胃癌患者外周血Survivin基因mRNA表达及其临床意义
【摘要】 目的 检测胃癌患者外周血中肿瘤细胞Survivin基因mRNA表达，探讨其在胃癌微转移检测中的意义。方法 采用逆转录分子信标实时荧光定量PCR(RT-QPCR)方法，以Survivin基因cDNA克隆重组质粒为标准品，检测胃癌患者外周血肿瘤细胞中Survivin基因mRNA模板拷贝数，分析拷贝数与临床资料之间的关系。结果 Survivin基因mRNA分子信标实时定量方法的线性检测范围为104～109个拷贝，外周血肿瘤细胞Survivin基因模板拷贝数与患者的性别、年龄、TNM分期及病理类型差异无显著性(P>0.05)，而与患者淋巴结转移及生存状况差异有显著性(P<0.05)。结论 外周血肿瘤细胞Survivin基因mRNA表达可用于检测胃癌的血性转移，为早期诊断微转移的存在、评价患者预后、指导临床治疗提供依据。
【关键词】 定量PCR；survivin；微转移；外周血；胃癌
Expression of survivin mRNA in peripheral blood of patients with gastric cancer and its clinical implication
ZHENG Hong，WANG Jia-cang.Department of Biochemistry and Molecular Biology，The Cancer Hospital of Tianjin Medical University Tianjin 300060，China
【Abstract】 Objective To study the mRNA expression of survivin gene in peripheral blood of patients with gastric cancer and its clinical significance.Methods The expression of survivin gene was detected by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction(RT-QPCR) using a molecular beacon probe，while recombination plasmid containing the sequence of survivin was standard. It was analyzed that the relationship between copies of survivin expression in peripheral blood with gastric cancer and clinical data.Results A linear standard curve was obtained between 104 and 109 copies. The copies of survivin mRNA did not correlate with gender，age，TNM stage and histological types (P>0.05). There were the relationships between copies of survivin gene with lymph node metastasis and poor survival (P<0.05).Conclusion The expression of survivin mRNA can be used to detecte micro-metastasis in peripheral blood circulation of gastric cancer. It is a useful marker to predict prognosis and decide on clicinal therapy.
【Key words】 quantitative PCR；survivin；micrometastasis；peripheral blood；gastric carcinoma
胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一，在临床治疗中，复发和转移是常见的问题，直接影响到患者的预后。早期发现肿瘤患者外周血中是否有肿瘤细胞存在，不仅对判断肿瘤转移和复发有着重要的价值，而且对指导临床治疗，改善患者预后有重要的意义。随着逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术的广泛应用，可以检测到肿瘤患者外周血中常规方法(如CT、MRI、普通形态学及免疫组织化学等)无法检测到的极少数肿瘤细胞中特异基因mRNA的表达，预示肿瘤的微小转移存在。近来，特别是荧光实时定量PCR技术的发展，不仅可以定量检测mRNA的原始模板拷贝数，而且由于特异性探针的引入，使其灵敏 度也高于常规PCR的定性检测。
Survivin是1997年[1]发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis，IAP)家族成员之一，它在终末分化的成人正常细胞中很少表达，而在绝大多数肿瘤细胞中高表达[2，3]。文献报道[4～6]，胃癌患者中Survivin基因mRNA表达阳性率高达60%以上，使其很有可能成为一个潜在的胃癌肿瘤标志物。本文采用逆转录分子信标实时荧光定量PCR(RT-QPCR)技术，选择Survivin 基因作为胃癌微转移的研究靶点，定量检测胃癌患者外周血中Survivin 基因mRNA的模板拷贝数，探讨其在胃癌微转移中的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本收集 本院2001年11月～2003年11月手术切除经病理证实的胃癌患者56例，其中男34例，女22例；年龄38～86岁，中位年龄56岁；TNM分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期19例，Ⅲ期21例，Ⅳ期13例；组织学类型：低分化腺癌16例，乳头状/管状腺癌11例，黏液癌14例，混合性癌15例；按生存期分组：30个月内无转移复发者30例，为生存组；30个月有转移复发或死亡者26例，为转移死亡组。
1.1.2 探针及引物 上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物：5’-CCT GGC AGC CCT TTC TCA-3’，下游引物：5’-TCA GTG GGG CAG TGG ATG-3’，分子信标探针：5’- CCG CAT CTC TAC ATT CAA GAA CTG GCA TGC GG -3’ (画线部分为探针自身互补序列)，探针的5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团DABCYL；扩增片段大小121bp。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取 术前取患者静脉血5ml，枸橼酸钠抗凝，淋巴细胞分离液(灏洋公司产品)分离有核细胞，生理盐水洗涤3次，于-80℃冰箱保存。采用Trizol(Invitrogen公司产品)试剂提取细胞总RNA，分光光度法测定RNA的浓度和纯度，1%琼脂糖电泳鉴定RNA的完整性。
1.2.2 cDNA的合成 以2μg总RNA为逆转录模板，以Oligo(dT)12为引物，在M-MLV逆转录酶作用下合成单链cDNA。
1.2.3 实时荧光定量检测 以Survivin基因cDNA克隆重组质粒[7]为定量检测标准品，在20 μl反应体系中加入10μl Universal PCR Master Mix (ABI公司产品)，上、下游引物及分子信标探针各200nM，不同模板拷贝数的标准品或100ng待测样本cDNA。在ABI 7500荧光定量PCR仪进行定量检测，反应条件为50℃温育2min；95℃预变性2min；95℃ 20s，60℃60s，45个循环。每个标准或样本重复检测2次。
1.2.4 统计学处理 数据分析使用SPSS11.0软件包进行。Survivin mRNA模板拷贝数转换为对数进行统计分析，模板拷贝数与病理类型间的比较采用方差分析，与其他临床参数之间的比较采用独立样本t检验。
2 结果
2.1 RNA鉴定 提取的外周血有核细胞总RNA，以OD260/280的比值鉴定RNA的纯度，比值在1.8～2.0之间，大于1.8，说明提取的RNA无蛋白的污染。以琼脂糖电泳鉴定RNA的完整性，可见明显18S和28S 的RNA区带，二者比例约为1:2(见图1)，说明提取的RNA无明显降解。
2.2 实时定量检测 标准品检测范围104～109个拷贝(见图2)；以每个标准拷贝数的对数为横坐标，以荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数(Ct值)为纵坐标，绘制标准曲线，得到一条直线，其直线截距a=65.3664，斜率b=-5.3151，相关系数r =0.9940；根据被检测样品的Ct值，通过标准曲线计算出样本的模板拷贝数。 图1 胃癌患者外周血有核细胞
1%琼脂糖RNA电泳图2 Survivin 分子信标荧光定量PCR检测标准曲线2.3 Survivin 模板拷贝数与临床资料的关系 本研究对未检测到Survivin mRNA表达的样本，模板拷贝数以“0”计入统计资料。56例胃癌患者外周血肿瘤细胞中Survivin 基因mRNA模板拷贝数均值为2727.63个拷贝，标准差为341.94个拷贝；拷贝数与临床资料之间的关系见表1，结果显示：外周血中Survivin 基因mRNA拷贝数与患者的性别、年龄、TNM分期以及病理类型差异无显著性(P>0.05)，而与淋巴结转移和患者生存期差异有显著性(P<0.05)。表1 胃癌患者外周血Survivin mRNA拷贝数与临床资料的关系
3 讨论
肿瘤的浸润和转移是影响患者预后的重要因素，其中肿瘤细胞在血液循环中播散是肿瘤转移的方式之一，属于肿瘤转移的早期阶段，称为微转移。检测患者外周血中微转移的存在，及时进行干预性治疗，可有助于减少肿瘤的复发和转移，提高患者生存率，降低死亡率。在微转移的检测中，检测方法的灵敏度和靶基因的选择就显得尤为重要。检测灵敏度越高，微转移发现的越早，对患者的治疗越及时；靶基因首先应该选择肿瘤细胞特异性的，其检测的结果能够正确反映肿瘤细胞的存在。
常规PCR方法仅是对扩增后的产物进行定性或半定量检测，而非检测原始模板量。目前新的技术——实时荧光定量PCR技术，是在进行特异性引物扩增时加入特异的荧光探针进行杂交，在PCR扩增的同时即可通过探针荧光信号的变化观察结果，不仅简化了检测手段，而且大大地提高了检测方法的灵敏度。在有标准品存在时，还可对原始模板进行拷贝数定量。对于Survivin基因mRNA表达的检测，实时荧光定量检测方法的灵敏度要高于普通PCR方法至少一个数量级以上[8]。
人类Survivin基因定位于染色体17q25，全长14.7kb，包含3个内含子和4个外显子，mRNA长度1.9kb，表达一个相对分子量为16.5KD的蛋白。Survivin是IAP家族的重要成员，它是以细胞周期依赖方式，特异地表达于G2/M期，与有丝分裂纺锤体结合，对促进细胞增值有着非常重要的作用[9]。Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制蛋白，其抗凋亡作用远大于bcl-2家族，且与肿瘤的发生发展密切相关[10，11]。因其具有仅在肿瘤细胞中表达的特性，Survivin有可能是恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点，成为判断患者预后的重要参考指标[12]。
由于外周血循环系统中存在RNA酶，因此，进入循环系统中的游离mRNA分子迅速被降解而不能被检测到，所有在外周血中检测到的mRNA表达一定是存在于细胞内的mRNA分子。如果所检测的基因仅在肿瘤细胞中特异表达，即说明血循环中有肿瘤细胞存在，预示着可能出现肿瘤的复发和转移。Survivin的表达不仅具有上述特点，而且在胃癌患者中表达的阳性率较高[4～6]，是一个理想的判断胃癌微转移的靶因子。
本研究采用分子信标实时荧光定量PCR的方法，检测了56例胃癌患者外周血中肿瘤细胞的Survivin基因mRNA表达，结果显示：阳性率达75%(42/56)，平均模板拷贝数在103数量级；无、有淋巴结转移患者模板拷贝数分别在102和104水平，两者比较差异有显著性；30个月内有转移或死亡的患者模板拷贝数在104水平，显著高于无转移的生存组的102水平。
综上所述，本研究采用高灵敏的分子信标实时荧光定量PCR方法，选择其mRNA表达与肿瘤细胞密切相关的Survivin基因，检测外周血中Survivin基因mRNA模板拷贝数，其拷贝数与患者淋巴结转移和生存状况显著相关，提示Survivin基因表达可能成为胃癌患者外周血中微转移存在的早期诊断指标，而且对指导治疗方案的选择及判断患者的预后提供重要依据。
【参考文献】
1 Ambrosini G，Adida C，Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma. Nature Med，1997，3:917-921.
2 Yu J，Leung WK，Ebert MP，et al. Increased expression of survivin in gastric cancer patient and in first degree relative. Br J Cancer，2002，81:91-97.
3 Sarela AI，Scott N，Ramsdale J，et al. Immunohistochemical detection of anti-apoptosis protein，survivin，predicts survival after curative resection of stage II colorectal carcinomas. Ann Surg Oncol，2001，8:305-310.
4 Meng H，Lu C，Mabuchi H，et al. Prognostic significance and different properties of survivin splicing variants in gastric cancer. Cancer Lett，2004，216:147-155.
5 Wang ZN，Xu HM，Jiang L，et al. Expression of survivin in primary and metastatic gastric cancer cells obtained by laser capture microdissection. World J Gastroenterol，2004，10:3094-3098.
6 Tsuburaya A，Noguchi Y，Yoshikawa T，et al. An anti-apoptosis gene，survivin and telomerase expression in gastric cancer. Hepatogastroenterology，2002，49:1150-1152.
7 郑红，粱东春，张镜宇. 人类Survivin基因的cDNA克隆及序列分析. 天津医药，2004，32:1-4.
8 郑红，孙保存，胡建章，等. Survivin基因mRNA分子信标定量检测方法建立及在肠癌中的应用. 中华实验外科杂志，2006，23:602-605.
9 Altieri DC. Validating survivin as a cancer therapeutic target. Nat Rev Cancer，2003，3(1):46-54.
10 Deng H，Wu RL，Zhou HY，et al. Signficance of Survivin ang PTEN expression in full lymph node-examined gastric cancer. World J Gastroenterol，2006，12:1013-1017.
11 Ponnelle T，Chapusot C，Martin L，et al. Cellular localisation of survivin: impact on the prognosis colorectal cancer. J cancer Res Clin Oncol，2005，131:504-510.
12 Hua Meng，Cai Delu，Yu Leisun，et al. Expression level of wild-type survivin in gastric cancer is an independent predictor of survival. World J Gastroenterol，2004，10:3245-3250.
*基金项目：国家教育部重点项目(地方01006)资助
作者单位： 300060 天津，天津医科大学附属肿瘤医院生化分子生物室(△腹科)
(编辑：邓 锋), 百拇医药(郑红，王家仓)
【关键词】 定量PCR；survivin；微转移；外周血；胃癌
Expression of survivin mRNA in peripheral blood of patients with gastric cancer and its clinical implication
ZHENG Hong，WANG Jia-cang.Department of Biochemistry and Molecular Biology，The Cancer Hospital of Tianjin Medical University Tianjin 300060，China
【Abstract】 Objective To study the mRNA expression of survivin gene in peripheral blood of patients with gastric cancer and its clinical significance.Methods The expression of survivin gene was detected by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction(RT-QPCR) using a molecular beacon probe，while recombination plasmid containing the sequence of survivin was standard. It was analyzed that the relationship between copies of survivin expression in peripheral blood with gastric cancer and clinical data.Results A linear standard curve was obtained between 104 and 109 copies. The copies of survivin mRNA did not correlate with gender，age，TNM stage and histological types (P>0.05). There were the relationships between copies of survivin gene with lymph node metastasis and poor survival (P<0.05).Conclusion The expression of survivin mRNA can be used to detecte micro-metastasis in peripheral blood circulation of gastric cancer. It is a useful marker to predict prognosis and decide on clicinal therapy.
【Key words】 quantitative PCR；survivin；micrometastasis；peripheral blood；gastric carcinoma
胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一，在临床治疗中，复发和转移是常见的问题，直接影响到患者的预后。早期发现肿瘤患者外周血中是否有肿瘤细胞存在，不仅对判断肿瘤转移和复发有着重要的价值，而且对指导临床治疗，改善患者预后有重要的意义。随着逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术的广泛应用，可以检测到肿瘤患者外周血中常规方法(如CT、MRI、普通形态学及免疫组织化学等)无法检测到的极少数肿瘤细胞中特异基因mRNA的表达，预示肿瘤的微小转移存在。近来，特别是荧光实时定量PCR技术的发展，不仅可以定量检测mRNA的原始模板拷贝数，而且由于特异性探针的引入，使其灵敏 度也高于常规PCR的定性检测。
Survivin是1997年[1]发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis，IAP)家族成员之一，它在终末分化的成人正常细胞中很少表达，而在绝大多数肿瘤细胞中高表达[2，3]。文献报道[4～6]，胃癌患者中Survivin基因mRNA表达阳性率高达60%以上，使其很有可能成为一个潜在的胃癌肿瘤标志物。本文采用逆转录分子信标实时荧光定量PCR(RT-QPCR)技术，选择Survivin 基因作为胃癌微转移的研究靶点，定量检测胃癌患者外周血中Survivin 基因mRNA的模板拷贝数，探讨其在胃癌微转移中的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本收集 本院2001年11月～2003年11月手术切除经病理证实的胃癌患者56例，其中男34例，女22例；年龄38～86岁，中位年龄56岁；TNM分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期19例，Ⅲ期21例，Ⅳ期13例；组织学类型：低分化腺癌16例，乳头状/管状腺癌11例，黏液癌14例，混合性癌15例；按生存期分组：30个月内无转移复发者30例，为生存组；30个月有转移复发或死亡者26例，为转移死亡组。
1.1.2 探针及引物 上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物：5’-CCT GGC AGC CCT TTC TCA-3’，下游引物：5’-TCA GTG GGG CAG TGG ATG-3’，分子信标探针：5’- CCG CAT CTC TAC ATT CAA GAA CTG GCA TGC GG -3’ (画线部分为探针自身互补序列)，探针的5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团DABCYL；扩增片段大小121bp。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取 术前取患者静脉血5ml，枸橼酸钠抗凝，淋巴细胞分离液(灏洋公司产品)分离有核细胞，生理盐水洗涤3次，于-80℃冰箱保存。采用Trizol(Invitrogen公司产品)试剂提取细胞总RNA，分光光度法测定RNA的浓度和纯度，1%琼脂糖电泳鉴定RNA的完整性。
1.2.2 cDNA的合成 以2μg总RNA为逆转录模板，以Oligo(dT)12为引物，在M-MLV逆转录酶作用下合成单链cDNA。
1.2.3 实时荧光定量检测 以Survivin基因cDNA克隆重组质粒[7]为定量检测标准品，在20 μl反应体系中加入10μl Universal PCR Master Mix (ABI公司产品)，上、下游引物及分子信标探针各200nM，不同模板拷贝数的标准品或100ng待测样本cDNA。在ABI 7500荧光定量PCR仪进行定量检测，反应条件为50℃温育2min；95℃预变性2min；95℃ 20s，60℃60s，45个循环。每个标准或样本重复检测2次。
1.2.4 统计学处理 数据分析使用SPSS11.0软件包进行。Survivin mRNA模板拷贝数转换为对数进行统计分析，模板拷贝数与病理类型间的比较采用方差分析，与其他临床参数之间的比较采用独立样本t检验。
2 结果
2.1 RNA鉴定 提取的外周血有核细胞总RNA，以OD260/280的比值鉴定RNA的纯度，比值在1.8～2.0之间，大于1.8，说明提取的RNA无蛋白的污染。以琼脂糖电泳鉴定RNA的完整性，可见明显18S和28S 的RNA区带，二者比例约为1:2(见图1)，说明提取的RNA无明显降解。
2.2 实时定量检测 标准品检测范围104～109个拷贝(见图2)；以每个标准拷贝数的对数为横坐标，以荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数(Ct值)为纵坐标，绘制标准曲线，得到一条直线，其直线截距a=65.3664，斜率b=-5.3151，相关系数r =0.9940；根据被检测样品的Ct值，通过标准曲线计算出样本的模板拷贝数。 图1 胃癌患者外周血有核细胞
1%琼脂糖RNA电泳图2 Survivin 分子信标荧光定量PCR检测标准曲线2.3 Survivin 模板拷贝数与临床资料的关系 本研究对未检测到Survivin mRNA表达的样本，模板拷贝数以“0”计入统计资料。56例胃癌患者外周血肿瘤细胞中Survivin 基因mRNA模板拷贝数均值为2727.63个拷贝，标准差为341.94个拷贝；拷贝数与临床资料之间的关系见表1，结果显示：外周血中Survivin 基因mRNA拷贝数与患者的性别、年龄、TNM分期以及病理类型差异无显著性(P>0.05)，而与淋巴结转移和患者生存期差异有显著性(P<0.05)。表1 胃癌患者外周血Survivin mRNA拷贝数与临床资料的关系
3 讨论
肿瘤的浸润和转移是影响患者预后的重要因素，其中肿瘤细胞在血液循环中播散是肿瘤转移的方式之一，属于肿瘤转移的早期阶段，称为微转移。检测患者外周血中微转移的存在，及时进行干预性治疗，可有助于减少肿瘤的复发和转移，提高患者生存率，降低死亡率。在微转移的检测中，检测方法的灵敏度和靶基因的选择就显得尤为重要。检测灵敏度越高，微转移发现的越早，对患者的治疗越及时；靶基因首先应该选择肿瘤细胞特异性的，其检测的结果能够正确反映肿瘤细胞的存在。
常规PCR方法仅是对扩增后的产物进行定性或半定量检测，而非检测原始模板量。目前新的技术——实时荧光定量PCR技术，是在进行特异性引物扩增时加入特异的荧光探针进行杂交，在PCR扩增的同时即可通过探针荧光信号的变化观察结果，不仅简化了检测手段，而且大大地提高了检测方法的灵敏度。在有标准品存在时，还可对原始模板进行拷贝数定量。对于Survivin基因mRNA表达的检测，实时荧光定量检测方法的灵敏度要高于普通PCR方法至少一个数量级以上[8]。
人类Survivin基因定位于染色体17q25，全长14.7kb，包含3个内含子和4个外显子，mRNA长度1.9kb，表达一个相对分子量为16.5KD的蛋白。Survivin是IAP家族的重要成员，它是以细胞周期依赖方式，特异地表达于G2/M期，与有丝分裂纺锤体结合，对促进细胞增值有着非常重要的作用[9]。Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制蛋白，其抗凋亡作用远大于bcl-2家族，且与肿瘤的发生发展密切相关[10，11]。因其具有仅在肿瘤细胞中表达的特性，Survivin有可能是恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点，成为判断患者预后的重要参考指标[12]。
由于外周血循环系统中存在RNA酶，因此，进入循环系统中的游离mRNA分子迅速被降解而不能被检测到，所有在外周血中检测到的mRNA表达一定是存在于细胞内的mRNA分子。如果所检测的基因仅在肿瘤细胞中特异表达，即说明血循环中有肿瘤细胞存在，预示着可能出现肿瘤的复发和转移。Survivin的表达不仅具有上述特点，而且在胃癌患者中表达的阳性率较高[4～6]，是一个理想的判断胃癌微转移的靶因子。
本研究采用分子信标实时荧光定量PCR的方法，检测了56例胃癌患者外周血中肿瘤细胞的Survivin基因mRNA表达，结果显示：阳性率达75%(42/56)，平均模板拷贝数在103数量级；无、有淋巴结转移患者模板拷贝数分别在102和104水平，两者比较差异有显著性；30个月内有转移或死亡的患者模板拷贝数在104水平，显著高于无转移的生存组的102水平。
综上所述，本研究采用高灵敏的分子信标实时荧光定量PCR方法，选择其mRNA表达与肿瘤细胞密切相关的Survivin基因，检测外周血中Survivin基因mRNA模板拷贝数，其拷贝数与患者淋巴结转移和生存状况显著相关，提示Survivin基因表达可能成为胃癌患者外周血中微转移存在的早期诊断指标，而且对指导治疗方案的选择及判断患者的预后提供重要依据。
【参考文献】
1 Ambrosini G，Adida C，Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma. Nature Med，1997，3:917-921.
2 Yu J，Leung WK，Ebert MP，et al. Increased expression of survivin in gastric cancer patient and in first degree relative. Br J Cancer，2002，81:91-97.
3 Sarela AI，Scott N，Ramsdale J，et al. Immunohistochemical detection of anti-apoptosis protein，survivin，predicts survival after curative resection of stage II colorectal carcinomas. Ann Surg Oncol，2001，8:305-310.
4 Meng H，Lu C，Mabuchi H，et al. Prognostic significance and different properties of survivin splicing variants in gastric cancer. Cancer Lett，2004，216:147-155.
5 Wang ZN，Xu HM，Jiang L，et al. Expression of survivin in primary and metastatic gastric cancer cells obtained by laser capture microdissection. World J Gastroenterol，2004，10:3094-3098.
6 Tsuburaya A，Noguchi Y，Yoshikawa T，et al. An anti-apoptosis gene，survivin and telomerase expression in gastric cancer. Hepatogastroenterology，2002，49:1150-1152.
7 郑红，粱东春，张镜宇. 人类Survivin基因的cDNA克隆及序列分析. 天津医药，2004，32:1-4.
8 郑红，孙保存，胡建章，等. Survivin基因mRNA分子信标定量检测方法建立及在肠癌中的应用. 中华实验外科杂志，2006，23:602-605.
9 Altieri DC. Validating survivin as a cancer therapeutic target. Nat Rev Cancer，2003，3(1):46-54.
10 Deng H，Wu RL，Zhou HY，et al. Signficance of Survivin ang PTEN expression in full lymph node-examined gastric cancer. World J Gastroenterol，2006，12:1013-1017.
11 Ponnelle T，Chapusot C，Martin L，et al. Cellular localisation of survivin: impact on the prognosis colorectal cancer. J cancer Res Clin Oncol，2005，131:504-510.
12 Hua Meng，Cai Delu，Yu Leisun，et al. Expression level of wild-type survivin in gastric cancer is an independent predictor of survival. World J Gastroenterol，2004，10:3245-3250.
*基金项目：国家教育部重点项目(地方01006)资助
作者单位： 300060 天津，天津医科大学附属肿瘤医院生化分子生物室(△腹科)
(编辑：邓 锋), 百拇医药(郑红，王家仓)