HIV-1转录反式激活抑制剂研究为艾滋病治疗拓新路
当前临床使用的艾滋病治疗药物主要有蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂，但这两类药物极易产生耐药性和毒性，所以寻找新的作用机制而不易产生耐药性的药物成为当今抗艾滋病药物研究的热点。近日，由世界首富比尔·盖茨夫妇创立的盖茨基金会捐款2.87亿美元，帮助19个国家的研究人员加快对艾滋病疫苗的研究。这些拨款将于未来5年分到全球16个科学小组手中，以尽快找出破解艾滋病的方法。此外，在日前召开的第16届世界艾滋病大会上，科学家们公布了约4500项研究成果，内容涉及艾滋病疫苗最新研究进展、新疗法的临床测试结果和艾滋病病毒的抗药性研究等。可以说，世界各国科研人员对艾滋病及其防治药物的研究正在如火如荼地开展。
——编者按
在HIV的复制周期中，转录的反式激活起着十分重要的调节作用，是艾滋病药物研究的理想靶点之一。随着分子生物学等相关学科的发展，对反式激活机理的研究已经深入到分子水平，目前基于反式激活过程各个环节为靶点的合理药物设计和药物筛选模型的建立，为抗艾滋病药物研发提供了大量的先导化合物，且部分已进入临床试验，对HIV-1转录反式激活抑制剂的研究将为艾滋病的化学治疗拓展更广阔的领域。
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■HIV-1转录的反式激活
人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)是一种RNA病毒。在转录过程中，没有反式激活因子(Tat)的情况下，整合的病毒DNA转录不完全，只有短的转录体生成。Tat与病毒新生RNA的反式激活应答区(TAR)相互作用，反式激活病毒RNA的转录，使得转录得以持续进行下去，生成完整的RNA。
Tat是含有86~106个氨基酸残基的柔性很强的蛋白质，在HIV-1病毒的转录过程中起着关键的调节作用。Tat的碱性区含有保守序列RKKRRQRRR(49~57)，富含碱性氨基酸，可以特异性地与TARRNA的凸起区相互作用，是Tat与TAR相互作用进行反式激活所必需的。TAR是具有59个碱基的茎环结构，位于所有HIV-1mRNA的5′末端上，凸起区(UCU)是TAR与Tat相互作用的重要功能区。
HIV-1RNA聚合酶Ⅱ从5′长末端引发转录。如果没有Tat蛋白，转录的单延伸过程就有缺陷，只生成短的转录体(包含TAR)。Tat碱性区直接与TAR凸起区的U23及其两端的碱基对A22·U40和G26·C39结合。在Tat与TAR的结合过程中，PTEF-b也起着重要的作用。TAR上、下游茎间角度减小，由游离构象转变为稳定的Tat结合构象。RNA聚合酶Ⅱ通读终止序列(TAR)，转录生成全长的病毒RNA。
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■以Tat为靶点的抑制剂
法国研究人员发现，TDS是根据对Tat测定的NMR结构，利用计算机辅助设计的分子对接设计的抑制剂。TDS与Tat含保守残基(L43-R53)的疏水口袋结合，阻断Tat活性构象的形成。作为计算机辅助设计的化合物，TDS对于寻找更有效的HIV-1转录反式激活抑制剂具有十分重要的意义。
日本研究人员发现，氟喹诺酮类衍生物以非依赖于TAR的方式抑制Tat的功能，代表药物是K-12及其类似物K-37、K-38。在外周血单核细胞(PBMCs)中，K-38抑制HIV-1的半数有效浓度为3.8纳摩尔/升。
EM2487是从链霉素产物中分离得到的小分子化合物，对HIV-1急性和慢性感染细胞都有抑制作用。日本研究人员发现，EM2487对HIV-1的抑制作用部分基于其对Tat功能的选择性抑制。
■以TAR为靶点的抑制剂
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靶向于TAR凸起区的抑制剂 吖啶衍生物CGP40336A的芳杂环堆积在凸起区中，使TAR形成与Tat结合相似的构象，从而抑制Tat-TAR复合物的生成。瑞士研究人员发现，CGP40336A对Tat-TAR复合物的半数竞争剂量为22纳摩尔/升，对HIV-1复制的半数抑制浓度为1.2微摩尔/升。研究人员还对一类二苯呋喃衍生物进行了研究，发现其可以选择性地与TAR凸起区结合而抑制HIV-1的反式激活。其中，化合物DB60抑芓at-TAR相互作用的活性最强。
意大利研究人员对喹诺酮化学库进行随机筛选得到了6-氨基喹诺酮衍生物WM5。尽管WM5的结构与K-12的相似，但作用机制完全不同。WM5通过与TAR凸起区高亲和力结合，从而抑制Tat-TAR复合物的生成而阻断HIV-1复制。
美国研究人员以TAR的凸起区为靶点，先后使用分子对接软件DOCK和ICM从现有化学品目录数据库进行虚拟筛选后发现丙氯拉嗪、氯丙嗪和乙酰丙嗪的活性最强。乙酰丙嗪在100纳摩尔/升可完全抑制Tat-TAR相互作用，是很好的先导化合物。
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北京大学研究人员合成的β-咔啉衍生物由一条碳链连接精氨酸残基和咔啉而成。其作用机制是咔啉与TAR的凸起区结合，精氨酸残基模拟Tat的精氨酸残基与TAR凸起区之间特异性结合。英国研究人员合成了RBT系列化合物，利用NMR和计算方法建模得到其作用机制：RBT550的吲哚部分插入并堆积在TAR的凸起区中而使TAR形成无活性构象，氨基通过静电互作用与TAR的骨架结合，抑制Tat与TAR间的相互作用。RBT550对Tat-TAR复合物的抑制常数为39纳摩尔/升。
靶向于TAR环区的抑制剂 美国研究人员发现，2，4，5，6-四氨基喹唑啉与TAR的环区结合，抑制Tat-TAR相互作用，下调细胞内的反式激活而抑制HIV-1的复制。
同时靶向于凸起区和茎区的抑制剂 加拿大科研人员合成的氨基糖苷-精氨酸共轭物(AACs)与TAR的凸起区和上游茎区相互作用，阻断Tat与TAR的相互作用。AAC类的代表化合物有新霉素B的六精氨酸衍生物(NeoR)、庆大霉素的三精氨酸衍生物(R3G)和卡那霉素A的四精氨酸衍生物(R4K)。在HIV-1感染的PBMCs中，NeoR对HIV-1的半数有效浓度为纳摩尔浓度级别。
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靶向于TAR的反义核酸类 基于TAR序列的反义核酸可以与TAR特异性结合，阻断Tat-TAR复合物的生成。法国研究人员证实，2′-氧-甲基R0624适体的UCCCAGA部分通过与TAR特异性互补的环-环相互作用，生成稳定的复合物。美国研究人员发现，聚酰胺核苷酸类似物(PNA)与TAR的环和凸起区互补结合，阻断Tat-TAR复合物的生成进而抑制HIV-1复制。
靶向于TAR的Tat拟肽类抑制剂 竞争Tat-TAR相互作用的肽或肽模拟物可以阻断HIV-1的复制。此类的第一个肽先导化合物是序列与Tat碱性区类似的ALX40-4C。后来，瑞士研究人员用组合化学的方法筛选得到CGP64222。NMR数据显示，CGP64222和Tat一样，与TAR的凸起区及其两侧的两个碱基对相互作用，使得TAR由自由构象变为与Tat-TAR相似的结合构象，从而抑制Tat-TAR复合物的生成。CGP64222在MT-4细胞中对HIV-1的半数抑制浓度为8.4纳摩尔/升，在125纳摩尔/升未发现细胞毒作用。然而，进一步研究发现，CGP64222在培养细胞中的抗HIV-1活性主要来自于其与CXCR4的选择性相互作用。此外，美国研究人员合成了基于(L)Lys-(D)Lys-(L)Asn序列的环肽，并发现其在人细胞内对反式激活的半数抑制浓度为40纳摩尔/升。
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■以P-TEFb为靶点的抑制剂
美国研究人员发现，黄酮类抗肿瘤药Flavopiridol通过与P-TEFb的CDK9亚单位的ATP结合口袋作用而阻断反式激活。1991年《科学》上发表文章报道苯二氮类化合物(Ro5-3335和Ro24-7429)可在转录的反式激活阶段抑制HIV-1的基因表达。后来有研究显示，其活性可能依赖于P-TEFb的CycT1亚单位。Ro24-7429虽进入了I期临床，但由于高神经毒性已被放弃。
此外，比利时研究合成的抑制剂N-氨基咪唑衍生物(NAIMS)和吡啶氧化物衍生物(JPL-32、JPL-88、JPL-133)，可能通过作用于转录的反式激活过程而抑制HIV-1的复制。
□白如珺 刘新泳, 百拇医药(白如珺；刘新泳)
——编者按
在HIV的复制周期中，转录的反式激活起着十分重要的调节作用，是艾滋病药物研究的理想靶点之一。随着分子生物学等相关学科的发展，对反式激活机理的研究已经深入到分子水平，目前基于反式激活过程各个环节为靶点的合理药物设计和药物筛选模型的建立，为抗艾滋病药物研发提供了大量的先导化合物，且部分已进入临床试验，对HIV-1转录反式激活抑制剂的研究将为艾滋病的化学治疗拓展更广阔的领域。
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■HIV-1转录的反式激活
人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)是一种RNA病毒。在转录过程中，没有反式激活因子(Tat)的情况下，整合的病毒DNA转录不完全，只有短的转录体生成。Tat与病毒新生RNA的反式激活应答区(TAR)相互作用，反式激活病毒RNA的转录，使得转录得以持续进行下去，生成完整的RNA。
Tat是含有86~106个氨基酸残基的柔性很强的蛋白质，在HIV-1病毒的转录过程中起着关键的调节作用。Tat的碱性区含有保守序列RKKRRQRRR(49~57)，富含碱性氨基酸，可以特异性地与TARRNA的凸起区相互作用，是Tat与TAR相互作用进行反式激活所必需的。TAR是具有59个碱基的茎环结构，位于所有HIV-1mRNA的5′末端上，凸起区(UCU)是TAR与Tat相互作用的重要功能区。
HIV-1RNA聚合酶Ⅱ从5′长末端引发转录。如果没有Tat蛋白，转录的单延伸过程就有缺陷，只生成短的转录体(包含TAR)。Tat碱性区直接与TAR凸起区的U23及其两端的碱基对A22·U40和G26·C39结合。在Tat与TAR的结合过程中，PTEF-b也起着重要的作用。TAR上、下游茎间角度减小，由游离构象转变为稳定的Tat结合构象。RNA聚合酶Ⅱ通读终止序列(TAR)，转录生成全长的病毒RNA。
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■以Tat为靶点的抑制剂
法国研究人员发现，TDS是根据对Tat测定的NMR结构，利用计算机辅助设计的分子对接设计的抑制剂。TDS与Tat含保守残基(L43-R53)的疏水口袋结合，阻断Tat活性构象的形成。作为计算机辅助设计的化合物，TDS对于寻找更有效的HIV-1转录反式激活抑制剂具有十分重要的意义。
日本研究人员发现，氟喹诺酮类衍生物以非依赖于TAR的方式抑制Tat的功能，代表药物是K-12及其类似物K-37、K-38。在外周血单核细胞(PBMCs)中，K-38抑制HIV-1的半数有效浓度为3.8纳摩尔/升。
EM2487是从链霉素产物中分离得到的小分子化合物，对HIV-1急性和慢性感染细胞都有抑制作用。日本研究人员发现，EM2487对HIV-1的抑制作用部分基于其对Tat功能的选择性抑制。
■以TAR为靶点的抑制剂
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靶向于TAR凸起区的抑制剂 吖啶衍生物CGP40336A的芳杂环堆积在凸起区中，使TAR形成与Tat结合相似的构象，从而抑制Tat-TAR复合物的生成。瑞士研究人员发现，CGP40336A对Tat-TAR复合物的半数竞争剂量为22纳摩尔/升，对HIV-1复制的半数抑制浓度为1.2微摩尔/升。研究人员还对一类二苯呋喃衍生物进行了研究，发现其可以选择性地与TAR凸起区结合而抑制HIV-1的反式激活。其中，化合物DB60抑芓at-TAR相互作用的活性最强。
意大利研究人员对喹诺酮化学库进行随机筛选得到了6-氨基喹诺酮衍生物WM5。尽管WM5的结构与K-12的相似，但作用机制完全不同。WM5通过与TAR凸起区高亲和力结合，从而抑制Tat-TAR复合物的生成而阻断HIV-1复制。
美国研究人员以TAR的凸起区为靶点，先后使用分子对接软件DOCK和ICM从现有化学品目录数据库进行虚拟筛选后发现丙氯拉嗪、氯丙嗪和乙酰丙嗪的活性最强。乙酰丙嗪在100纳摩尔/升可完全抑制Tat-TAR相互作用，是很好的先导化合物。
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北京大学研究人员合成的β-咔啉衍生物由一条碳链连接精氨酸残基和咔啉而成。其作用机制是咔啉与TAR的凸起区结合，精氨酸残基模拟Tat的精氨酸残基与TAR凸起区之间特异性结合。英国研究人员合成了RBT系列化合物，利用NMR和计算方法建模得到其作用机制：RBT550的吲哚部分插入并堆积在TAR的凸起区中而使TAR形成无活性构象，氨基通过静电互作用与TAR的骨架结合，抑制Tat与TAR间的相互作用。RBT550对Tat-TAR复合物的抑制常数为39纳摩尔/升。
靶向于TAR环区的抑制剂 美国研究人员发现，2，4，5，6-四氨基喹唑啉与TAR的环区结合，抑制Tat-TAR相互作用，下调细胞内的反式激活而抑制HIV-1的复制。
同时靶向于凸起区和茎区的抑制剂 加拿大科研人员合成的氨基糖苷-精氨酸共轭物(AACs)与TAR的凸起区和上游茎区相互作用，阻断Tat与TAR的相互作用。AAC类的代表化合物有新霉素B的六精氨酸衍生物(NeoR)、庆大霉素的三精氨酸衍生物(R3G)和卡那霉素A的四精氨酸衍生物(R4K)。在HIV-1感染的PBMCs中，NeoR对HIV-1的半数有效浓度为纳摩尔浓度级别。
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靶向于TAR的反义核酸类 基于TAR序列的反义核酸可以与TAR特异性结合，阻断Tat-TAR复合物的生成。法国研究人员证实，2′-氧-甲基R0624适体的UCCCAGA部分通过与TAR特异性互补的环-环相互作用，生成稳定的复合物。美国研究人员发现，聚酰胺核苷酸类似物(PNA)与TAR的环和凸起区互补结合，阻断Tat-TAR复合物的生成进而抑制HIV-1复制。
靶向于TAR的Tat拟肽类抑制剂 竞争Tat-TAR相互作用的肽或肽模拟物可以阻断HIV-1的复制。此类的第一个肽先导化合物是序列与Tat碱性区类似的ALX40-4C。后来，瑞士研究人员用组合化学的方法筛选得到CGP64222。NMR数据显示，CGP64222和Tat一样，与TAR的凸起区及其两侧的两个碱基对相互作用，使得TAR由自由构象变为与Tat-TAR相似的结合构象，从而抑制Tat-TAR复合物的生成。CGP64222在MT-4细胞中对HIV-1的半数抑制浓度为8.4纳摩尔/升，在125纳摩尔/升未发现细胞毒作用。然而，进一步研究发现，CGP64222在培养细胞中的抗HIV-1活性主要来自于其与CXCR4的选择性相互作用。此外，美国研究人员合成了基于(L)Lys-(D)Lys-(L)Asn序列的环肽，并发现其在人细胞内对反式激活的半数抑制浓度为40纳摩尔/升。
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■以P-TEFb为靶点的抑制剂
美国研究人员发现，黄酮类抗肿瘤药Flavopiridol通过与P-TEFb的CDK9亚单位的ATP结合口袋作用而阻断反式激活。1991年《科学》上发表文章报道苯二氮类化合物(Ro5-3335和Ro24-7429)可在转录的反式激活阶段抑制HIV-1的基因表达。后来有研究显示，其活性可能依赖于P-TEFb的CycT1亚单位。Ro24-7429虽进入了I期临床，但由于高神经毒性已被放弃。
此外，比利时研究合成的抑制剂N-氨基咪唑衍生物(NAIMS)和吡啶氧化物衍生物(JPL-32、JPL-88、JPL-133)，可能通过作用于转录的反式激活过程而抑制HIV-1的复制。
□白如珺 刘新泳, 百拇医药(白如珺；刘新泳)