基于蛋白A定向固定的Love波免疫传感技术研究
摘要 报道了一种基于蛋白A固定技术的新型Love波免疫传感器，可用于检测B型葡萄球菌肠毒素(SEB)。本传感器由压电石英基片、叉指换能器和SiO2声波导层构成。为提高传感器对SEB分子的响应能力和检测灵敏度，设计了抗体分子的蛋白A定向固定路线，通过APTES和戊二醛层交联蛋白A，随即用100 mmol/L NaBH4还原蛋白A与戊二醛层之间形成的Schiff′s base结构，实现抗体分子在Love波器件表面高效率的定向固定。该固定化方案使传感器的再生能力和检测灵敏度都得到显著提高，对10 mg/L SEB进行连续5次检测后，其响应能力没有明显下降；而对SEB的浓度检出限度达到了10 μg/L。 原子力显微镜对传感器表面形态的成像结果表明，与戊二醛共价交联法相比，蛋白A结合法使抗体分子探针在传感器表面拥有更高的覆盖度和活性，对SEB具有更强的结合能力。
关键词 Love波免疫传感器, B型葡萄球菌肠毒素, 蛋白A
1 引言
Love波传感器是由允许传播水平剪切(SH)极化横波的压电晶体及沉积于其上的声波导层构成的一种声表面波(SAW)压电传感器[1~3]，当用于免疫分析时就成为Love波免疫传感器。典型的Love波免疫传感器件由ST切型压电石英基片、基片表面的叉指换能器(IDT)、沉积于其上的一薄层刚性声波导层以及在声波导层表面通过物理、化学或生物等方法固定的分子探针构成，其对目标的检测是依据质量敏感响应原理来实现的。
由于用来制作Love波器件的压电晶体基频较高，因此,Love波免疫传感器对目标物的检测灵敏度一般高于石英晶体微天平(QCM)。为了能够产生完全SH极化的Love波，需要在石英基片表面平行于X晶轴的方向镀上叉指电极，而SH极化赋予了它能在气、液双相中工作的特性[4]；与其它SAW器件相比，Love波传感器的高灵敏度得益于其声波能量被捕获于声波导层中。只要优化声波导层的各种设计参数，就可以得到最大灵敏度。设计合适的分子探针固定化路线，增加分子探针在器件表面敏感区域的覆盖度以及在最大程度上保持探针分子的活性，这对于免疫传感器的检测水平至关重要。国外报道的常用于Love波免疫传感器SiO2表面的分子探针固定化方法为共价交联法[5]。
设计和制作了Love波传感器件，针对Love波传感器的SiO2表面，通过γ氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)疏水层的建立,设计了蛋白A定向法固定抗体分子，并通过 NaBH4还原Schiff′s base结构以提高传感器再生能力。对比戊二醛交联法，优化出一条Love波免疫传感器的抗体分子探针固定化路线，以B型葡萄球菌肠毒素为检测目标，构建了一种新的B型葡萄球菌肠毒素(SEB)Love波免疫传感器。
2 实验部分
2.1 Love波器件的制作及测试系统的构建
Love波器件，采用20 mm×19 mm×05 mm ST切割(欧拉角：0°，13275°，90°)的石英作为基片，Love波用叉指换能器来激发，由金属铝蒸镀在基片表面，然后通过平面蚀刻的方法制作。发送和接收叉指换能器各有75对指，指厚为300 nm，指宽和指间隙均为10 μm，Love波波长40 μm。考虑到作为Love波声波导层材料，除了希望有较小的体横波速度(小于基片的体横波速度)外，还希望有较小的密度和好的弹性,即弱的声吸收，采用熔融石英以等离子增强化学气相沉积法(PECVD法)制作声波导层，厚度107 μm。液池材料选用耐腐蚀能力极强的聚四氟乙烯，结合敏感区形状并考虑液池加工方便，设计液池为圆环形，圆环内径5 mm，外径6 mm，高5 mm。因此实际敏感区域面积为A＝0196 cm2，液池容积100 μL，用硅橡胶把液池粘接到敏感区域。
本实验基于HP 8752C型网络分析仪构建测试系统，可以直接测量Love波器件的相位等各种参数，其测量结果可视为有效数据。
2.2 实验试剂
γ氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES, Sigma公司)；戊二醛(天津天泰化学品有限公司分装)；蛋白A(Sigma公司)；SEB(军事医学科学院)；SEB兔抗血清(军事医学科学院，效价1∶32，按1∶100用 PBS稀释，pH 72)；牛血清白蛋白(Sigma公司)；GlycineHCl洗脱液(005 mol/L, pH 30)；其它试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。
2.3 抗体分子在传感器表面的固定化
2.3.1 Love波器件表面的清洁和羟基化 用piranha溶液(H2SO4(98%)∶H2O2(30%)=3∶1(V/V)配制)浸泡表面30 min，然后用NH3·H2O∶H2O2∶H2O＝1∶1∶5的溶液浸泡表面2 h，去离子水清洗3次；用HCl∶H2O2∶H2O＝1∶1∶5的溶液浸泡表面2 h，去离子水清洗3次。该过程在清洁表面和液池的同时，使表面羟基化。
2.3.2 蛋白A固定法定向固定抗体 在反应液池中加入100 μL含有5%(V/V)APTES的丙酮溶液，并在室温下保持2 h，用丙酮清洗3次，pH 72的PBS清洗2次，立刻在液池中加入25%戊二醛/PBS溶液(pH 72)，孵育2 h后用pH 59的PBS清洗3次。把025 g/L蛋白A/PBS溶液(pH 59)加入反应池，孵育2 h，用pH 72的PBS清洗3次后加入1%BSA的PBS溶液(pH 72)孵育表面1 h，以封阻表面上的蛋白质非特异性结合位点。新鲜配制01 mol/L的NaBH4溶液，立即吸取50 μL加入液池中，孵育表面1 h后，吸除并用pH 72的PBS清洗5次。把50 μL抗体溶液加入液池并孵育100 min，然后用pH 72的PBS清洗3次。
2.3.3 戊二醛交联法固定抗体 在反应液池中加入100 μL含有5%(V/V)APTES的丙酮溶液，在室温下保持2 h，用丙酮清洗3次，pH 72的PBS清洗2次，立刻在液池中加入25%戊二醛/PBS溶液(pH 72)并孵育2 h，用pH 72的PBS清洗3次。加入50 μL抗体溶液并孵育表面100 min，并用pH 72的PBS清洗3次。之后加入1%BSA的PBS溶液(pH 72)孵育表面1 h，以封阻表面上的蛋白质非特异性结合位点。新鲜配制01 mol/L的NaBH4溶液，立即吸取50 μL加入至液池中，孵育表面1 h后，吸除并用pH 72的PBS清洗5次。
2.4 测量
连接Love波器件与网络分析仪和计算机，构成Love波免疫传感器测试系统。在测试前，使Love波免疫传感器的相位偏移值(Δ)在空气中趋于平衡和保持稳定，在室温条件下,对分别由两种固定化方法(蛋白A定向固定和戊二醛交联)制备的Love波免疫传感器对10 mg/L浓度SEB的响应进行连续重复检测，并分别检测两种免疫传感器对SEB的浓度检出限度，所有检测过程均通过计算机进行实时监测，直到Δ值不再有明显改变，趋于恒定，记录测量过程Δ值的改变。
2.5 SEB的洗脱与传感器的再生
在每次检测完SEB的Love波传感器的液池中加入GlycineHCl洗脱液孵育器件的敏感表面，使被捕获在传感器表面的SEB脱落，洗脱过程用计算机进行实时监测，直到Δ值不再有明显改变，趋于恒定，记录测量过程Δ值的改变。用pH 72的PBS清洗液池和传感器表面3次，之后再重复检测10 mg/L的SEB。
3 结果与讨论
3.1 Love波免疫传感器的响应特性和再生能力
图1 (A)Love波传感器分别对戊二醛法和蛋白A法固定抗体分子探针过程的相位响应和(B)由戊二醛法和蛋白A法制备的传感器各自对10 mg/L SEB的连续、重复检测中，响应达到平衡时的相位偏移值(|Δ|)(略)
Fig.1 Typical phase responses of Love wave sensor to glutaraldehyde immobilization procedure and protein A immobilization procedure(A) and equilibrium phase shift (|Δ|) of Love wave immunosensor prepared via glutaraldehyde method and protein Abased method in continuous repetitive assay of 10 mg/L staphylococcal enterotoxins B(SEB)(B)
1.戊二醛固定法(glutaraldehyde immobilization method); 2.蛋白A固定法(proteinbased immobilization method)。
图1为Love波传感器对抗体分子的固定化过程以及对SEB的检测过程中Δ值随时间的变化曲线。从(A)中可以观察到，对于两种固定化方法，当固定化时间达到100 min时，传感器的Δ值均趋于恒定，不再有明显变化，可认为抗体在传感器表面的结合达到饱和。此时，蛋白A法固定抗体过程的传感器Δ值变化量(4188°)几乎为戊二醛法(2211°)的两倍。这是由于蛋白A对大多数哺乳动物的IgG分子有着天然的亲和力，能和IgG的Fc段特异性结合，而且一个蛋白A分子可以结合两个抗体分子,从而使抗体分子在蛋白A分子层上被高效率的固定。而戊二醛是一种常用的双功能基交联试剂,通过醛基与抗体分子中的赖氨酸残基键合而把抗体固定在传感器表面。一方面，化学结合的本性使反应在常温下进行缓慢;另一方面，由于抗体分子中的赖氨酸残基与表面上的醛基随机结合，结合到表面上的抗体分子会无序排列而增大表面的空间位阻。(B)表示的是两种方法制备的传感器对10 mg/L SEB进行重复检测达到平衡时Δ值的变化量(用|Δ|表示，忽略方向)，在第一个“检测洗脱” 循环中，蛋白A对SEB的响应使Δ值改变量达到5467°，而且直到第五个“检测洗脱”循环，Δ值才略有下降(Δ值改变量为3412°)，但仍对SEB有明显响应。而利用戊二醛交联法制备的Love波免疫传感器在第一个“检测洗脱” 循环中对SEB的响应仅使Δ值改变了2353°，第四次连续检测过程仅使Δ值变化了0241°，此时传感器已基本失去对目标物的响应能力。这表明蛋白 A固定法制备的传感器对目标的响应能力以及再生能力要显著高于戊二醛法制备的传感器。这是由于戊二醛与抗体随机结合的本性使抗体上互补决定区中的部分抗原结合位点也会与基片上修饰的醛基发生共价结合，在使SEB无法接近抗体的同时，还会引起抗体的变形而导致变性，在很大程度上降低了抗体对SEB的亲和能力。相比较而言，蛋白A固定抗体却有几何定向优势,能和IgG的Fc段特异性结合，从而使IgG分子上的F(ab′)2区向空间自由伸展，其上的抗原结合活性位点对SEB的结合活性丝毫不会受到影响，同时一个蛋白A分子可以结合两个抗体分子，在保持抗体活性的基础上提高了抗体在表面的覆盖度，从而提高了传感器对SEB的响应能力。蛋白A与抗体之间的结合虽然非常牢固，但其亲和力对pH值的变化极其敏感，会随着pH值的降低而急剧降低。因此，pH 30的洗脱液可以从表面把抗体抗原复合物洗脱，而对于强酸性环境耐受力极强的蛋白A，在洗脱过程中不会有明显的活性损失，当重新结合了抗体分子后，依然会对SEB保持很强的响应，从而提高了传感器的再生能力。实验证实，使用NaBH4对Schiff′s base共价结构进行还原，可以使蛋白A在表面的结合更加稳定，在反复多次的洗脱过程中不易脱落，有利于提高传感器再生能力。
3.2 Love波免疫传感器对SEB的检测灵敏度
分别测定了由戊二醛法和蛋白A法构建的Love波免疫传感器对SEB的浓度检出限度。图2为两种方法制作的Love波传感器分别对不同浓度SEB的响应过程中Δ值随时间的变化。为便于比较，使纵坐标轴上Δ值的增量保持一致，而检测时间终止于反应趋于平衡(即相移不再有明显变化)时的时间。由图中可以观察出，传感器(A)对10 mg/L浓度SEB的检测进行到82 min时使Δ值下降了2353°(之后Δ值趋于平衡),但无法检测出浓度为01 mg/L的SEB。因此，传感器(A)的浓度检出限度为10 mg/L；传感器(B)检测10 mg/L浓度的SEB时，Δ值下降了5467°，几乎是(A)的25倍，而且(B)对01 mg/L浓度SEB的响应使Δ值下降了2352°，对10 μg/L浓度SEB的响应使Δ值在下降1705°后趋于平衡，表明传感器(B)与10 μg/L浓度的SEB仍保持着良好的响应关系。因此,蛋白A法制备的Love波免疫传感器对SEB的浓度检出限度为10 μg/L，比戊二醛法降低了3个数量级。
图2 戊二醛交联法(A)和蛋白A固定法(B)制备的传感器分别对不同浓度SEB的响应(略)
Fig.2 Response of the Love mode SAW immunosensor with glutaraldehyde immobilization method(A) and protein Abased immobilization method(B) to different SEB concentrations
CSEB(mg/L):1. 2.0; 2. 0.1; 3. 1.0×10-3。
3.3 原子力显微镜对表面形态的表征
图3和图4分别为尺度空间5 μm×5 μm内两种固定化方法固定了抗体后以及结合了SEB后传感器敏感表面的AFM图像。(A)中z轴高度分辨率为100 nm/div。(C)中z轴高度分辨率为220 nm/div。与(A)相比，(C)表面起伏明显增大，这说明蛋白A法使抗体分子探针在传感器表面拥有更高的覆盖度，其中一些突出的起伏点可能是抗体分子发生了凝集；当传感器表面捕获了SEB分子后，(B)、(D)表面起伏明显增大，而且密集程度大幅提高;(B)中z轴分辨率为500 nm/div，(D)中z轴分辨率为1100 nm/div，(D)表面的起伏要大于(B)表面，表明(D)表面比(B)表面结合了更多的物质。表面形貌的明显变化在证明蛋白A法使传感器表面的抗体分子探针具有更高覆盖度的同时，还表现出蛋白A的定向固定使抗体分子对SEB有着更高的亲和力。联系相应的传感器实时监测过程Δ值变化的记录，Love波传感器敏感表面的形貌变化与实验过程相符，可以证明本实验中蛋白A固定抗体的设计路线不仅可行，而且要明显优于传统的戊二醛共价交联法，本实验所研制的Love波免疫传感器对SEB的检测结果合理可靠。
图3 AFM对戊二醛法固定抗体分子探针后(A)和结合10 mg/L SEB后(B)Love波免疫传感器的表面形态成像(略)
Fig.3 Atomic force microscopic(AFM) images (height) of the surface morphology of the device after immobilization of antibodies by glutaraldehyde (A) and binding with 10 mg/L SEB (B)
图4 AFM对蛋白A法固定抗体分子探针后(C)和结合10 mg/L SEB后(D)Love波免疫传感器的表面形态成像(略)
Fig.4 AFM images (height) of the surface morphology of the device after immobilization of antibodies by protein A (C) and binding with 1.0 mg/LSEB (D)
4 结论
合理设计Love波传感器件，构建了基于网络分析仪的Love波传感器测试系统，设计了蛋白A定向固定路线，通过APTES和戊二醛层交联蛋白A，用100 mmol/L NaBH4还原连接蛋白A与表面戊二醛层的Schiff′s base 结构，实现抗体分子在传感器表面高效率的定向固定，与戊二醛法制备的传感器进行了对比，实验结果表明：该传感器对相同浓度SEB(10 mg/L)的响应灵敏度几乎是戊二醛法的25倍(Δ值变化的幅度)，并至少可以连续重复使用5次，其Δ值没有明显的衰减。而对SEB的浓度检出限度为10 μg/L，在Love波器件本身的设计参数和制作方法完全相同的条件下，比戊二醛法的浓度检出限度降低了3个数量级。对两种固定法制备的传感器捕获SEB分子前后的敏感表面进行AFM成像，表面形貌的变化与实验过程相符。从而证明了本文设计的蛋白A定向固定路线能够应用于Love波传感器，不仅提高了抗体分子探针在传感器表面的覆盖度，而且在较高水平上保持了抗体分子的活性，使传感器对SEB的响应能力和浓度检出限度均得到了显著改善，再生能力得到提高。
References
1 Michael J. Ultrasonics, 1998, 36: 7～14
2 KalantarZadeh K, Chen Y Y, Fry B N, Trinchi A, Wlodarski W. Ultrasonics Symposium, 2001 IEEE, 2001: 353~356
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4 Tamarin O， Dejous C, Rebiere D, Pistre J, Comeau S, Moynet D, Bezian J. Sensors and Actuators B, 2003, 91: 275～284
5 Liu Hong(刘 虹), Wang Yuansheng(王源升), Liu Qingshan(刘清山)， Zhu Jinhua (朱金华). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2006， 34(1)： 129～134
( 海军工程大学理学院，武汉 430033)
(军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)
(海军工程大学训练部，武汉 430033)
(中国船舶重工集团公司第七一八研究所，邯郸 056027)
(清华大学精密仪器与机械学系，北京 100084), 百拇医药(刘虹 高志贤 王源升 刘清山 朱惠忠)
关键词 Love波免疫传感器, B型葡萄球菌肠毒素, 蛋白A
1 引言
Love波传感器是由允许传播水平剪切(SH)极化横波的压电晶体及沉积于其上的声波导层构成的一种声表面波(SAW)压电传感器[1~3]，当用于免疫分析时就成为Love波免疫传感器。典型的Love波免疫传感器件由ST切型压电石英基片、基片表面的叉指换能器(IDT)、沉积于其上的一薄层刚性声波导层以及在声波导层表面通过物理、化学或生物等方法固定的分子探针构成，其对目标的检测是依据质量敏感响应原理来实现的。
由于用来制作Love波器件的压电晶体基频较高，因此,Love波免疫传感器对目标物的检测灵敏度一般高于石英晶体微天平(QCM)。为了能够产生完全SH极化的Love波，需要在石英基片表面平行于X晶轴的方向镀上叉指电极，而SH极化赋予了它能在气、液双相中工作的特性[4]；与其它SAW器件相比，Love波传感器的高灵敏度得益于其声波能量被捕获于声波导层中。只要优化声波导层的各种设计参数，就可以得到最大灵敏度。设计合适的分子探针固定化路线，增加分子探针在器件表面敏感区域的覆盖度以及在最大程度上保持探针分子的活性，这对于免疫传感器的检测水平至关重要。国外报道的常用于Love波免疫传感器SiO2表面的分子探针固定化方法为共价交联法[5]。
设计和制作了Love波传感器件，针对Love波传感器的SiO2表面，通过γ氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)疏水层的建立,设计了蛋白A定向法固定抗体分子，并通过 NaBH4还原Schiff′s base结构以提高传感器再生能力。对比戊二醛交联法，优化出一条Love波免疫传感器的抗体分子探针固定化路线，以B型葡萄球菌肠毒素为检测目标，构建了一种新的B型葡萄球菌肠毒素(SEB)Love波免疫传感器。
2 实验部分
2.1 Love波器件的制作及测试系统的构建
Love波器件，采用20 mm×19 mm×05 mm ST切割(欧拉角：0°，13275°，90°)的石英作为基片，Love波用叉指换能器来激发，由金属铝蒸镀在基片表面，然后通过平面蚀刻的方法制作。发送和接收叉指换能器各有75对指，指厚为300 nm，指宽和指间隙均为10 μm，Love波波长40 μm。考虑到作为Love波声波导层材料，除了希望有较小的体横波速度(小于基片的体横波速度)外，还希望有较小的密度和好的弹性,即弱的声吸收，采用熔融石英以等离子增强化学气相沉积法(PECVD法)制作声波导层，厚度107 μm。液池材料选用耐腐蚀能力极强的聚四氟乙烯，结合敏感区形状并考虑液池加工方便，设计液池为圆环形，圆环内径5 mm，外径6 mm，高5 mm。因此实际敏感区域面积为A＝0196 cm2，液池容积100 μL，用硅橡胶把液池粘接到敏感区域。
本实验基于HP 8752C型网络分析仪构建测试系统，可以直接测量Love波器件的相位等各种参数，其测量结果可视为有效数据。
2.2 实验试剂
γ氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES, Sigma公司)；戊二醛(天津天泰化学品有限公司分装)；蛋白A(Sigma公司)；SEB(军事医学科学院)；SEB兔抗血清(军事医学科学院，效价1∶32，按1∶100用 PBS稀释，pH 72)；牛血清白蛋白(Sigma公司)；GlycineHCl洗脱液(005 mol/L, pH 30)；其它试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。
2.3 抗体分子在传感器表面的固定化
2.3.1 Love波器件表面的清洁和羟基化 用piranha溶液(H2SO4(98%)∶H2O2(30%)=3∶1(V/V)配制)浸泡表面30 min，然后用NH3·H2O∶H2O2∶H2O＝1∶1∶5的溶液浸泡表面2 h，去离子水清洗3次；用HCl∶H2O2∶H2O＝1∶1∶5的溶液浸泡表面2 h，去离子水清洗3次。该过程在清洁表面和液池的同时，使表面羟基化。
2.3.2 蛋白A固定法定向固定抗体 在反应液池中加入100 μL含有5%(V/V)APTES的丙酮溶液，并在室温下保持2 h，用丙酮清洗3次，pH 72的PBS清洗2次，立刻在液池中加入25%戊二醛/PBS溶液(pH 72)，孵育2 h后用pH 59的PBS清洗3次。把025 g/L蛋白A/PBS溶液(pH 59)加入反应池，孵育2 h，用pH 72的PBS清洗3次后加入1%BSA的PBS溶液(pH 72)孵育表面1 h，以封阻表面上的蛋白质非特异性结合位点。新鲜配制01 mol/L的NaBH4溶液，立即吸取50 μL加入液池中，孵育表面1 h后，吸除并用pH 72的PBS清洗5次。把50 μL抗体溶液加入液池并孵育100 min，然后用pH 72的PBS清洗3次。
2.3.3 戊二醛交联法固定抗体 在反应液池中加入100 μL含有5%(V/V)APTES的丙酮溶液，在室温下保持2 h，用丙酮清洗3次，pH 72的PBS清洗2次，立刻在液池中加入25%戊二醛/PBS溶液(pH 72)并孵育2 h，用pH 72的PBS清洗3次。加入50 μL抗体溶液并孵育表面100 min，并用pH 72的PBS清洗3次。之后加入1%BSA的PBS溶液(pH 72)孵育表面1 h，以封阻表面上的蛋白质非特异性结合位点。新鲜配制01 mol/L的NaBH4溶液，立即吸取50 μL加入至液池中，孵育表面1 h后，吸除并用pH 72的PBS清洗5次。
2.4 测量
连接Love波器件与网络分析仪和计算机，构成Love波免疫传感器测试系统。在测试前，使Love波免疫传感器的相位偏移值(Δ)在空气中趋于平衡和保持稳定，在室温条件下,对分别由两种固定化方法(蛋白A定向固定和戊二醛交联)制备的Love波免疫传感器对10 mg/L浓度SEB的响应进行连续重复检测，并分别检测两种免疫传感器对SEB的浓度检出限度，所有检测过程均通过计算机进行实时监测，直到Δ值不再有明显改变，趋于恒定，记录测量过程Δ值的改变。
2.5 SEB的洗脱与传感器的再生
在每次检测完SEB的Love波传感器的液池中加入GlycineHCl洗脱液孵育器件的敏感表面，使被捕获在传感器表面的SEB脱落，洗脱过程用计算机进行实时监测，直到Δ值不再有明显改变，趋于恒定，记录测量过程Δ值的改变。用pH 72的PBS清洗液池和传感器表面3次，之后再重复检测10 mg/L的SEB。
3 结果与讨论
3.1 Love波免疫传感器的响应特性和再生能力
图1 (A)Love波传感器分别对戊二醛法和蛋白A法固定抗体分子探针过程的相位响应和(B)由戊二醛法和蛋白A法制备的传感器各自对10 mg/L SEB的连续、重复检测中，响应达到平衡时的相位偏移值(|Δ|)(略)
Fig.1 Typical phase responses of Love wave sensor to glutaraldehyde immobilization procedure and protein A immobilization procedure(A) and equilibrium phase shift (|Δ|) of Love wave immunosensor prepared via glutaraldehyde method and protein Abased method in continuous repetitive assay of 10 mg/L staphylococcal enterotoxins B(SEB)(B)
1.戊二醛固定法(glutaraldehyde immobilization method); 2.蛋白A固定法(proteinbased immobilization method)。
图1为Love波传感器对抗体分子的固定化过程以及对SEB的检测过程中Δ值随时间的变化曲线。从(A)中可以观察到，对于两种固定化方法，当固定化时间达到100 min时，传感器的Δ值均趋于恒定，不再有明显变化，可认为抗体在传感器表面的结合达到饱和。此时，蛋白A法固定抗体过程的传感器Δ值变化量(4188°)几乎为戊二醛法(2211°)的两倍。这是由于蛋白A对大多数哺乳动物的IgG分子有着天然的亲和力，能和IgG的Fc段特异性结合，而且一个蛋白A分子可以结合两个抗体分子,从而使抗体分子在蛋白A分子层上被高效率的固定。而戊二醛是一种常用的双功能基交联试剂,通过醛基与抗体分子中的赖氨酸残基键合而把抗体固定在传感器表面。一方面，化学结合的本性使反应在常温下进行缓慢;另一方面，由于抗体分子中的赖氨酸残基与表面上的醛基随机结合，结合到表面上的抗体分子会无序排列而增大表面的空间位阻。(B)表示的是两种方法制备的传感器对10 mg/L SEB进行重复检测达到平衡时Δ值的变化量(用|Δ|表示，忽略方向)，在第一个“检测洗脱” 循环中，蛋白A对SEB的响应使Δ值改变量达到5467°，而且直到第五个“检测洗脱”循环，Δ值才略有下降(Δ值改变量为3412°)，但仍对SEB有明显响应。而利用戊二醛交联法制备的Love波免疫传感器在第一个“检测洗脱” 循环中对SEB的响应仅使Δ值改变了2353°，第四次连续检测过程仅使Δ值变化了0241°，此时传感器已基本失去对目标物的响应能力。这表明蛋白 A固定法制备的传感器对目标的响应能力以及再生能力要显著高于戊二醛法制备的传感器。这是由于戊二醛与抗体随机结合的本性使抗体上互补决定区中的部分抗原结合位点也会与基片上修饰的醛基发生共价结合，在使SEB无法接近抗体的同时，还会引起抗体的变形而导致变性，在很大程度上降低了抗体对SEB的亲和能力。相比较而言，蛋白A固定抗体却有几何定向优势,能和IgG的Fc段特异性结合，从而使IgG分子上的F(ab′)2区向空间自由伸展，其上的抗原结合活性位点对SEB的结合活性丝毫不会受到影响，同时一个蛋白A分子可以结合两个抗体分子，在保持抗体活性的基础上提高了抗体在表面的覆盖度，从而提高了传感器对SEB的响应能力。蛋白A与抗体之间的结合虽然非常牢固，但其亲和力对pH值的变化极其敏感，会随着pH值的降低而急剧降低。因此，pH 30的洗脱液可以从表面把抗体抗原复合物洗脱，而对于强酸性环境耐受力极强的蛋白A，在洗脱过程中不会有明显的活性损失，当重新结合了抗体分子后，依然会对SEB保持很强的响应，从而提高了传感器的再生能力。实验证实，使用NaBH4对Schiff′s base共价结构进行还原，可以使蛋白A在表面的结合更加稳定，在反复多次的洗脱过程中不易脱落，有利于提高传感器再生能力。
3.2 Love波免疫传感器对SEB的检测灵敏度
分别测定了由戊二醛法和蛋白A法构建的Love波免疫传感器对SEB的浓度检出限度。图2为两种方法制作的Love波传感器分别对不同浓度SEB的响应过程中Δ值随时间的变化。为便于比较，使纵坐标轴上Δ值的增量保持一致，而检测时间终止于反应趋于平衡(即相移不再有明显变化)时的时间。由图中可以观察出，传感器(A)对10 mg/L浓度SEB的检测进行到82 min时使Δ值下降了2353°(之后Δ值趋于平衡),但无法检测出浓度为01 mg/L的SEB。因此，传感器(A)的浓度检出限度为10 mg/L；传感器(B)检测10 mg/L浓度的SEB时，Δ值下降了5467°，几乎是(A)的25倍，而且(B)对01 mg/L浓度SEB的响应使Δ值下降了2352°，对10 μg/L浓度SEB的响应使Δ值在下降1705°后趋于平衡，表明传感器(B)与10 μg/L浓度的SEB仍保持着良好的响应关系。因此,蛋白A法制备的Love波免疫传感器对SEB的浓度检出限度为10 μg/L，比戊二醛法降低了3个数量级。
图2 戊二醛交联法(A)和蛋白A固定法(B)制备的传感器分别对不同浓度SEB的响应(略)
Fig.2 Response of the Love mode SAW immunosensor with glutaraldehyde immobilization method(A) and protein Abased immobilization method(B) to different SEB concentrations
CSEB(mg/L):1. 2.0; 2. 0.1; 3. 1.0×10-3。
3.3 原子力显微镜对表面形态的表征
图3和图4分别为尺度空间5 μm×5 μm内两种固定化方法固定了抗体后以及结合了SEB后传感器敏感表面的AFM图像。(A)中z轴高度分辨率为100 nm/div。(C)中z轴高度分辨率为220 nm/div。与(A)相比，(C)表面起伏明显增大，这说明蛋白A法使抗体分子探针在传感器表面拥有更高的覆盖度，其中一些突出的起伏点可能是抗体分子发生了凝集；当传感器表面捕获了SEB分子后，(B)、(D)表面起伏明显增大，而且密集程度大幅提高;(B)中z轴分辨率为500 nm/div，(D)中z轴分辨率为1100 nm/div，(D)表面的起伏要大于(B)表面，表明(D)表面比(B)表面结合了更多的物质。表面形貌的明显变化在证明蛋白A法使传感器表面的抗体分子探针具有更高覆盖度的同时，还表现出蛋白A的定向固定使抗体分子对SEB有着更高的亲和力。联系相应的传感器实时监测过程Δ值变化的记录，Love波传感器敏感表面的形貌变化与实验过程相符，可以证明本实验中蛋白A固定抗体的设计路线不仅可行，而且要明显优于传统的戊二醛共价交联法，本实验所研制的Love波免疫传感器对SEB的检测结果合理可靠。
图3 AFM对戊二醛法固定抗体分子探针后(A)和结合10 mg/L SEB后(B)Love波免疫传感器的表面形态成像(略)
Fig.3 Atomic force microscopic(AFM) images (height) of the surface morphology of the device after immobilization of antibodies by glutaraldehyde (A) and binding with 10 mg/L SEB (B)
图4 AFM对蛋白A法固定抗体分子探针后(C)和结合10 mg/L SEB后(D)Love波免疫传感器的表面形态成像(略)
Fig.4 AFM images (height) of the surface morphology of the device after immobilization of antibodies by protein A (C) and binding with 1.0 mg/LSEB (D)
4 结论
合理设计Love波传感器件，构建了基于网络分析仪的Love波传感器测试系统，设计了蛋白A定向固定路线，通过APTES和戊二醛层交联蛋白A，用100 mmol/L NaBH4还原连接蛋白A与表面戊二醛层的Schiff′s base 结构，实现抗体分子在传感器表面高效率的定向固定，与戊二醛法制备的传感器进行了对比，实验结果表明：该传感器对相同浓度SEB(10 mg/L)的响应灵敏度几乎是戊二醛法的25倍(Δ值变化的幅度)，并至少可以连续重复使用5次，其Δ值没有明显的衰减。而对SEB的浓度检出限度为10 μg/L，在Love波器件本身的设计参数和制作方法完全相同的条件下，比戊二醛法的浓度检出限度降低了3个数量级。对两种固定法制备的传感器捕获SEB分子前后的敏感表面进行AFM成像，表面形貌的变化与实验过程相符。从而证明了本文设计的蛋白A定向固定路线能够应用于Love波传感器，不仅提高了抗体分子探针在传感器表面的覆盖度，而且在较高水平上保持了抗体分子的活性，使传感器对SEB的响应能力和浓度检出限度均得到了显著改善，再生能力得到提高。
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