原发性肝细胞癌HBsAg、Fas和PCNA抗原的表达及其意义
【摘要】目的：通过检测原发性肝细胞癌(HCC)及其癌周肝组织HBsAg、Fas抗原和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，探讨其表达的规律和意义以及HBV感染与HCC的相关关系，HCC发生的机制。方法：对52例肝癌标本及42例癌周肝组织应用免疫组织化学方法检测HBsAg、Fas和PCNA的表达，并结合血清甲胎蛋白(AFP)水平进行分析。结果：癌周肝组织高度表达HBsAg和Fas，阳性率均达78.6%，癌组织表达阳性率分别为21.2%和30.8%，阳性表达仅限于分化良好者，差异有统计学意义(P均<0.005)。癌组织和癌周组织HBsAg和Fas的表达具有相关性。癌组织的PCNA标记指数(54.8±25.9)，显著高于癌周组织(11.6±9.7)(P<0.001)，其中HBsAg阳性者标记指数又低于HBsAg阴性者(41.4±28.5 vs 58.4±24.2，P<0.05)。在癌周组织PCNA阳性细胞常常位于肝小叶周边部，体积较小，核圆形或卵圆形。结论：由于高分化癌具有低水平表达HBsAg的能力，推测HBsAg在癌组织中的表达消失或低表达应归因于癌细胞的低分化状态。癌周组织持续发生肝细胞的凋亡，但在癌组织尤其是低分化癌组织中则减弱或消失，可能归因于癌细胞不能表达病毒抗原。卵圆形细胞的异常增殖可能是肝癌发生的前提条件。
【关键词】癌，肝细胞·肝炎表面抗原，乙型·抗原，CD95·增殖细胞核抗原
Expression of HBsAg,Fas and PCNA in hepatocellular carcinoma and their significance in understanding HBV related hepatocarcinogenesis
JIANG Runde1,ZONG Ning2,LI Zhanyuan3,WANG Zhanmin3
1Department of Hepatobiliary Surgery,Jinan General Military Hospital of PLA(Jinan
250031,China)
2Medical Team of Zibo Detachment Shandong Provincal Lorps,Chinese People’s Armed
Police Forces(Shandong 255031,China)
3Department of General Surgery,Qilu Hospital of Shandong Universit(Jinan 250012,
China)
【ABSTRACT】Objective:To investigate the expressive characters and their significance by detecting the expressions of HBsAg,Fas and proliferating cell nuclear antigen(PCNA) in both hepatocellular carcinoma(HCC) and their surrounding noncancerous tissues.The correlation between HBV infection and HCC,and the possible mechanism of hepatocellular carcinogenesis were discussed.Methods:HBsAg,Fas and PCNA were detected by immunohistochemistry from 52 cases of hepatocellular carcinoma as well as 42 corresponding noncancerous tissues.Clinical data suchas serum AFP levels was also analysed.Results:Both HBsAg and Fas were strongly expressed in noncancerous tissues,with positive rate of each achieving 78.6%.However their expression rates in cancer tissues were 21.2% and 30.8% respectively,significantly lower and less intensive than that of their corresponding noncancerous ones(P<0.005).The expression in cancer tissues are only found in the well differentiated types.Close correlations were found for HBsAg and Fas expressions in both cancer and noncancerous tissues.The average PCNA labeling index(PCNA LI)of HCC was 54.8±25.9,significantly higher than that of noncancerous tissues,which is only 11.6±9.7(P<0.001).Whereas among HCC patients,the average PCNA LI of HBsAg positive ones was significantly lower than that of HBsAg negative ones(41.4±28.5 vs 58.4±24.2 P<0.05).In noncancerous tissues most PCNA positive cells are nucleus ovalshaped small cells which are mostly found in the perilobule areas.Conclusion:As well differentiated HCC cells possess the ability to express HBsAg,the much less expression of HBsAg in cancer tissues was postulated to be the result of undifferentiation of cancer cells.The close relationship between HBsAg and Fas expression indicates that persistent apoptosis still occur in the noncancerous tissues and this process is not ready to happen in the HCC tissues possibly due to the disability of cancer cells to express virus related antigens.The proliferation of oval cells in chronic hepatitis tissues might be a prerequisite for the generation of hepatocellular carcinoma.
【KEY WORDS】Carcinoma,hepatocellular·Hepatitis B surface antigens·Antigens,CD95·Proliferating cell nuclear antigen 采用免疫组织化学技术研究肝细胞癌及其对应的癌周组织HBsAg和Fas抗原的表达情况，结合增殖细胞核抗原(PCNA)标记指数和血清AFP水平，探讨HBV感染在肝细胞癌的发生中的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 一般资料 山东大学齐鲁医院肝细胞性肝癌手术标本存档蜡块52例，其中42例附有癌周肝硬化组织。男49例，女3例，年龄26~72岁，平均51岁。血清HBsAg阳性46例，占88%。根据Edmondson标准分级：Ⅰ级6例，Ⅱ级25例，Ⅲ级18例，Ⅳ级3例。每例病人术前血清AFP水平，以≥20ng/ml做为阳性标准，阳性率为71.2%(37/52)，平均AFP水平131.8ng/ml。
1.2.1 试剂 小鼠抗HBsAg单克隆抗体、小鼠抗人PCNA单克隆抗体(PC10)、生物素化二抗(山羊抗小鼠/兔)及SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程公司；兔抗人Fas IgG多克隆抗体(N18)购自北京中山生物技术公司。操作按说明书进行。
1.2 方法 免疫组化采用博士德生物工程公司推荐的SABC法(StreptABiotin Complex)。阳性对照用已知HBsAg、Fas表达阳性的慢性肝炎肝硬化切片和PCNA表达阳性的乳腺导管癌切片，阴性对照用正常鼠/兔血清代替一抗，空白对照用PBS代替一抗。
结果判断：(1)HBsAg：胞浆内出现棕黄色染色为阳性，按文献[1]方法对细胞内染色评分：a(阳性着色程度)：无着色为0，浅着色为1，深着色为2；b(阳性着色范围)：无着色为0，着色少于1/3为1，着色大于1/3为2，弥漫着色为3。将a、b两项相加，<3为阴性，≥3为阳性。(2)Fas：胞浆及胞膜出现弥漫性棕黄色染色为阳性，阳性细胞在小叶内呈簇状分布，多见于小叶周边部[2]。无染色或仅偶有散在细胞染色为阴性。(3)PCNA：以细胞核染为棕黄色为阳性。按文献[3]每张切片随机选取10个不同的高倍镜视野，每个视野计数100个癌/肝细胞中阳性细胞数，取其均值，即平均每100个细胞中阳性染色细胞数，做为标记指数(PCNA labeling index,PCNA LI)。
1.3 统计学处理 数值变量资料用均数的t检验，分类变量资料用χ2检验。
2 结 果
2.1 癌及癌周肝组织HBsAg的表达特点与结果 癌周肝组织HBsAg的表达以胞浆弥漫型为主，也可见包涵体型表达，阳性细胞呈部分小叶或小叶内部分细胞集中表达的倾向。癌细胞大多为HBsAg阴性，阳性仅表现为弱至中度的胞浆弥漫型染色。在包含癌与癌周组织的同一张切片内，癌灶内HBsAg阴性染色与癌周组织之阳性染色形成鲜的对照(图1，2)。52例肝细胞癌中，HBsAg阳性11例，阳性率21.2%，均表现为弱至中度染色；42例癌周肝组织HBsAg阳性33例，均呈中至强阳性表达，阳性率78.6%，两者差异有统计学意义(表1)。11例表达HBsAg的癌组织，分化Ⅰ级者5例，Ⅱ级者6例，低分化型癌组织(Ⅲ+Ⅳ)均无表达，分化型(Ⅰ+Ⅱ级)和低分化型癌组织HBsAg表达的阳性率差异也有统计学意义(表2)。 图2 肝癌组织HBsAg阴性，右下角为HBsAg阳性表达的癌周肝组织(SABC，×200)表1 肝癌及癌周肝组织HBsAg的表达表2 分化型与低分化型癌组织HBsAg的表达
2.2 癌及癌周肝组织Fas抗原的表达特点与结果 癌周与癌组织Fas抗原的阳性染色在假小叶或癌巢内呈簇状分布，多见于假小叶或癌巢周边部，尤其是碎屑样坏死区。癌组织Fas抗原表达的强度及频度明显低于癌周肝组织(图3，4)。52例肝癌标本中，Fas抗原表达16例，阳性率30.8%，42例癌周组织阳性表达33例，阳性率78.6%，两者差异有统计学意义(表3)。16例表达Fas的癌组织，分化型15例，低分化型1例，分化型与低分化型癌组织Fas抗原表达的阳性率差异也有统计学意义(表4)，提示Fas抗原的表达随癌组织恶性程度的增高而降低，与HBsAg的表达情况类似。图4 肝癌组织Fas阴性(SABC，×200)表3 肝癌及癌周肝组织Fas抗原的表达表4 分化型与低分化型肝癌组织Fas的表达
Fas抗原与HBsAg在癌及癌周肝组织中表达的关系见表5、6。无论是癌组织还是癌周组织，在可检出HBsAg的阳性组中，Fas抗原阳性表达率显著高于HBsAg阴性组，表明Fas抗原的表达与病毒抗原的表达有相关性。表5 肝癌组织Fas抗原与HBsAg表达的关系
2.3 癌及癌周组织PCNA的表达特点与结果 癌组织大多呈弥漫型染色(阳性细胞弥漫分布于整个视野)，小部分表现为散在型(阳性细胞散点状分散在视野中，背景以阴性细胞为主)及边缘型(阳性细胞主要分布在癌结节的周边部)。癌周肝组织以边缘型居多，阳性细胞常集中分布在肝小叶的周边部，直径只有正常肝细胞的1/4~1/2，核呈圆形或卵圆形，有时也可见阳性细胞散点状分布在肝小叶内(图5，6)。
52例肝细胞癌PCNA LI范围6.0~91.5，平均54.8±25.9;42例癌周肝组织PCNA LI范围1.2~50.0，平均11.6±9.7，两者差异有统计学意义(t=8.84,P<0.001)。11例HBsAg阳性肝癌PCNA LI平均41.4±28.5，41例HBsAg阴性肝癌PCNA LI平均58.4±24.2，两者差异也有统计学意义(t=1.9956,P<0.05)，表明表达HBsAg的癌细胞有相对较低的增殖活性。
3 讨 论
肝癌的发生是HBV感染后的晚期事件。本研究对癌及癌周组织HBsAg表达的检测发现，肝癌组织阳性染色的频度及强度明显低于癌周组织，52例癌组织中11例表达HBsAg阳性的癌组织全部是分化型，病人的血清AFP水平仅(27.5±34.1)ng/ml，明显低于肝癌病人AFP的平均水平(131.8±165.3)ng/ml，也低于HBsAg阴性表达组(157.2±176.9)ng/ml，与文献报道一致[4]。癌组织内Fas抗原和HBsAg的表达情况相类似，也主要见于分化型癌，两者的表达有相关性。这提示癌细胞的分化程度足够高时，它们也可以具备表达病毒相关抗原并被诱导凋亡的能力。因此我们推测，HBV在肝癌细胞尤其是低分化癌细胞的低表达或不表达是基于HBV对成熟肝细胞的专嗜性，该专嗜性要求只有成熟的肝细胞才能为HBV提供良好的复制与装配环境。癌细胞如果分化程度还没有足够的高，它们便不足以表达HBV相关抗原，也不足以诱生Fas抗原的表达，这可能是肝癌细胞逃避凋亡的机制之一。从癌周肝组织PCNA的表达情况来看，表达HBsAg和Fas的肝细胞一般PCNA阴性，表明不再具备增殖活性，凋亡是它们的最终归宿。
HBV感染引发HCC的解释有两种假说，即直接致癌机理和间接致癌机理。直接致癌机理者认为，HBV DNA或蛋白产物对肝细胞基因组的干扰可能是主要原因，其理论依据有：(1)表达HBsAg蛋白的HBV转基因小鼠有易发肝恶性肿瘤的倾向[5]；(2)发现HBV的X基因产物即X蛋白具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性，参与信号传导通路，影响细胞周期的调控，并具有反式转录激活作用[6]；(3)在肝细胞基因组上发现了整合状态的HBV DNA[7，8]。间接致癌机理者认为HBV的作用主要在于其对肝细胞的破坏，HCC的发生是基于肝细胞频繁的更新和增殖[9]。
综合文献及本实验研究，我们认为间接致癌机理更可能具有主导作用。其原因有：(1)HBV DNA本身不含癌基因序列，而它在肝细胞基因组中的整合无位点特异性，为随机整合方式，与特定癌基因的激活和抗癌基因的失活无明显的关系[4]；(2)整合可以发生在病毒感染的早期，但肝细胞癌的发生是病毒感染的晚期事件[4]；(3)如果HBV DNA的作用引发了HCC，那么在从肝细胞向肝癌细胞的过渡中，HBsAg应维持其一定的表达状态，但我们除了在高分化癌中可以检测到HBsAg的表达外，大多数肝细胞癌无HBsAg的表达；(4)从理论上讲，HCC应发生在有增殖活性的肝细胞上，但我们的实验发现有HBsAg表达的成熟肝 细胞极少有增殖活性，大多呈PCNA阴性，而有增殖活性的细胞是肝小叶外周体积较小的卵圆形细胞，即肝组织内可能存在的干细胞。
参 考 文 献
[1]Santella RM,Zhang YJ,Chen CJ,et al.Immunohistochemical detection of aflatoxin B1DNA adducts and hepatitis B virus antigens in hepatocellular carcinoma and nontumorous liver tissue[J].Environ Health Perspect,1993,99:199202.
[2]Seki S,Kitada T,Iwai S,et al.Immunohistochemical detection of Fas and apoptosis in type1 autoimmune hepatitis[J].Hepatogastroenterology,2003,50(33):12741277.
[3]Han NI,Lee YS,Choi H,et al.PCNA expression and electron microscopic study of acinus forming hepatocytes in chronic hepatitis B[J].Korean J Intern Med,2002,17(2):100106.
[4]骆抗先编著.乙型肝炎—基础和临床[J].北京：人民卫生出版社，1997.420425.
[5]Toshkov I,Chisari FV,Bannasch P.Hepatic preneoplasia in hepatitis B virus transgenic mice[J].Hepatology,1994,20(5):11621172.
[6]Murakami S.Hepatitis B virus X protein:a multifunctional viral regulator[J].J Gastroenterol,2001,36(10):651660.
[7]Birrer RB,Birrer D,Klavins JV.Hepatocellular carcinoma and hepatitis virus[J].Ann Clin Lab Sci,2003,33(1):3954.
[8]Arbuthnot P,Kew M.Hepatitis B virus and hepatocellular carcinoma[J].Int J Exp Pathol,2001,82(2):77100.
[9]Jakubczak JL,Chisari FV,Merlino G.Synergy between transforming growth factor alpha and hepatitis B virus surface antigen in hepatocellular proliferation and carcinogenesis[J].Cancer Res,1997,57(16):36063611.
1济南军区总医院 肝胆外科 (山东 济南 250031)
2武警山东总队淄博市支队卫生队 (山东 淄博 255031)
3山东大学齐鲁医院 普外科 (山东 济南 250012), 百拇医药(姜润德 宗宁 李占元 王占民)
【关键词】癌，肝细胞·肝炎表面抗原，乙型·抗原，CD95·增殖细胞核抗原
Expression of HBsAg,Fas and PCNA in hepatocellular carcinoma and their significance in understanding HBV related hepatocarcinogenesis
JIANG Runde1,ZONG Ning2,LI Zhanyuan3,WANG Zhanmin3
1Department of Hepatobiliary Surgery,Jinan General Military Hospital of PLA(Jinan
250031,China)
2Medical Team of Zibo Detachment Shandong Provincal Lorps,Chinese People’s Armed
Police Forces(Shandong 255031,China)
3Department of General Surgery,Qilu Hospital of Shandong Universit(Jinan 250012,
China)
【ABSTRACT】Objective:To investigate the expressive characters and their significance by detecting the expressions of HBsAg,Fas and proliferating cell nuclear antigen(PCNA) in both hepatocellular carcinoma(HCC) and their surrounding noncancerous tissues.The correlation between HBV infection and HCC,and the possible mechanism of hepatocellular carcinogenesis were discussed.Methods:HBsAg,Fas and PCNA were detected by immunohistochemistry from 52 cases of hepatocellular carcinoma as well as 42 corresponding noncancerous tissues.Clinical data suchas serum AFP levels was also analysed.Results:Both HBsAg and Fas were strongly expressed in noncancerous tissues,with positive rate of each achieving 78.6%.However their expression rates in cancer tissues were 21.2% and 30.8% respectively,significantly lower and less intensive than that of their corresponding noncancerous ones(P<0.005).The expression in cancer tissues are only found in the well differentiated types.Close correlations were found for HBsAg and Fas expressions in both cancer and noncancerous tissues.The average PCNA labeling index(PCNA LI)of HCC was 54.8±25.9,significantly higher than that of noncancerous tissues,which is only 11.6±9.7(P<0.001).Whereas among HCC patients,the average PCNA LI of HBsAg positive ones was significantly lower than that of HBsAg negative ones(41.4±28.5 vs 58.4±24.2 P<0.05).In noncancerous tissues most PCNA positive cells are nucleus ovalshaped small cells which are mostly found in the perilobule areas.Conclusion:As well differentiated HCC cells possess the ability to express HBsAg,the much less expression of HBsAg in cancer tissues was postulated to be the result of undifferentiation of cancer cells.The close relationship between HBsAg and Fas expression indicates that persistent apoptosis still occur in the noncancerous tissues and this process is not ready to happen in the HCC tissues possibly due to the disability of cancer cells to express virus related antigens.The proliferation of oval cells in chronic hepatitis tissues might be a prerequisite for the generation of hepatocellular carcinoma.
【KEY WORDS】Carcinoma,hepatocellular·Hepatitis B surface antigens·Antigens,CD95·Proliferating cell nuclear antigen 采用免疫组织化学技术研究肝细胞癌及其对应的癌周组织HBsAg和Fas抗原的表达情况，结合增殖细胞核抗原(PCNA)标记指数和血清AFP水平，探讨HBV感染在肝细胞癌的发生中的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 一般资料 山东大学齐鲁医院肝细胞性肝癌手术标本存档蜡块52例，其中42例附有癌周肝硬化组织。男49例，女3例，年龄26~72岁，平均51岁。血清HBsAg阳性46例，占88%。根据Edmondson标准分级：Ⅰ级6例，Ⅱ级25例，Ⅲ级18例，Ⅳ级3例。每例病人术前血清AFP水平，以≥20ng/ml做为阳性标准，阳性率为71.2%(37/52)，平均AFP水平131.8ng/ml。
1.2.1 试剂 小鼠抗HBsAg单克隆抗体、小鼠抗人PCNA单克隆抗体(PC10)、生物素化二抗(山羊抗小鼠/兔)及SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程公司；兔抗人Fas IgG多克隆抗体(N18)购自北京中山生物技术公司。操作按说明书进行。
1.2 方法 免疫组化采用博士德生物工程公司推荐的SABC法(StreptABiotin Complex)。阳性对照用已知HBsAg、Fas表达阳性的慢性肝炎肝硬化切片和PCNA表达阳性的乳腺导管癌切片，阴性对照用正常鼠/兔血清代替一抗，空白对照用PBS代替一抗。
结果判断：(1)HBsAg：胞浆内出现棕黄色染色为阳性，按文献[1]方法对细胞内染色评分：a(阳性着色程度)：无着色为0，浅着色为1，深着色为2；b(阳性着色范围)：无着色为0，着色少于1/3为1，着色大于1/3为2，弥漫着色为3。将a、b两项相加，<3为阴性，≥3为阳性。(2)Fas：胞浆及胞膜出现弥漫性棕黄色染色为阳性，阳性细胞在小叶内呈簇状分布，多见于小叶周边部[2]。无染色或仅偶有散在细胞染色为阴性。(3)PCNA：以细胞核染为棕黄色为阳性。按文献[3]每张切片随机选取10个不同的高倍镜视野，每个视野计数100个癌/肝细胞中阳性细胞数，取其均值，即平均每100个细胞中阳性染色细胞数，做为标记指数(PCNA labeling index,PCNA LI)。
1.3 统计学处理 数值变量资料用均数的t检验，分类变量资料用χ2检验。
2 结 果
2.1 癌及癌周肝组织HBsAg的表达特点与结果 癌周肝组织HBsAg的表达以胞浆弥漫型为主，也可见包涵体型表达，阳性细胞呈部分小叶或小叶内部分细胞集中表达的倾向。癌细胞大多为HBsAg阴性，阳性仅表现为弱至中度的胞浆弥漫型染色。在包含癌与癌周组织的同一张切片内，癌灶内HBsAg阴性染色与癌周组织之阳性染色形成鲜的对照(图1，2)。52例肝细胞癌中，HBsAg阳性11例，阳性率21.2%，均表现为弱至中度染色；42例癌周肝组织HBsAg阳性33例，均呈中至强阳性表达，阳性率78.6%，两者差异有统计学意义(表1)。11例表达HBsAg的癌组织，分化Ⅰ级者5例，Ⅱ级者6例，低分化型癌组织(Ⅲ+Ⅳ)均无表达，分化型(Ⅰ+Ⅱ级)和低分化型癌组织HBsAg表达的阳性率差异也有统计学意义(表2)。 图2 肝癌组织HBsAg阴性，右下角为HBsAg阳性表达的癌周肝组织(SABC，×200)表1 肝癌及癌周肝组织HBsAg的表达表2 分化型与低分化型癌组织HBsAg的表达
2.2 癌及癌周肝组织Fas抗原的表达特点与结果 癌周与癌组织Fas抗原的阳性染色在假小叶或癌巢内呈簇状分布，多见于假小叶或癌巢周边部，尤其是碎屑样坏死区。癌组织Fas抗原表达的强度及频度明显低于癌周肝组织(图3，4)。52例肝癌标本中，Fas抗原表达16例，阳性率30.8%，42例癌周组织阳性表达33例，阳性率78.6%，两者差异有统计学意义(表3)。16例表达Fas的癌组织，分化型15例，低分化型1例，分化型与低分化型癌组织Fas抗原表达的阳性率差异也有统计学意义(表4)，提示Fas抗原的表达随癌组织恶性程度的增高而降低，与HBsAg的表达情况类似。图4 肝癌组织Fas阴性(SABC，×200)表3 肝癌及癌周肝组织Fas抗原的表达表4 分化型与低分化型肝癌组织Fas的表达
Fas抗原与HBsAg在癌及癌周肝组织中表达的关系见表5、6。无论是癌组织还是癌周组织，在可检出HBsAg的阳性组中，Fas抗原阳性表达率显著高于HBsAg阴性组，表明Fas抗原的表达与病毒抗原的表达有相关性。表5 肝癌组织Fas抗原与HBsAg表达的关系
2.3 癌及癌周组织PCNA的表达特点与结果 癌组织大多呈弥漫型染色(阳性细胞弥漫分布于整个视野)，小部分表现为散在型(阳性细胞散点状分散在视野中，背景以阴性细胞为主)及边缘型(阳性细胞主要分布在癌结节的周边部)。癌周肝组织以边缘型居多，阳性细胞常集中分布在肝小叶的周边部，直径只有正常肝细胞的1/4~1/2，核呈圆形或卵圆形，有时也可见阳性细胞散点状分布在肝小叶内(图5，6)。
52例肝细胞癌PCNA LI范围6.0~91.5，平均54.8±25.9;42例癌周肝组织PCNA LI范围1.2~50.0，平均11.6±9.7，两者差异有统计学意义(t=8.84,P<0.001)。11例HBsAg阳性肝癌PCNA LI平均41.4±28.5，41例HBsAg阴性肝癌PCNA LI平均58.4±24.2，两者差异也有统计学意义(t=1.9956,P<0.05)，表明表达HBsAg的癌细胞有相对较低的增殖活性。
3 讨 论
肝癌的发生是HBV感染后的晚期事件。本研究对癌及癌周组织HBsAg表达的检测发现，肝癌组织阳性染色的频度及强度明显低于癌周组织，52例癌组织中11例表达HBsAg阳性的癌组织全部是分化型，病人的血清AFP水平仅(27.5±34.1)ng/ml，明显低于肝癌病人AFP的平均水平(131.8±165.3)ng/ml，也低于HBsAg阴性表达组(157.2±176.9)ng/ml，与文献报道一致[4]。癌组织内Fas抗原和HBsAg的表达情况相类似，也主要见于分化型癌，两者的表达有相关性。这提示癌细胞的分化程度足够高时，它们也可以具备表达病毒相关抗原并被诱导凋亡的能力。因此我们推测，HBV在肝癌细胞尤其是低分化癌细胞的低表达或不表达是基于HBV对成熟肝细胞的专嗜性，该专嗜性要求只有成熟的肝细胞才能为HBV提供良好的复制与装配环境。癌细胞如果分化程度还没有足够的高，它们便不足以表达HBV相关抗原，也不足以诱生Fas抗原的表达，这可能是肝癌细胞逃避凋亡的机制之一。从癌周肝组织PCNA的表达情况来看，表达HBsAg和Fas的肝细胞一般PCNA阴性，表明不再具备增殖活性，凋亡是它们的最终归宿。
HBV感染引发HCC的解释有两种假说，即直接致癌机理和间接致癌机理。直接致癌机理者认为，HBV DNA或蛋白产物对肝细胞基因组的干扰可能是主要原因，其理论依据有：(1)表达HBsAg蛋白的HBV转基因小鼠有易发肝恶性肿瘤的倾向[5]；(2)发现HBV的X基因产物即X蛋白具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性，参与信号传导通路，影响细胞周期的调控，并具有反式转录激活作用[6]；(3)在肝细胞基因组上发现了整合状态的HBV DNA[7，8]。间接致癌机理者认为HBV的作用主要在于其对肝细胞的破坏，HCC的发生是基于肝细胞频繁的更新和增殖[9]。
综合文献及本实验研究，我们认为间接致癌机理更可能具有主导作用。其原因有：(1)HBV DNA本身不含癌基因序列，而它在肝细胞基因组中的整合无位点特异性，为随机整合方式，与特定癌基因的激活和抗癌基因的失活无明显的关系[4]；(2)整合可以发生在病毒感染的早期，但肝细胞癌的发生是病毒感染的晚期事件[4]；(3)如果HBV DNA的作用引发了HCC，那么在从肝细胞向肝癌细胞的过渡中，HBsAg应维持其一定的表达状态，但我们除了在高分化癌中可以检测到HBsAg的表达外，大多数肝细胞癌无HBsAg的表达；(4)从理论上讲，HCC应发生在有增殖活性的肝细胞上，但我们的实验发现有HBsAg表达的成熟肝 细胞极少有增殖活性，大多呈PCNA阴性，而有增殖活性的细胞是肝小叶外周体积较小的卵圆形细胞，即肝组织内可能存在的干细胞。
参 考 文 献
[1]Santella RM,Zhang YJ,Chen CJ,et al.Immunohistochemical detection of aflatoxin B1DNA adducts and hepatitis B virus antigens in hepatocellular carcinoma and nontumorous liver tissue[J].Environ Health Perspect,1993,99:199202.
[2]Seki S,Kitada T,Iwai S,et al.Immunohistochemical detection of Fas and apoptosis in type1 autoimmune hepatitis[J].Hepatogastroenterology,2003,50(33):12741277.
[3]Han NI,Lee YS,Choi H,et al.PCNA expression and electron microscopic study of acinus forming hepatocytes in chronic hepatitis B[J].Korean J Intern Med,2002,17(2):100106.
[4]骆抗先编著.乙型肝炎—基础和临床[J].北京：人民卫生出版社，1997.420425.
[5]Toshkov I,Chisari FV,Bannasch P.Hepatic preneoplasia in hepatitis B virus transgenic mice[J].Hepatology,1994,20(5):11621172.
[6]Murakami S.Hepatitis B virus X protein:a multifunctional viral regulator[J].J Gastroenterol,2001,36(10):651660.
[7]Birrer RB,Birrer D,Klavins JV.Hepatocellular carcinoma and hepatitis virus[J].Ann Clin Lab Sci,2003,33(1):3954.
[8]Arbuthnot P,Kew M.Hepatitis B virus and hepatocellular carcinoma[J].Int J Exp Pathol,2001,82(2):77100.
[9]Jakubczak JL,Chisari FV,Merlino G.Synergy between transforming growth factor alpha and hepatitis B virus surface antigen in hepatocellular proliferation and carcinogenesis[J].Cancer Res,1997,57(16):36063611.
1济南军区总医院 肝胆外科 (山东 济南 250031)
2武警山东总队淄博市支队卫生队 (山东 淄博 255031)
3山东大学齐鲁医院 普外科 (山东 济南 250012), 百拇医药(姜润德 宗宁 李占元 王占民)