA表达及Glu含量的影响，进一步阐明通络益智散对血管性痴呆的作用机制，为缺血再灌流后所致血管性痴呆的治疗提供实验依据。
1 实验材料
1.1 实验动物
健康9月龄Wistar雄性大鼠60只，质量250±20 g，由兰州大学医学院实验动物中心提供。实验前先适应性喂养3 d，实验过程中自由喂养。
1.2 药品与试剂
硝普钠粉针剂(北京双鹤现代医药技术有限公司生产，批号041011，50 mg /支)用双蒸水配成1 mg/L溶液，黑纸包裹备用；尼莫地平(山西亚宝药业集团有限公司生产，批号041003，20 mg/片，实验时用生理盐水配成1 mg/mL的混悬液)；通络益智散由红芪、当归、地龙、红花、桃仁、葛根、核桃仁、石菖蒲、远志组成，将其水煎3次，合并浓缩为含生药3.14 g/mL的药液，高压灭菌，4 ℃贮存备用。Glu及总蛋白测试盒购自南京建成生物工程研究所，批号为20041207；SABC试剂盒和兔抗大鼠GABA由武汉博士德生物工程有限公司生产。
1.3 仪器
HANGPING电子称:上海精科公司天平仪器厂生产，型号 JY4001；可控低温冰箱:青岛澳柯玛，型号BCD-183；H.H.S 21-4电热恒温水浴锅，上海医疗器械五厂生产；VIS-7220紫外分光光度计，北京第二光学仪器厂生产；LXJ-64-01高速光学仪器离心机，北京医疗仪器修理厂生产。
2 实验方法
2.1 模型制备
采用王蕊等[2]的改进方法，将大鼠用3 %戊巴比妥钠40 mg/kg 腹腔注射麻醉后，仰卧固定在手术台上，常规消毒，颈正中切口，分离双侧颈总动脉(common caroAid arAeris，CCA)，在夹闭双侧CCA之前，腹腔注射硝普钠(2.5 mg/kg)，随即用无创伤动脉夹夹闭双侧CCA10 min，共夹闭2次，每次间隔10 min，即采用2次缺血10 min、再灌10 min的方式。再通后伤口滴青霉素适量，缝合伤口，放回笼中，(27±0.5)℃温度下饲养。在全部造模过程中用肛表密切测量大鼠肛温，保持肛温在37 ℃左右，以防止低温对脑缺血损伤的保护作用。
2.2 动物分组及处理
从60只大鼠中随机选出10只作为假手术组，假手术组只进行麻醉，颈正中切口，分离双侧颈总动脉，但不阻断CCA及腹腔注射硝普钠。其余50只造模，手术过程由于损伤喉返神经、出血过多、麻醉过量，死亡6只大鼠，术后两天相继死亡4只，余40只大鼠随机分为模型组、通络益智散大剂量组、通络益智散小剂量组、尼莫地平对照组，每组10只。所有大鼠从造模后第7 d开始给药，1日1次。假手术组与模型组予生理盐水；通络益智散大剂量相当于正常成人用量的20倍(浓度为3.14 g/mL)；通络益智散小剂量相当于正常成人用量的5倍(浓度为0.785 g/mL)；尼莫地平组给予尼莫地平悬浊液(相当于正常成人用量的20倍)，给药剂量均为0.01 mL/g，连续给药21 d。
2.3 标本采集和处理
治疗结束后第28 d，迅速开胸暴露心脏，从左心室插入导管至主动脉，于右心耳部剪一小口，用生理盐水快速冲洗，直到右心房流出液清亮为止。洗毕将大鼠快速断头取脑，在冰盘上去除脑膜和血管，分离海马称重，放入玻璃匀浆器加9倍生理盐水，在冰浴中匀浆，3000 r/min离心机离心10 min，取上清液予-20 ℃冰箱内冻存待测。右半脑置于4 %多聚甲醛及0.1 mol/L磷酸缓冲液中固定72 h后，取海马常规脱水，石蜡包埋，冠状连续切片(4 μm)，40 ℃水温展片，明胶处理的载玻片捞片后置于60 ℃的烤箱内烤2～3 h。
2.4 Glu的检测
依据试剂盒说明书步骤，用7220分光光度计进行检测。
2.5 GABA的检测
(1)对石蜡切片进行免疫组织化学反应。①脱蜡。②滴加0.03 %H2O2的甲醇溶液(室温)30 min以去除内源性过氧化物酶，然后蒸馏水洗3次。③热源修复抗原：将切片浸入0.01 mol/L的枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)中，微波炉加热至沸腾后断电，间隔5～10 min，反复1～2次，冷却后用PBS(pH 7.2～7.6)洗涤1～2次。④用抗原修复液Ⅰ进一步暴露抗原：将抗原(稀释1∶200)修复液滴加在切片上,室温10 min后，用PBS (pH 7.2～7.6)洗涤3次。⑤在切片上滴加封闭液，室温20 min，甩去多余的液体，不能冲洗。⑥滴加稀释的一抗兔IgG，放入冷藏室过夜。第二天取出切片，放置至室温后，用PBS(pH 7.2～7.6)洗涤3次，各2 min。⑦再滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37 ℃温度下放置20 min，用PBS(pH 7.2～7.6)洗涤3次，各2 min。⑧滴加试剂SABC，在20～37 ℃温度下放置20 min，用PBS(pH 7.2～7.6)洗涤3次，各5 min。⑨DBA显色：使用DBA显色试剂盒(AR1022)，取1 mL蒸馏水加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5～30 min。苏木素轻度复染，脱水、透明、封片。取假手术组切片6张，用PBS代替一抗。
(2)定量观察：采用BI-2000图像分析系统，于400倍放大条件下，在每张切片上随机摄取5个视野，测阳性细胞的光密度值及灰度值，并做统计分析。
2.6 统计学处理
所有实验数据用SPSS 12.0统计软件处理，均采用均数±标准差(±s)表示，组间比较用单因素方差分析，各实验组均数间的两两比较若方差齐则采用LSD检验，方差不齐采用Tamhane’s T2 检验。
3 实验结果
3.1 各组大鼠海马匀浆中Glu含量的比较
结果见表1。模型组与假手术组比较，模型组大鼠海马区Glu含量明显升高(P﹤0.01)，说明造模成功；通络益智散大、小剂量组Glu显著低于模型组(P﹤0.01)，但与尼莫地平组比较无显著性差异(P﹥0.05)，结果提示通络益智散大、小剂量组能降低VD大鼠Glu含量，治疗效果与尼莫地平相当。
3.2 各组大鼠海马齿状回GABA表达的比较
结果见表2。模型组与假手术组相比，GABA平均光密度在CA1区均明显减少，平均灰度值升高(P﹤0.01)；各治疗组与假手术组比较，除小剂量组外，其他两组GABA平均光密度在CA1区均显著升高，平均灰度值显著降低(P﹤0.01)；各治疗组GABA平均光密度较模型组均显著增多(P﹤0.01)，升高幅度以尼莫地平、大剂量、小剂量的顺序依次降低。
表1 通络益智散对VD大鼠脑组织Glu含量的影响(略)
注：与假手术组比较★P﹤0.01；与模型组比较△P﹤0.01
表2 大鼠海马CA1区平均灰度值及平均光密度值(略)
注：与假手术组比较★P﹤0.01；与模型组比较△P﹤0.01；与尼莫地平组比较*P﹤0.05
4 讨论
谷氨酸(Glu)是人和哺乳动物脑内含量最高的兴奋性氨基酸(EAAs)，参与中枢神经系统的信息传递，在学习记忆、突触可塑性、神经元发育和退化等方面亦有重要的作用。但过量的Glu对神经元有明显的损伤作用，因此已被认为是内源性兴奋性毒素[3]。据文献报道，其兴奋毒性作用在急性脑缺血细胞凋亡、再灌注损伤和迟发性神经元死亡中起重要作用。γGABA被认为是重要的抑制性神经递质，具有降低兴奋性与神经保护作用。因此，缺血再灌注后，Glu升高的同时如能出现GABA的释放增高，这一过程则意味着可能建立对抗EAAs过量的保护机制[4]。
本研究结果显示:采用缺血再灌注制造的VD模型组大鼠海马区Glu含量明显高于假手术组(P<0.01)，而GABA的表达则明显低于假手术组(P<0.01)；用药后各组Glu含量降低，GABA表达增强。提示通络益智散治疗血管性痴呆的作用机制是：一方面通过降低海马区兴奋性氨基酸类神经递质含量以减轻其兴奋性神经毒性作用；另一方面则通过增加海马区抑制性氨基酸(IAAs)含量，以对抗EAAs的神经毒性作用。因此，调节兴奋性及抑制性氨基酸类神经递质的平衡可能是通络益智散治疗血管性痴呆的机制之一。
参考文献：
[1]王永炎.现代中医临床与研究血管性痴呆[M].北京：人民卫生出版社，2003：255-259.
[2]王蕊,杨秦飞,唐一鹏,等.大鼠拟“血管性痴呆”模型的改进[J].中国病理生理杂志,2000,16(10):914.
[3]邓文斌，张均田.脑缺血时谷氨酸兴奋性毒性及毒理学对抗策略[J].国外医学·脑血管疾病分册，1996，(4)：12.
[4]Gromdahl TO,Berg Johnsen J,Langmoen IA.Chloride influx durin gcerebral energy deprivation [J] .NeurolPes, 1998,20(2):131-136.
(甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000；甘肃中医学院附属医院，甘肃 兰州 730020), http://www.100md.com(戴恩来，欧秀梅，马鸿斌，孙红旭)