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编号:11028248
补肾生血药促进大鼠缺血后肢血管新生的实验研究
http://www.100md.com 《中国普通现代外科进展》 2006年第3期
     【摘要】目的:探讨补肾生血药对缺血后肢大鼠外周循环中骨髓来源内皮祖细胞(EPC)的影响及缺血组织血管新生的影响。方法:建立大鼠后肢缺血模型,喂食补肾生血药,1周后细胞培养观察外周血EPC数量变化,4周后检测缺血组织微血管密度及血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果:实验组大鼠外周血培养的EPC(89.1±10.3/mm2)明显高于对照组(48.6±7.5/mm2)(P<0.01),缺血组织微血管密度(288.76±12.54)和VEGF表达(0.233±0.014)均高于对照组(224.84±5.87),(0.162±0.018,P<0.05),且外周血EPC数量与微血管密度之间具有显著相关性(P<0.01)。结论:补肾生血药通过动员骨髓EPC的迁移、分化、促进局部的血管新生,达到改善供血目的。

    【关键词】植物药疗法·缺血·四肢·内皮祖细胞·新生血管化,生理性·血管·内皮生长因子

    Effect of Bushenshengxue traditiond medicine on angiogenesis of ischemic hindlimbs in rats

    LIANG Tiancheng1,HUANG Jiaying1,XIANG You1,LIU Yong2,SU Song2

    1Department of Surgery,Luzhou Hospital for Traditional Chinese Medicine(Sichuan

    646000,China)

    2Department of Vascular Surgery,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College

    (Sichuan 646000,China)

    【ABSTRACT】Objective:To explore the effect of limb ischemia on mobilization of bone marrow derivedendothelial pregenitor cells(EPCs) and neovascularization of ischemic tissue with traditional medicine.Methods:Unilateral ischemic model of the hindlimbs was produced by excision of the common and superficial femoral artery in 20 male rats.The other 20 animals served as the control group.At 1 week after operation the changing of the circulating EPCs was observed by mononuclear cells culture.Microvesseldensity,the VEGF expression and angiograph of ischemic limbs was detected at week 4.Results:The number of circulating EPCs in experiment group (89.1±10.3/mm2 VS 48.6±7.5/mm2,P<0.01).Microvessel density of ischemic limbs was significantly higher than that in control group (288.76±12.54/mm2 VS 224.86±5.87/mm2,P<0.01).The VEGF expression in experiment group was significantly higer than that in control group (A:0.233±0.014 VS 0.162±0.0186,P<0.01).The number of circulating EPCs was greatly related to the microvessel density and VEGF expression (P<0.01).Conclusion:Local perfusion of ischemic limb can be augmented by improving neovascularization with EPCs mobilization of bushenshengxue traditional medicine.

    【KEY WORDS】Phytotherapy·Extremities·Endothelial progenitor cells·Neovascularization,physiologic·Blood vessels·Endothelial growth factors 内皮祖细胞(endothelial progenitor cell ,EPC)是一种能定向分化为血管内皮细胞的前体细胞,主要存在于骨髓内,可参与机体在特定条件下的新血管生成,改善缺血组织的血液循环,EPC有望成为缺血性疾病新的治疗靶点。我们建立大鼠后肢缺血模型,应用中药补肾生血方剂,观察其对EPC和促进缺血组织血管新生的作用。

     1 材料和方法

    1.1 药品和试剂 兔抗鼠CD34多克隆抗体,SantCruz公司提供;兔抗鼠VEGF、bFGF多抗,由武汉博士德公司提供;荧光素FITC标记的羊抗兔IgG购自Sigma公司;SABC试剂盒购自武汉博士德公司。补肾生血胶囊:由熟地、枸杞子、龟板胶、当归、山茱萸、黄芪等11味中药组成,由中国中医研究院西苑医院提供,稀释至适量(含生药1.7g/ml)。

    1.1.2 动物 健康成年SD大鼠,由本院实验动物中心提供。

    1.2 方法

    1.2.1 大鼠后肢缺血模型建立 成年健康SD大鼠40只,体重(200±5)g。采用切断、结扎单侧股总、股浅动脉建立肢体缺血模型,继续饲养1周,彩超检查证实缺血模型建立成功,随机分实验组、对照组各20只。实验组每天喂食补肾生血药提取液1ml(含生药1.7g,相当于成人用量1.7g/kg的5倍),对照组予等量蒸馏水,连续喂食20d。

    1.2.2 外周血内皮祖细胞培养及鉴定 喂食1周后,取两组大鼠各10只,无菌条件下心脏采血3ml,抗凝后生理盐水1∶1稀释,沿离心管壁缓慢加在3ml NycoprepTM1.077A动物单核细胞分离液的界面上,密度梯度离心法分离,2000r/min,20min,吸出分离液与血浆之间的单核细胞层,PBS洗涤2次,加含15%胎牛血清的1∶1 DMEMIMDM 培养液混合,制成细胞悬液。将多聚赖氨酸处理后的2.0cm×2.0cm盖玻片置于6孔培养板中,调整细胞浓度为1×106,接种于6孔培养板内,每孔2.5ml。置37℃ 5%CO2孵箱内培养,2d后更换培养液,弃去悬浮细胞,继续再培养2d。①细胞形态学:细胞培养4d后在倒置相差显微镜下观察活细胞的贴壁情况、细胞形态学变化。②细胞免疫化学检测:细胞培养后4d,取出盖玻片,PBS漂洗,95%冷乙醇固定,再次PBS漂洗,分别滴加第一抗体:兔抗鼠CD34多抗(1∶200),湿盒内4℃冰箱过夜。PBS振洗后,加入异硫氰酸标记的二抗 50μl(FITCIgG),湿盒内37℃孵育1h,PBS洗涤后立即荧光显微镜下观察、摄片。阴性对照以PBS代替一抗。

    由2名观察者独立对每块盖坡片上的染色阳性细胞进行记数,随机选取5个视野,换上带有标尺的目镜,200倍视野下观察单位面积内阳性细胞数,取平均值为单位面积EPC细胞数。

    将剩余的大鼠喂食至术后4周,处死,于缺血后肢内侧切取内收肌组织块,放入4%多聚甲醛(pH7.2)中固定24h,石蜡包埋,制成5μm厚组织切片备用。

    1.2.3 微血管密度(MVD)及VEGF检测 依照免疫组化ABC法,一抗分别为兔抗鼠VWF(Ven willebrand factor)因子、兔抗鼠VEGF(1∶100)抗体,二抗为即用型SABC试剂盒,依说明书进行操作。苏木素轻度复染,脱水,透明,树脂封片。阴性对照以PBS代替一抗。

    1.2.4 免疫组化结果判断 以胞浆呈棕黄色染色者为内皮细胞VWF表达阳性,对VWF阳性进行微血管记数。200倍下随机选5个视野,记数微血管数目。以与周围组织明显区别的1个棕黄色染色的内皮细胞或细胞丛为1个微血管,只要结构不相连,其分支结构也可作为1个血管,染色模糊或分辨不清者不记入内,凡管腔大于8个红细胞大小,带有肌层的血管不予记数。2名观察者采用双盲法对同一切片记数,取二者的平均值为该片的MVD。

    胞浆呈棕黄色染色者为VEGF表达阳性,采用美国计算机图像分析系统ImaginePro Plus,每个样本200倍下随机扫描10个视野,取其平均值作为该样本的VEGF的光密度值。

    1.3 统计学分析 采用SPSS统计软件处理数据,计量资料采用x±s表示,组内资料采用t检验,Spearman非参数秩和相关性检验统计分析。

     2 结 果

    2.1 大体观察 所有大鼠均存活,造模10d后二组大鼠缺血后肢端均有毛发脱落、稀疏,毛皮发亮,两组共有5只出现趾端肿胀、坏疽、趾甲缺损脱落,10~14d后均坏疽脱落,创口自愈。

    2.2 EPC体外培养观察 外周血中的单核细胞接种5h后,部分细胞即开始贴壁,2d后贴壁的单核细胞逐渐伸长变型,呈纺锤型,两端有突起伸出,核清晰呈圆形或卵圆形,5d后开始出现细胞分裂。培养4d的贴壁细胞经CD34免疫荧光标记,阳性细胞呈黄绿色强荧光。实验组EPC数目(89.1±10.3/mm2)明显高于对照组(48.6±7.5/mm2)(P<0.01)。见图1、2。

    2.3 组织MVD及VEGF的表达 两组均可见大量新生血管,主要分布在肌间隙内,血管壁被覆1~数个内皮细胞,CD34表达阳性,表现为胞浆呈棕黄色,内充数个红细胞,实验组MVD高于对照组。两组切片可见骨骼肌细胞,内皮细胞内有棕黄色颗粒沉着,棕黄色颗粒呈条带状分布于胞浆内,两组光密度值(OD)差异有统计学意义。外周血EPC与MVD有极显著相关性,见表1,图3。图2 CD34阳性,可见内皮细胞胞浆被染成棕黄色(×200)表1 大鼠外周血EPC、缺血组织MVD及VEGF光密度值图3 VEGF染色阳性,骨骼肌胞浆内可见棕黄色颗粒(×200)

     3 讨 论

    严重肢体缺血性疾病目前尚无确切有效治疗方法,经治疗促进血管新生是挽救缺血肢体的希望所在[1,2]。研究表明,利用血管生长因子或其基因,能明显增加促进缺血部位的侧支循环,改善供血。目前发现,这些血管生长因子的促血管新生作用,实质是动员了骨髓EPC而发挥其生血管效应的。

    EPC是一种能定向分化为血管内皮细胞的前体细胞,在胚胎发育过程中,由造血干细胞分化而来,参与胎儿期的血管发育。最近发现成年个体中也存在EPC,且同样可参与成年机体特定条件下(缺血、创伤、炎症、肿瘤等)的血管新生,通过骨髓EPC的释放入血,再定向迁移到缺血部位,增殖、分化为内皮细胞(EC)直接参与新血管生成。另外,EPC及分化后的EC,还通过旁分泌形式产生多种血管生长因子,进一步促进局部血管新生,改善组织供血。体外培养的EPC与EC形态相似,呈纺锤型贴壁生长,均能表达CD34、CD31、血管内皮生长因子受体1(Flk1)等,但外周血中成熟内皮细胞含量极少(约2~3个/ml),与EPC相差悬殊(约500~1000/ml)[3],故本实验以CD34+细胞来计数EPC基本准确。

    目前证实多种生长因子或药物具有动员EPC作用,如血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒巨细胞集落刺激因子(GMCSF)及他汀类药物等,并可显著促进缺血组织的血管新生,因此,EPC动员可能是重症缺血性疾病极有前途的治疗措施[4,5]。

    传统医学治疗血管生成相关病症有着悠久的历史,中医理论中,“气血相关”、“补气活血”、“行气通脉”等治则与相关方药,均可能具有促血管新生作用。补肾生血方剂是根据中医肾生髓理论,在多年实践基础上总结出来的有效方剂,具有滋阴养肾,填精生血、平衡阴阳、延缓衰老等的功效,近年研究表明该方药能促进骨髓细胞增生[6],增加去卵巢大鼠子宫毛细血管的生成,且局部VEGF、bFGF表达增加[7,8],提示该药有促血管生成效应。我们建立大鼠后肢缺血模型,发现喂食该药大鼠的缺血肢体微血管密度、局部VEGF表达均较对照组明显增加,外周血EPC数量亦显著增高,且二者具有相关性,证实该药经过EPC动员,进而促进缺血肢体的血管新生。因此,推测该方的促血管新生机制,极可能是通过某种激活途经,提高机体血液某种血管生长因子浓度,再动员EPC定向迁移、分化,促进缺血部位的血管新生。但其促血管新生的具体机制,仍有待进一步研究证实。

     参 考 文 献

    [1]Isner JM,Asahara T.Angiogenesis and vasculogenesis as therapeutic strategies for postnatal neovascularization[J].J Clin Invest,1999,103:12311236.

    [2]张易来,张亮,宋惠民,等.CO2促缺血下肢侧支循环建立的实验研究[J].中国现代普通外科进展,2005,8(4):227.

    [3]Shi BQ,Rafii S,Wu MH,et al.Evidence for circulating bone marrowderived endothelial cells[J].Blood,1998,92:362367.

    [4]Asahara T,Takahashi T,Masuda H,et al.VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrowderived endothelial progenitor cells[J].EMBO J,1999,18:39643972.

    [5]Vasa M,Fichtlscherer S,Adler K,et al.Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease[J].Circulation,2001,101:28852890.

    [6]吴志奎,危巍,何忠效,等.肾生髓理论分子基础的研究[J].中医杂志,1996,37(2):109110.

    [7]王蕾,吕鑫霞,吴志奎,等.补肾生血药对金黄地鼠子宫组织bFGF、VEGF表达水平的影响[J].中国中医基础医学杂志,2000,12:795798.

    [8]张树成,吴志奎,王蕾,等.补肾生血和补肾调经方药促血管生成作用实验研究[J].中医杂志,2000,41(6):369370.

    1四川省泸州市中医院 外科 (四川 泸州 646000)

    2泸洲医学院附属医院 血管外科 (四川 泸州 646000), http://www.100md.com(梁天成 黄家应 向友 刘勇 苏松)