大鼠主动脉平滑肌细胞[Ca2+]i测定

http://www.100md.com 2006年12月7日

1.材料

1.1 动物  Wistar大鼠

1.2药品与试剂　Fura-2/AM、EGTA、Fura-2/AM、维拉帕米、NA均为Sigma公司产品；胰蛋白酶购自上海华美生物公司；DMEM为美国Gibco-BRL公司产品；⁴⁵CaCl₂为中科院原子能研究所提供；小牛血清由上海第二医科大学科技实验中心提供；Hank’s液的成分是(mmo;/L)：NaCl　137.0，KCl　5.0，CaCl₂  1.25，MgSO₄·7H₂O  0.8，Na₂HPO₄　0.6，KH₂PO₄　0.4，NaHCO₃　3.0，Glucose　5.6，PH　7.35~7.45。

1.3 仪器　荧光分光光度计；控温振荡器；倒置显微镜；CO₂培养箱。

2.方法

2.1　大鼠主动脉平滑肌细胞的培养　原代培养参考夏人仪等采用的组织块贴壁法，培养液为含20%小牛血清的DMEM培养液。将大鼠击昏后放血处死，在无菌条件下取出胸主动脉，用Hank’s液冲洗2～3次去除血污，剪除外膜结缔组织，纵行切开血管，并用棉签轻轻擦除内膜，剪成1～2mm³的均一组织块，接种于培养瓶底部。加入培养液，置于37℃，95%O₂+5%CO₂培养箱中，使瓶底朝上，3～4h后轻轻翻转培养瓶，使组织块浸泡在培养液中静止培养。每隔3d换液1次，约经15～20d后可在倒置显微镜下观察到细胞生长繁殖连成片状，待成单层生长呈典型“峰”、“谷”样时即可取细胞用于实验^[7-8]。

2.2　血管平滑肌细胞悬液的制备　待培养瓶内的细胞呈单层状生长后，弃去培养液，加入0.06%胰蛋白酶消化液，当在倒置显微镜下看见细胞回缩间隙出现时，即倒去消化液，加入DMEM培养液终止消化，并用吸管轻轻吹打使之分散成单个细胞，再以1000r/min的速度离心5min，然后用含20%小牛血清的Hank’s液使细胞悬浮混匀，并调整细胞数为10⁹个/L。最后用台盼兰染色，细胞的存活率达90%以上，即可用于Fura-2/AM负载^[7]。

2.3　Fura-2/AM在血管平滑肌细胞的负载　将上述细胞悬液置于控温振荡器中，加入Fura-2/AM3umol/L，振荡45min，使Fura-2/AM进入细胞，然后取出冷却。用离心法除去上清液中的Fura-2/AM，再按同法用20%小牛血清Hank’s液充分冲洗2次后，重新用Hank’s液悬浮并稀释细胞数为10⁹个/L待用^[7]。

2.4　荧光测定及血管平滑肌内[Ca²⁺]i的计算^[9]　采用荧光分光光度计测定荧光强度的变化。激发波长为340～380nm，发射波长为480～500nm，发射光栅为5nm和10nm。测定温度37℃。先用300～400nm激发波长扫描观察负载情况，然后观察细胞静息状态和药物存在时的荧光强度。按下式计算[Ca²⁺]i：[Ca²⁺]i ＝Kd×(F-F_min)/(F_max-F)×(SF/Sb₂)式中Kd为224nmol/L，F是实验观察到的荧光比值(F340/380nm)，F_max为加入0.1%Tritonx-100时细胞悬液的荧光比值，F_min为加入5mmol/LEGTA后测得的荧光比值，SF/Sb₂为Fura-2/AM在无Ca²⁺及有Ca²⁺结合达饱和状态下，在380nm处的荧光强度。

, http://www.100md.com(滕刚)

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