微流控芯片电泳多重聚合酶链反应法同时测定多个单碱基多态性位点
摘 要 以微流控芯片电泳为检测平台，建立了多重PCR扩增法同时测定多个单碱基多态性(SNP)位点的方法。先通过PCR扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段；用限制性内切酶消化成短片段，再将酶切反应产物与DNA适配器(adapter)相连；以连接产物为模板，分成两管，分别用n条等位基因特异性引物和一条通用引物进行n重PCR扩增；最后用微流控芯片电泳法分离PCR扩增产物，根据两管扩增产物的芯片电泳图谱中扩增片段的大小判断SNP的类型。以细胞色素P450 2D6(CYP2D6)基因中的5个SNP位点(100C>T、1661G>C、1758G>T、2470T>C和2850C>T)为检测对象，考察了各等位基因特异性引物之间的相互影响和扩增反应的特异性，采用微流控芯片电泳法成功测定了20名健康中国人的CYP2D6基因中5个SNP位点的基因多态性，与聚合酶链反应限制性片段长度多态性法(PCRRFLP)测定结果完全一致。
关键词 微流控芯片电泳，多重聚合酶链反应，DNA适配器，单碱基多态性，药物代谢酶
Microchip Electrophoresis Coupled with Multiplex Polymerase Chain Reaction for Typing Multiple Single Nucleotide Polymorphisms Simultaneously
Wang Weipeng, Ni Kunyi, Zhou Guohua
1Department of Analytical Chemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 210038
2Huadong Research Institute for Medicine and Biotechnics2, Nanjing 210002
Abstract A new method was established for typing multiple single nucleotides polymorphisms(SNPs) by multiplex polymerase chain reaction(PCR) on the platform of microchip electrophoresis. Firstly, a long target containing all SNPs of interest were preamplified to enhance the specificity; secondly, the preamplified deoxyribonucleic acid(DNA) fragments were digested by a restriction endonuclease to form sticky ends; thirdly, the adapter was ligated to either end of the digested fragment; fourthly, taking the adapterligated fragments as templates, an nplex allelespecific amplification was performed by n allelespecific primers and a universal primer in one tube; finally, the allelespecific amplification products were separated by chip electrophoresis and the types of SNPs can be easily obtained by the length of the products. Taking five SNPs of 100C>T, 1661G>C, 1758G>T, 2470T>C and 2850C>T in the cytochrome P4502D6 (CYP2D6) gene as a researching object, the interactions among allelespecific primers and the specificity of 5plex allelespecific amplification were studied. Five SNPs in the CYP2D6 gene in 20 healthy Mainland Chinese were successfully typed by microchip electrophoresis and the results coincide with those obtained by PCRrestriction fragment length polymorphism(PCRRFLP). The established method is accurate and can be used to type multiple SNPs simultaneously. In this method, n+1 primers (n allelespecific primers and a universal primer) were used for an nplex PCR amplification, so that the interactions among allelespecific primers were reduced and the design of primers were simplified. The specificity was increased by both the special design of the adapter structure and the introduction of an artificial mismatch base in the 3′terminal region of allelespecific primer. By coupling microchip electrophoresis with the method for the readout, the cost for the SNP detection is greatly reduced as the small sampling amount and the simplified process of the condition optimization.
Keywords Microchip electrophoresis, multiplex polymerase chain reaction, deoxyribonucleic acid adapter, single nucleotide polymorphism, cytochrome P4502D6
本文系国家自然科学基金资助项目(No.30270368)
1 引 言
以基因序列测定为目的的人类基因组计划完成后进入了利用基因组信息的后基因组时代。在基因水平上阐述人类基因组结构差异与药物敏感性、疾病易感性和对环境适应性的关系研究,已经展开并取得了一些成果。基因组结构差异主要是指单碱基多态性(SNP)，现在已经构建成了人基因组SNP数据库。如何将人类基因组中等位基因的类型用于临床诊断和疾病治疗是目前的研究热点之一。由于SNP的数量庞大，其测定方法的研究引起了广泛的注意。发展了很多SNP测定技术，如DNA测序法，即通过测定核酸序列来确定SNP类型；单碱基延伸法[1]，即用荧光染料标记dNTP或ddNTP，然后测定在SNP位点被掺入的碱基类型；特异性引物延伸法[2]，即将引物的3′ 端设计成与SNP的不同类型互补，通过测定延伸产物有无来判断SNP类型；特异性探针杂交法[3]，即通过测定DNA模板与固定在芯片基板上的探针是否稳定杂交来确定模板上SNP类型；焦测序法[4]，即通过循环加入4种不同的dNTP进行实时测序；DNA探针入侵法[5]，即用结构特异性酶切断与SNP位点碱基互补的探针。将这些方法与质谱仪[6]、芯片[7]、微球阵列检测仪[8]等检测平台结合可以实现多个SNP样品的同时检测，虽然平均每个样品的检测成本很低，但仪器价格相对较高，对测定样品数目有限的实验室来说，采用一种价格适中而且可以进行多重SNP测定的方法将更有意义。本研究以CYP2D6基因中的5个SNP位点(100C>T、1661G>C、1758G>T、2470T>C和2850C>T)为研究对象[9,10]，以微流控芯片电泳法为检测平台，建立了一种基于适配器连接介导的等位基因特异性扩增法(简称ALMASA法)测定多重SNP，由于本法通过n+1条引物进行n重PCR扩增，测定步骤简单，无需复杂的优化过程，测定结果特异性好。
2 方法原理
如图1所示，假设某段基因组DNA上有2个待测SNP位点：SNP1和SNP2，其中SNP1为杂合子，SNP2为野生型纯合子。本方法包括以下几个步骤：(1)预扩增 采用PCR扩增包含这2个SNP位点的长片段；(2)酶切反应 利用限制性内切酶(如MboI)将长片段切成多段两端含有粘性末端的DNA短片段；(3)酶连反应 加入一个由两条链组成的DNA适配器，在连接酶的作用下，DNA适配器与酶切片段连接；(4)等位基因扩增反应 将酶连反应产物分成两管(管W和管M)，在管W中加入野生型特异性引物和通用引物Pu(其序列与图中DNA适配器分叉端的长臂序列相同)；在管M中加入突变型特异性引物和Pu，加入其他PCR扩增试剂后进行PCR扩增；(5)分离检测 采用微流控芯片电泳法对两管中的PCR产物按长度大小进行分离；(6)SNP类型判断 根据电泳图中DNA条带的大小和有无来判断SNP位点的碱基类型。有以下3种情况：凡只在W管中出现特异条带的为野生型纯合子；凡只在M管中出现特异条带的为突变型纯合子；若在两管中同时出现等长度特异条带的即为杂合子。
3 实验部分
3.1 DNA样品
取20名健康受试者的EDTA抗凝全血1 mL，按改进的酚/氯仿抽提法提取DNA，用TE缓冲液(10 mmol/L TrisHCl pH 80，1 mmol/L EDTA)50 μL溶解，并用Gene Spec III型微量基因光谱测定仪(Naka Instruments,Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)测定其纯度和浓度，4 ℃保存。
3.2 引物序列
根据http://www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp2d6.htm，选取CYP2D6基因中的5个SNP位点100C>T、1661G>C、1758G>T、2470T>C和2850C>T进行研究。测定该5个SNP位点的基因型的5对等位基因特异性引物序列分别为：100C(T)，5′CGCTGGGCTGCACGCTtCC(T)3′；1661G(C)，5′GCAGAGGCGCTTCTCCcTG(C)3′；1758G(T)，5′GCCTTCGCCAACCACTgCG(T)3′；2470T(C)，5′TGTCCCCGTCCTCCTGgAT(C)3′；2850C(T)，5′CTTCAATGATGAGAACCaGC(T)3′，其中引物的3′ 端碱基(黑体)正好位于SNP位点，括号内的碱基表示与突变型对应的引物，序列中的小写字母表示人工突变碱基。通用引物Pu：5′CCCCACTTCTTGTTCTCTCAT3′；DNA适配器由两条链：adp1(5′CCCCACTTCTTGTTCTCTCATCAGGCGCATCACTCG3′)和adp3(5′GATCCGAGTGATGCGCTAAG3′)退火而成。 PCR预扩增引物为2D6Fw(5′TGATAGTGGCCATCTTCCTGCT3′)和2D6Rv(5′CTGCACATCCGGATGTAGGATC3′)。所有引物均由上海捷倍思基因技术有限公司合成(PAGE级)。
3.3 PCR预扩增
采用PCR预扩增一段包含5个待测SNP位点的长度为2919 bp的片段。25 μL PCR 反应体系中含有引物2D6Fw 和2D6Rv各06 μmol/L，dNTP 05 mmol/L，MgCl2 30 mmol/L，1×buffer，125 U Taq DNA 聚合酶(TaKaRa Biotechnology(Dalian) Co.,Ltd.)及10~100 ng模板DNA。在PTC225型PCR扩增仪(MJ Research, Inc.,Massachusetts,USA)上进行PCR扩增。热循环参数为：95℃预变性2 min；然后以95℃变性30 s，65℃退火30 s，70℃延伸 3 min，扩增35个循环；最后70℃延伸7 min使反应完全。反应完成后，取反应产物2 μL，使用POWER PAC1000型电泳仪(BioRad Laboratories,Inc.,CA,USA)在15%琼脂糖凝胶上进行电泳(1×TAE 电泳缓冲液，电压100 V，恒压电泳15 min)，GeneGenius凝胶成像系统(SYNGENE,Co.,Ltd.,Cambridge,UK)拍摄电泳图谱。
3.4 酶切与酶连反应
取1 μL PCR预扩增产物作为模板，加入MboI内切酶(TaKaRa Biotechnology(Dalian) Co.,Ltd.)10 U，反应缓冲液(10倍)1 μL，加水至10 μL，在37℃水浴中保温反应2 h。将反应液在70℃保温15 min，使内切酶失活。在酶切液中加入DNA适配器(即adp1和adp3各50 pmol的退火产物)，反应缓冲液(10倍)5 μL，T4 DNA 连接酶(TaKaRa Biotechnology(Dalian) Co.,Ltd.)50 U，加水至50 μL，16℃水浴中保温反应2 h后取出4 ℃保存。
3.5 SNP位点特异性多重PCR扩增
10 μL反应体系中含特异性引物混合物(野生型引物混合物或突变型引物混合物)共20 pmol (每一种引物的量将根据电泳条带强度调节)，通用引物Pu 10 pmol，反应缓冲液(10倍)10 μL，05 U Taq DNA 聚合酶及05 μL酶连产物，其中dNTP和MgCl2 的浓度分别为02和15 mmol/L。热循环条件为：94℃预变性3 min；然后94℃变性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，扩增30个循环；最后72℃延伸7 min 使反应完全。
3.6 微流控芯片电泳
采用SV1210芯片电泳仪(Hitachi Electronics Engineering Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)进行多重PCR扩增产物微流控芯片电泳分离检测，激发光源为红色半导体激光，检测器为冷却CCD，选用iDNA试剂盒，内含分离凝胶缓冲液、荧光染料和DNA内标，按照使用说明进行操作。芯片由PMMA制成，通道长92 mm、宽100 μm、深30 μm，实际分离长度为42 mm，每块芯片上有12条平行通道，可同时完成12个样品的分离检测。点样量为1 μL，温度30℃，600 V电压进样120 s后，在通道两端加350 V和1100 V的电压分离240 s。PCR产物不需经过任何处理即可直接用于测定。
4 结果与讨论
4.1 引物设计与延伸反应的特异性
泳道1代表预扩增产物；泳道2代表GeneRulerTM 100bp DNA ladder plus(MBI Fermentas, USA)(lane 1, the preamplified product; lane 2, GeneRulerTM 100bp deoxyribonucleic acid (DNA) ladder plus)。为同时测定多个SNP的等位基因类型，在管W或管M中同时加入多条等位基因特异性引物和一条通用引物Pu进行多重PCR扩增。通常n重PCR需要n对不同的引物(即2n条引物)，多重PCR扩增的关键就是这n对引物的匹配性要好，而设计相互匹配的引物十分困难；同时随着引物数量的增加，引物之间的相互作用也迅速增强。在ALMASA法中，每个PCR共用一条引物，所以n重PCR只用n+1条引物，这样每个PCR扩增的差异就减少，只要n条等位基因特异性引物的Tm值一致就可以使得各PCR扩增效率一致，而且PCR扩增的特异性也可以得到相应提高。由于SNP位点必须与等位基因特异性引物的3′ 端重叠，故等位基因特异性引物的位置固定，只需通过改变引物长度来调节Tm值，因此本法引物设计十分简单。
SNP检测结果的准确性主要取决于等位基因特异性引物的延伸特异性，即当特异性引物的3′ 端碱基与模板上SNP位点的碱基不互补时就不发生延伸反应，否则就会影响结果的判断。本研究采用以下3种方法提高引物延伸的特异性：(1)选择最佳退火温度 因为PCR扩增中，退火过程决定了引物能否与模板结合，不结合就不发生延伸反应，高温退火虽然特异性高，但扩增效率低。根据5种引物的Tm值选择56 ℃退火。(2)引入人工突变碱基 通常引物3′ 端的一个碱基不足以完全控制引物的延伸[11]，在3′ 端倒数第3个碱基处人为引入一个错配碱基可以提高引物延伸的特异性。本研究采用相同的方法来提高每条特异性引物的延伸特异性。(3)PCR预扩增 预扩增产物的凝胶电泳图如图2所示。人的基因组DNA很长，而且存在重复序列和假基因，这使等位基因特异性引物可能会扩增出多个片段，通过预扩增就可使等位基因特异性引物的扩增限定在预扩增片段范围内，从而提高多重PCR的特异性；本研究预扩增的主要目的是为了提高扩增模板的量，但也相应提高了扩增反应的特异性。
图3为以各等位基因特异性引物分别进行单重SNP测定的芯片电泳图谱，即在管W(或管M)中加入一条等位基因特异性引物和通用Pu进行PCR扩增。图3(A)为野生型特异性引物扩增产物的测定结果;图3(B)为突变型特异性引物扩增产物的测定结果。 峰1、2、3、4和5分别代表SNP位点2850C>T、1758G>T、1661G>C、2470T>C和100C>T。由图可知，每条引物均具有良好的特异性，只出现一个特异性峰。为了测定各峰的DNA长度，在每个样品中加入了长度为50 bp(IS1)和800bp(IS2)的内标DNA片段 ，根据图3(A)和(B)中各峰的相对保留时间，测得峰1、2、3、4和5所对应的DNA长度分别为707(712)、 288(286)、197(194)、536(529)和146(141) bp，其中括弧外为图3(A)的结果，括号内为图3(B)的结果；根据序列，其理论值分别为704、293、196、515和140 bp，因此测定值与理论值一致。
4.2 多重PCR扩增条件的优化
用n条等位基因特异性引物和一条通用引物进行n重PCR扩增，大大减少了引物数量，但由于多重扩增中有多条引物参加反应，多条引物之间可能存在相互作用,并且由于样品中会出现各种SNP类型的组合，使得各PCR的扩增效率可能会发生改变。因此研究各引物之间的相互作用很有必要。图4中的图谱(a)和(b)为不经引物浓度优化而直接将各条野生型或突变型引物等比例混合后扩增的芯片电泳检测结果。
由图可知：虽然引物浓度相同，但扩增效率不同，如图4(a)中引物100C的延伸效率最高(峰5)，引物2470T的延伸效率最低(峰4)；图4(b)中1661C(峰3)和2470C(峰4)的扩增效率相近并且很高，这可能是因为不存在引物100T的竞争；在峰2和峰3之间出现1个长度约为220 bp的小峰(用星号标记)，但强度较小，这表明多重SNP测定时，各引物之间存在不同程度的相互作用。由于芯片电泳可以测定杂质峰的长度，所以即使有一些杂质峰也不会影响基因型的正确判断。比较图4(a)和(b)，并根据测得的DNA片段长度可以知道所测样品的基因型除1661G>C(峰3)和2470T>C(峰4)位点为杂合子外，其它位点均为野生型纯合子。
根据图4(a)中各峰的相对强度，调整各引物的浓度比，即降低引物100C的浓度，增加引物2850C、1758G、1661G和2470T的浓度，结果见图4(c)。由图可知：各峰强度接近，通过比较图谱c和d很容易得到正确的基因型。引物浓度优化虽然可以得到好的图谱，但须多一步实验。芯片电泳分离能力强，而且可以同时测出片段长度，由图4(a)和(b)的结果可知，不进行引物浓度优化，也完全可以得到各SNP的正确基因型。因此采用芯片电泳进行分离检测，可以使优化步骤简化。
4.3 样品检测
采用本方法测定了20个健康中国人CYP2D6基因中的5个SNP位点，即100C>T、1661G>C、1758G>T、2470T>C和2850C>T，其突变型等位基因频率分别为：675%、300%、250%、300%和125%。其中4个图谱A和B分别表示各样本的野生型和突变型测定结果；各峰表示同图4(electrophoretograms A and B were from the wildtypespecific and mutantspecific amplicons, respectively. the assignment of all peaks is same as Figure 4)。典型样本的测定结果如图5所示。通过比较同一样本在图谱A(wildtype)和图谱B(mutant)中的出峰情况，可以快速判断等位基因的类型。例如对样品s1来说，在图谱A中，除峰3外其余4个位点均出峰；在图谱B中，仅出现峰2和峰3，所以位点1758G>T为杂合子GT；位点1661G>C为突变型纯合子CC；位点2850C>T、2470T>C和100C>T的基因型分别为野生型纯合子CC、TT和CC。又如对样品s3来说，在图谱A中，仅出现峰1和峰2；在图谱B中，所有5个峰均出现，所以位点2850C>T和1758G>T为杂合子CT和GT；其余3个位点为突变型纯合子。同理，可以测定出样品s2和s4中各SNP位点的等位基因类型。为了进一步验证方法的准确性，同时采用PCRRFLP法进行了平行测定，两者结果一致。
4.4 小结
本研究建立了基于DNA适配器连接的多重PCR扩增法，并用于5重SNP的快速测定。由于采用n+1条引物进行n重PCR扩增，极大减少了多重PCR扩增中出现的引物相互作用和引物难于设计的问题。本法无需复杂的引物设计过程；通过采用预扩增和引入人工错配碱基于等位基因特异性引物的3′ 端等多种措施，ALMASA法具有很好的特异性；虽然本法采用了PCR预扩增、酶切酶连等多步反应，但这些步骤均可以批量操作，主要由仪器自动完成，并且一次可以同时测定多个SNP，所以平均每个SNP所用人力并不多；此外，采用芯片电泳为检测平台，具有样品用量少，分辨率高，分析速度快和自动化程度高等优点，在多重SNP测定中无需对各引物浓度进行优化就可以得到准确结果；由于电泳芯片可以重复使用，使得检测成本大大下降，易于推广使用。
References
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11 Wu Xiaoyong(伍小勇)， Zhang Xiaodan(张晓丹)， Gu Zhuoliang(古卓良)， Zhou Guohua(周国华). Chinese Journal of Medical Genetics(中华医学遗传学杂志)， 2004， 21(1)： 86~88
1中国药科大学分析化学教研室， 南京 210038
2华东医学生物技术研究所，南京 210002, 百拇医药(汪维鹏 倪坤仪 周国华)
关键词 微流控芯片电泳，多重聚合酶链反应，DNA适配器，单碱基多态性，药物代谢酶
Microchip Electrophoresis Coupled with Multiplex Polymerase Chain Reaction for Typing Multiple Single Nucleotide Polymorphisms Simultaneously
Wang Weipeng, Ni Kunyi, Zhou Guohua
1Department of Analytical Chemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 210038
2Huadong Research Institute for Medicine and Biotechnics2, Nanjing 210002
Abstract A new method was established for typing multiple single nucleotides polymorphisms(SNPs) by multiplex polymerase chain reaction(PCR) on the platform of microchip electrophoresis. Firstly, a long target containing all SNPs of interest were preamplified to enhance the specificity; secondly, the preamplified deoxyribonucleic acid(DNA) fragments were digested by a restriction endonuclease to form sticky ends; thirdly, the adapter was ligated to either end of the digested fragment; fourthly, taking the adapterligated fragments as templates, an nplex allelespecific amplification was performed by n allelespecific primers and a universal primer in one tube; finally, the allelespecific amplification products were separated by chip electrophoresis and the types of SNPs can be easily obtained by the length of the products. Taking five SNPs of 100C>T, 1661G>C, 1758G>T, 2470T>C and 2850C>T in the cytochrome P4502D6 (CYP2D6) gene as a researching object, the interactions among allelespecific primers and the specificity of 5plex allelespecific amplification were studied. Five SNPs in the CYP2D6 gene in 20 healthy Mainland Chinese were successfully typed by microchip electrophoresis and the results coincide with those obtained by PCRrestriction fragment length polymorphism(PCRRFLP). The established method is accurate and can be used to type multiple SNPs simultaneously. In this method, n+1 primers (n allelespecific primers and a universal primer) were used for an nplex PCR amplification, so that the interactions among allelespecific primers were reduced and the design of primers were simplified. The specificity was increased by both the special design of the adapter structure and the introduction of an artificial mismatch base in the 3′terminal region of allelespecific primer. By coupling microchip electrophoresis with the method for the readout, the cost for the SNP detection is greatly reduced as the small sampling amount and the simplified process of the condition optimization.
Keywords Microchip electrophoresis, multiplex polymerase chain reaction, deoxyribonucleic acid adapter, single nucleotide polymorphism, cytochrome P4502D6
本文系国家自然科学基金资助项目(No.30270368)
1 引 言
以基因序列测定为目的的人类基因组计划完成后进入了利用基因组信息的后基因组时代。在基因水平上阐述人类基因组结构差异与药物敏感性、疾病易感性和对环境适应性的关系研究,已经展开并取得了一些成果。基因组结构差异主要是指单碱基多态性(SNP)，现在已经构建成了人基因组SNP数据库。如何将人类基因组中等位基因的类型用于临床诊断和疾病治疗是目前的研究热点之一。由于SNP的数量庞大，其测定方法的研究引起了广泛的注意。发展了很多SNP测定技术，如DNA测序法，即通过测定核酸序列来确定SNP类型；单碱基延伸法[1]，即用荧光染料标记dNTP或ddNTP，然后测定在SNP位点被掺入的碱基类型；特异性引物延伸法[2]，即将引物的3′ 端设计成与SNP的不同类型互补，通过测定延伸产物有无来判断SNP类型；特异性探针杂交法[3]，即通过测定DNA模板与固定在芯片基板上的探针是否稳定杂交来确定模板上SNP类型；焦测序法[4]，即通过循环加入4种不同的dNTP进行实时测序；DNA探针入侵法[5]，即用结构特异性酶切断与SNP位点碱基互补的探针。将这些方法与质谱仪[6]、芯片[7]、微球阵列检测仪[8]等检测平台结合可以实现多个SNP样品的同时检测，虽然平均每个样品的检测成本很低，但仪器价格相对较高，对测定样品数目有限的实验室来说，采用一种价格适中而且可以进行多重SNP测定的方法将更有意义。本研究以CYP2D6基因中的5个SNP位点(100C>T、1661G>C、1758G>T、2470T>C和2850C>T)为研究对象[9,10]，以微流控芯片电泳法为检测平台，建立了一种基于适配器连接介导的等位基因特异性扩增法(简称ALMASA法)测定多重SNP，由于本法通过n+1条引物进行n重PCR扩增，测定步骤简单，无需复杂的优化过程，测定结果特异性好。
2 方法原理
如图1所示，假设某段基因组DNA上有2个待测SNP位点：SNP1和SNP2，其中SNP1为杂合子，SNP2为野生型纯合子。本方法包括以下几个步骤：(1)预扩增 采用PCR扩增包含这2个SNP位点的长片段；(2)酶切反应 利用限制性内切酶(如MboI)将长片段切成多段两端含有粘性末端的DNA短片段；(3)酶连反应 加入一个由两条链组成的DNA适配器，在连接酶的作用下，DNA适配器与酶切片段连接；(4)等位基因扩增反应 将酶连反应产物分成两管(管W和管M)，在管W中加入野生型特异性引物和通用引物Pu(其序列与图中DNA适配器分叉端的长臂序列相同)；在管M中加入突变型特异性引物和Pu，加入其他PCR扩增试剂后进行PCR扩增；(5)分离检测 采用微流控芯片电泳法对两管中的PCR产物按长度大小进行分离；(6)SNP类型判断 根据电泳图中DNA条带的大小和有无来判断SNP位点的碱基类型。有以下3种情况：凡只在W管中出现特异条带的为野生型纯合子；凡只在M管中出现特异条带的为突变型纯合子；若在两管中同时出现等长度特异条带的即为杂合子。
3 实验部分
3.1 DNA样品
取20名健康受试者的EDTA抗凝全血1 mL，按改进的酚/氯仿抽提法提取DNA，用TE缓冲液(10 mmol/L TrisHCl pH 80，1 mmol/L EDTA)50 μL溶解，并用Gene Spec III型微量基因光谱测定仪(Naka Instruments,Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)测定其纯度和浓度，4 ℃保存。
3.2 引物序列
根据http://www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp2d6.htm，选取CYP2D6基因中的5个SNP位点100C>T、1661G>C、1758G>T、2470T>C和2850C>T进行研究。测定该5个SNP位点的基因型的5对等位基因特异性引物序列分别为：100C(T)，5′CGCTGGGCTGCACGCTtCC(T)3′；1661G(C)，5′GCAGAGGCGCTTCTCCcTG(C)3′；1758G(T)，5′GCCTTCGCCAACCACTgCG(T)3′；2470T(C)，5′TGTCCCCGTCCTCCTGgAT(C)3′；2850C(T)，5′CTTCAATGATGAGAACCaGC(T)3′，其中引物的3′ 端碱基(黑体)正好位于SNP位点，括号内的碱基表示与突变型对应的引物，序列中的小写字母表示人工突变碱基。通用引物Pu：5′CCCCACTTCTTGTTCTCTCAT3′；DNA适配器由两条链：adp1(5′CCCCACTTCTTGTTCTCTCATCAGGCGCATCACTCG3′)和adp3(5′GATCCGAGTGATGCGCTAAG3′)退火而成。 PCR预扩增引物为2D6Fw(5′TGATAGTGGCCATCTTCCTGCT3′)和2D6Rv(5′CTGCACATCCGGATGTAGGATC3′)。所有引物均由上海捷倍思基因技术有限公司合成(PAGE级)。
3.3 PCR预扩增
采用PCR预扩增一段包含5个待测SNP位点的长度为2919 bp的片段。25 μL PCR 反应体系中含有引物2D6Fw 和2D6Rv各06 μmol/L，dNTP 05 mmol/L，MgCl2 30 mmol/L，1×buffer，125 U Taq DNA 聚合酶(TaKaRa Biotechnology(Dalian) Co.,Ltd.)及10~100 ng模板DNA。在PTC225型PCR扩增仪(MJ Research, Inc.,Massachusetts,USA)上进行PCR扩增。热循环参数为：95℃预变性2 min；然后以95℃变性30 s，65℃退火30 s，70℃延伸 3 min，扩增35个循环；最后70℃延伸7 min使反应完全。反应完成后，取反应产物2 μL，使用POWER PAC1000型电泳仪(BioRad Laboratories,Inc.,CA,USA)在15%琼脂糖凝胶上进行电泳(1×TAE 电泳缓冲液，电压100 V，恒压电泳15 min)，GeneGenius凝胶成像系统(SYNGENE,Co.,Ltd.,Cambridge,UK)拍摄电泳图谱。
3.4 酶切与酶连反应
取1 μL PCR预扩增产物作为模板，加入MboI内切酶(TaKaRa Biotechnology(Dalian) Co.,Ltd.)10 U，反应缓冲液(10倍)1 μL，加水至10 μL，在37℃水浴中保温反应2 h。将反应液在70℃保温15 min，使内切酶失活。在酶切液中加入DNA适配器(即adp1和adp3各50 pmol的退火产物)，反应缓冲液(10倍)5 μL，T4 DNA 连接酶(TaKaRa Biotechnology(Dalian) Co.,Ltd.)50 U，加水至50 μL，16℃水浴中保温反应2 h后取出4 ℃保存。
3.5 SNP位点特异性多重PCR扩增
10 μL反应体系中含特异性引物混合物(野生型引物混合物或突变型引物混合物)共20 pmol (每一种引物的量将根据电泳条带强度调节)，通用引物Pu 10 pmol，反应缓冲液(10倍)10 μL，05 U Taq DNA 聚合酶及05 μL酶连产物，其中dNTP和MgCl2 的浓度分别为02和15 mmol/L。热循环条件为：94℃预变性3 min；然后94℃变性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，扩增30个循环；最后72℃延伸7 min 使反应完全。
3.6 微流控芯片电泳
采用SV1210芯片电泳仪(Hitachi Electronics Engineering Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)进行多重PCR扩增产物微流控芯片电泳分离检测，激发光源为红色半导体激光，检测器为冷却CCD，选用iDNA试剂盒，内含分离凝胶缓冲液、荧光染料和DNA内标，按照使用说明进行操作。芯片由PMMA制成，通道长92 mm、宽100 μm、深30 μm，实际分离长度为42 mm，每块芯片上有12条平行通道，可同时完成12个样品的分离检测。点样量为1 μL，温度30℃，600 V电压进样120 s后，在通道两端加350 V和1100 V的电压分离240 s。PCR产物不需经过任何处理即可直接用于测定。
4 结果与讨论
4.1 引物设计与延伸反应的特异性
泳道1代表预扩增产物；泳道2代表GeneRulerTM 100bp DNA ladder plus(MBI Fermentas, USA)(lane 1, the preamplified product; lane 2, GeneRulerTM 100bp deoxyribonucleic acid (DNA) ladder plus)。为同时测定多个SNP的等位基因类型，在管W或管M中同时加入多条等位基因特异性引物和一条通用引物Pu进行多重PCR扩增。通常n重PCR需要n对不同的引物(即2n条引物)，多重PCR扩增的关键就是这n对引物的匹配性要好，而设计相互匹配的引物十分困难；同时随着引物数量的增加，引物之间的相互作用也迅速增强。在ALMASA法中，每个PCR共用一条引物，所以n重PCR只用n+1条引物，这样每个PCR扩增的差异就减少，只要n条等位基因特异性引物的Tm值一致就可以使得各PCR扩增效率一致，而且PCR扩增的特异性也可以得到相应提高。由于SNP位点必须与等位基因特异性引物的3′ 端重叠，故等位基因特异性引物的位置固定，只需通过改变引物长度来调节Tm值，因此本法引物设计十分简单。
SNP检测结果的准确性主要取决于等位基因特异性引物的延伸特异性，即当特异性引物的3′ 端碱基与模板上SNP位点的碱基不互补时就不发生延伸反应，否则就会影响结果的判断。本研究采用以下3种方法提高引物延伸的特异性：(1)选择最佳退火温度 因为PCR扩增中，退火过程决定了引物能否与模板结合，不结合就不发生延伸反应，高温退火虽然特异性高，但扩增效率低。根据5种引物的Tm值选择56 ℃退火。(2)引入人工突变碱基 通常引物3′ 端的一个碱基不足以完全控制引物的延伸[11]，在3′ 端倒数第3个碱基处人为引入一个错配碱基可以提高引物延伸的特异性。本研究采用相同的方法来提高每条特异性引物的延伸特异性。(3)PCR预扩增 预扩增产物的凝胶电泳图如图2所示。人的基因组DNA很长，而且存在重复序列和假基因，这使等位基因特异性引物可能会扩增出多个片段，通过预扩增就可使等位基因特异性引物的扩增限定在预扩增片段范围内，从而提高多重PCR的特异性；本研究预扩增的主要目的是为了提高扩增模板的量，但也相应提高了扩增反应的特异性。
图3为以各等位基因特异性引物分别进行单重SNP测定的芯片电泳图谱，即在管W(或管M)中加入一条等位基因特异性引物和通用Pu进行PCR扩增。图3(A)为野生型特异性引物扩增产物的测定结果;图3(B)为突变型特异性引物扩增产物的测定结果。 峰1、2、3、4和5分别代表SNP位点2850C>T、1758G>T、1661G>C、2470T>C和100C>T。由图可知，每条引物均具有良好的特异性，只出现一个特异性峰。为了测定各峰的DNA长度，在每个样品中加入了长度为50 bp(IS1)和800bp(IS2)的内标DNA片段 ，根据图3(A)和(B)中各峰的相对保留时间，测得峰1、2、3、4和5所对应的DNA长度分别为707(712)、 288(286)、197(194)、536(529)和146(141) bp，其中括弧外为图3(A)的结果，括号内为图3(B)的结果；根据序列，其理论值分别为704、293、196、515和140 bp，因此测定值与理论值一致。
4.2 多重PCR扩增条件的优化
用n条等位基因特异性引物和一条通用引物进行n重PCR扩增，大大减少了引物数量，但由于多重扩增中有多条引物参加反应，多条引物之间可能存在相互作用,并且由于样品中会出现各种SNP类型的组合，使得各PCR的扩增效率可能会发生改变。因此研究各引物之间的相互作用很有必要。图4中的图谱(a)和(b)为不经引物浓度优化而直接将各条野生型或突变型引物等比例混合后扩增的芯片电泳检测结果。
由图可知：虽然引物浓度相同，但扩增效率不同，如图4(a)中引物100C的延伸效率最高(峰5)，引物2470T的延伸效率最低(峰4)；图4(b)中1661C(峰3)和2470C(峰4)的扩增效率相近并且很高，这可能是因为不存在引物100T的竞争；在峰2和峰3之间出现1个长度约为220 bp的小峰(用星号标记)，但强度较小，这表明多重SNP测定时，各引物之间存在不同程度的相互作用。由于芯片电泳可以测定杂质峰的长度，所以即使有一些杂质峰也不会影响基因型的正确判断。比较图4(a)和(b)，并根据测得的DNA片段长度可以知道所测样品的基因型除1661G>C(峰3)和2470T>C(峰4)位点为杂合子外，其它位点均为野生型纯合子。
根据图4(a)中各峰的相对强度，调整各引物的浓度比，即降低引物100C的浓度，增加引物2850C、1758G、1661G和2470T的浓度，结果见图4(c)。由图可知：各峰强度接近，通过比较图谱c和d很容易得到正确的基因型。引物浓度优化虽然可以得到好的图谱，但须多一步实验。芯片电泳分离能力强，而且可以同时测出片段长度，由图4(a)和(b)的结果可知，不进行引物浓度优化，也完全可以得到各SNP的正确基因型。因此采用芯片电泳进行分离检测，可以使优化步骤简化。
4.3 样品检测
采用本方法测定了20个健康中国人CYP2D6基因中的5个SNP位点，即100C>T、1661G>C、1758G>T、2470T>C和2850C>T，其突变型等位基因频率分别为：675%、300%、250%、300%和125%。其中4个图谱A和B分别表示各样本的野生型和突变型测定结果；各峰表示同图4(electrophoretograms A and B were from the wildtypespecific and mutantspecific amplicons, respectively. the assignment of all peaks is same as Figure 4)。典型样本的测定结果如图5所示。通过比较同一样本在图谱A(wildtype)和图谱B(mutant)中的出峰情况，可以快速判断等位基因的类型。例如对样品s1来说，在图谱A中，除峰3外其余4个位点均出峰；在图谱B中，仅出现峰2和峰3，所以位点1758G>T为杂合子GT；位点1661G>C为突变型纯合子CC；位点2850C>T、2470T>C和100C>T的基因型分别为野生型纯合子CC、TT和CC。又如对样品s3来说，在图谱A中，仅出现峰1和峰2；在图谱B中，所有5个峰均出现，所以位点2850C>T和1758G>T为杂合子CT和GT；其余3个位点为突变型纯合子。同理，可以测定出样品s2和s4中各SNP位点的等位基因类型。为了进一步验证方法的准确性，同时采用PCRRFLP法进行了平行测定，两者结果一致。
4.4 小结
本研究建立了基于DNA适配器连接的多重PCR扩增法，并用于5重SNP的快速测定。由于采用n+1条引物进行n重PCR扩增，极大减少了多重PCR扩增中出现的引物相互作用和引物难于设计的问题。本法无需复杂的引物设计过程；通过采用预扩增和引入人工错配碱基于等位基因特异性引物的3′ 端等多种措施，ALMASA法具有很好的特异性；虽然本法采用了PCR预扩增、酶切酶连等多步反应，但这些步骤均可以批量操作，主要由仪器自动完成，并且一次可以同时测定多个SNP，所以平均每个SNP所用人力并不多；此外，采用芯片电泳为检测平台，具有样品用量少，分辨率高，分析速度快和自动化程度高等优点，在多重SNP测定中无需对各引物浓度进行优化就可以得到准确结果；由于电泳芯片可以重复使用，使得检测成本大大下降，易于推广使用。
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